DNA recombinante

Question 1

Qué es el DNA recombinante?

Answer 1

DNA con secuencias derivadas de más de una fuente.

Question 2

Pasos para producir DNA recombinante
(6)

Answer 2

• localizar el gen de interés
• aislar el gen
• insertar el gen en otra secuencia de DNA (vector)
• introducir DNA recombinado en célula huésped
• Confirmar que la célula huésped recibió el DNA recombinado
• dejar que la célula prolifere –> clona el gen

Question 3

Cómo se confirma que la célula huésped (bacteria) recibió el DNA recombinado?

Answer 3

por el marcador de selección:
- resistencia a antibioticos –> no muere
- Gen lacZ.- β-galactosidasa –> produce color azul
- proteína verde fluorescente: brilla bajo luz UV

Question 4

Qué son las enzimas de restricción?

Answer 4

Endonucleasas que identifican DNA extraño y lo cortan
Originario de bacterias: degrada DNA extraño

Question 5

Cómo se nombran las enzimas de restricción?

Answer 5

Acrónimo en cursiva 3 letras
- 1: primera letra del género de la bacteria
- 2 y 3: nombre de la especie
Letra o número por el serotipo
Número romano en orden cronológico que se aisló

Question 6

Cómo se protegen las bacterias de sus propias enzimas de restricción?

Answer 6

metilan sus bases que son reconocidas por la enzima para poder diferenciarlas de DNA extraño

Question 7

Clasificación de las enzimas de restricción

Answer 7

• Tipo I: restricción y metilación. sitio corte a 1000 pb
• Tipo II: reconoce secuencias palindrómicas. sitio de corte = sitio de reconocimiento. Uso en ing genética
• Tipo III: restricción y metilación. sitio de corte de 20 - 30 pb
• Tipo IV: reconocen DNA metilado

Question 8

Qué tipo de cortes pueden hacer las enzimas de restricción?

Answer 8

• corte cohesivo: corta en nucleótidos diferentes cada cadena. Crea extremos monocatenarios de 3 - 5 bases
• corte romo: corte simétrico en ambas cadenas

Question 9

Cómo debe ser el corte para producir DNA recombinante?

Answer 9

con la misma enzima de restricción

Question 10

Qué tipos de vectores existen?

Answer 10

• clonación: almacena la secuencia y la duplica
• expresión: transcribe el gen

Question 11

Qué secuencias tiene un vector de clonación?

Answer 11

• punto ori
• sitio múltiple de clonación: donde se inserta el DNA complementario
• marcador de selección: genera un fenotipo con el cual puede seleccionarse la célula que incorporó el vector

Question 12

Qué secuencias tiene un vector de expresión?

Answer 12

• punto ori
• promotor
• IRES: sitio de unión al ribosoma
• sitio múltiple de clonación: donde se inserta el DNA complementario
• secuencia de poli A
• marcador de selección: genera un fenotipo con el cual puede seleccionarse la célula que incorporó el vector

Question 13

Qué tipos de vectores existen?
(forma del DNA)

Answer 13

• plásmidos: dsDNA circular no cromosómico (bacterias y levadura)
• bacteriófago: virus que infecta bacterias
• cósmido: vector híbrido del DNA de un fagosoma y un plásmido (resistencia a ab + sitio cos: empaquetamiento)
• fagémido: plásmido con sitio ori de un fago –> produce ssDNA
• cromosoma artificial: BAC (bacteria) YAC (levadura)

Question 14

Pasos de clonación molecular

Answer 14

• preparación del inserto
• preparación del vector: cortar y desfosforilación
• ligación de inserto y vector
• preparación de la célula: hacer la membrana permeable (CaCl2)
• transformación celular: adquiere nuevo gen –> fenotipo
• identificación de la colonia celular que acepto el vector