7.pred

Question 1

pokrivenost genomske banke

Answer 1

odnos ukupne količine klonirane DNA (pb) sadržane u banci gena i veličine cjelokupnog genoma (pb) određenog organizma

Question 2

broj klonova koji genomska banka treba sadržavati da bi u njoj s određenom vjerojatnošću bili zastupljeni svi dijelovi genoma

Answer 2

n=ln(1-P)/ln1-F)
F-prosječan udio genoma u jednom klonu
F=(prosječna duljina inserta u vektoru)/(duljina genom)

Question 3

pokrivenost kako se računa?

Answer 3

N*F

Question 4

čemu služe benke gena?

Answer 4

-da ih možemo pretraživati, naći određenu sekvencu, gen, dio gena
-često izrađujemo banku gena prije sekvencioniranja
-kod izrade meta genoma, organizme koje ne možemo uzgojiti, ali možemo izolirati DNA i spremiti u banku gena, pa možemo pretraživati tu banku gena i onda u nekom uzorku zaključiti da se najvj nalazi ta bakterija

Question 5

subkloniranje

Answer 5

prekloniravanje inserata u drugi pogodni vektor

Question 6

pretraživanje banke gena strategije

Answer 6

1.komplementacija mutacije
2.umnažanje željene DNA PCR-om
3.imunološka detekcija
4.hibridizacijske metode

Question 7

pretraživanje komplementacijom

Answer 7

–kloniranje gena LEU2 kvasca S.cerevisiae potrebnog za biosintezu leucina
-genom kvasca pocijepan sa HindIII i BamHI

Question 8

degenerirani primeri kod pretraživanja banke gena pomoću PCRa

Answer 8

dodamo jedan odnosno drugi primer, ali to nisu identične molekule nego su oni mješavina primera, jedan će imati ATC, a drigi ATG
ako znamo sekvenciju proteina onda možemo sintetizirati sve primere kojima bi mogli umnožiti DNA koja kodira za taj protein

Question 9

pretraživanje banke gena pomoću PCRa

Answer 9

kao kalup za PCR se koriste skupine združenih klonova
koriste se mikrotitarske pločice sa 96 polja

Question 10

problemo kod pretraživanja banke gena PCRom

Answer 10

-lažni negativni rezultati-iz bilo kojeg razloga nije došlo do umnažanja, treba napraviti barem tri paralele
-lažni pozitivni rezultati (parazitski bandovi)- to ne bi trebao pretstavljati veliki problem jer znamo veličinu bando koji trebamo dobiti i rijetko se dogodi da se parazitski band poklapa sa našim bandom, ako se to ipak dogodi onda možemo analizirati tako da pocijepamo restrikcijskim enzimom, naš band bi se trebao pocijepat, a parazitski band ne)

Question 11

imunološko pretraživanje

Answer 11

-traženi gen se mora eksprimirat, pa je često potrebno prekloniranje u pogodniji vektor

Question 12

dva osnovna pristupa imunološkog pretraživanja

Answer 12

1.specifična protutijela označena su radioaktivitetom ili fluorescencijom
2.specifična protutijela imaju vezan enzim koji provodi određenu kolornu reakciju

Question 13

ELISA

Answer 13

temelji se na vezanju antitijela i antigena iz uzorka te spektrofotometarskom mjerenju nastale reakcije, do koje dolazi zbog promjene boje
-ponovi postupak

Question 14

obilježena proba (sonda)

Answer 14

-nukleinska kiselina (najčešće DNA) koja sadrži modificirane nukleotide koji omogućavaju njenu vizualizaciju
-nukleotidi su onda fluorescenti, radioaktivni ili kemijski modificirani
-prilikom sinteze sonde ugrađuju se takvi nukleotidi

Question 15

pretraživanje hibridizacijom kolonija- colony hybridization

Answer 15

1.klonove iz banke gena nacijepimo na hranjivu podlogu (imamo puno klonova pa je proces automatiziran)
2.otisnemo membranu na kolonije da ih preselimo na tu nitroceluloznu membranu, prvu petrijevu zdjelicu
3.membranu stavimo na novu hranjivu podlogu tako da je ona strana membrane na kojoj su kolonije okrenuta prema gore
4.hranjive tvari difundiraju iz podloge tako da na membrani narastu kolonije
5.liziramo stanice i uklonimo sve osim DNA, DNA denaturiramo i onda se fiksira na membranu
6.inkubiramo u otopini koja sadrži radioaktivnu probu kako bi došlo do hibridizacije
7.detekcija autoradiografijom i usporedba sa prvobitnom petrijevom zdjelicom
8.uzgoj pozitive kolonije
analiziramo kolonije tako da analiziramo izolirani plazmid
MORAMO IMATI POZITIVNU I NEGATIVNU KONTROLU kod detekcije hibridizacije

Question 16

radioaktivno obilježavanje DNA i RNA

Answer 16

-nukleinske kiseline obilježavaju se ugradnjom P u fosfat ili S u tiofosfat

Question 17

radioaktivni nukleotidi koriste se

Answer 17

-kao prekursori za sintezu polinukleotidnog lanca (alfa fosfat)
-kao donori fosfatne skupine tijekom fosforilacije (gama fosfat od ATPa)

Question 18

jednoliko obilježavanje molekula nukleinskih kiselina-metode

Answer 18

pomak zareza, nasumično započinjanje, PCR, transkripcija in vitro

Question 19

pomak zareza šta je važno za uspješnost

Answer 19

optimizirat polimeraznu aktivnost

Question 20

nasumično započinjanje

Answer 20

-kalup za sintezu je jednolančana DNA najčešće kružna, možemo dobiti izolacijom pomoću jednolančanih filamentoznih DNA virusa ili denaturacija dvolančane molekule
-početnice su smjesa svih kombinacija heksa/heptanukleotida
-koristi se Klenow fragment, u reakcijskoj otopini jedan nukleotid je radioaktivan
-nastaje dvolančana DNA u kojoj je jedan lanac obilježen

Question 21

označavanje DNA tijekom PCRa

Answer 21

-istovremeno umnažanje ciljane sekvence i ugradnja radioaktivnog nukleotida
-gotovo svim molekulama označena su oba lanca

Question 22

označavanje transkripcijom in vitro

Answer 22

-sinteza radioaktivne RNA
-imamo kalup koja je DNA i pomoću RNA polimeraze sintetizira se RNA uz prisustvo radioaktivnih ribonukleotida
-nakon transkripcije uklonimo DNA pomoću DNaze I
-korištenje ekspresijskih vektora, promotori se nalaze za obje strane MCSa i onda možemo birati transkripciju jednog ili drugog lanca

Question 23

detekcija neradioaktivne probe

Answer 23

neposredno (fluorescentno)
posredno

Question 24

posredna detekcija neradioaktivne probe

Answer 24

-proba ima kemijsku detekciju (antigen)
-na antigen se veže specifično antitijelo koje ima na sebi vezan enzim koji provodi kolornu reakciju, osim enzima može na sebi imati fluorescentnu jedinicu
-proba se vizualizira dodatkom odgovarajućeg supstrata zahvaljujući fluorescentnoj, kolornoj ili fotokemijskoj reakciji