F2: Sekundærstruktur, proteinoprensning og -karakterisering Flashcards Preview

Proteinkemi og enzymologi I > F2: Sekundærstruktur, proteinoprensning og -karakterisering > Flashcards

Flashcards in F2: Sekundærstruktur, proteinoprensning og -karakterisering Deck (79):
1

Hvad er et nativt protein?

Et protein i en foldet, fungerende konformation

2

Hvad er stabilitet?

Tendensen til at opretholde den native konformation

3

Hvad kan opretholde den udfoldede form?

H-bindinger med vand og meget entropi

4

Hvorfor har mange celler et reducerende miljø? Hvilken konsekvens har det for proteiner?

Pga. reduktanter som glutathione. Det gør det vanskeligt at danne svovlbroer i dette miljø.

5

Hvor langt rækker van der Waals-kræfter?

0,3-0,6 nm

6

Forklar peptidbindingens elektriske dipol

O har partiel negativ ladning, N partel positiv ladning.

7

Hvad er phi- og phi-vinkler for et peptid, hvor alle peptidgrupper ligger i samme plan?

+-180 grader

8

Hvilken konformation har den dihedrale omegavinkel oftest?

+/- 180 grader

9

Hvad er random coil?

Når der ikke er en veldefineret sekundærstruktur.

10

Hvad er 1Å?

0,1nm

11

Hvor er R-grupperne placeret i en alfahelix?

De stikker ud fra helix' backbone

12

Hvor langt er en omgang i en alfahelix (i antal residues og i Å)?

3,6 residues og 5,4 Å

13

Er en normal alfahelix højre- eller venstrehåndet?

Højrehåndet

14

Hvad er phi- og psi-vinkler i en højrehåndet alfahelix?

Phi: -57 grader Psi: -47 grader

15

Hvorfor er alfahelix så stabil?

- Det optimale hydrogenbindingsmønster
- Capping
- van der Waals-interaktioner
- Mulighed for at hydrofobe sidekæder kan "samles" på den ene side af helix og vende væk fra solvent
- Utilfredsstillede H-bindingsdonorer/acceptorer kan H-binde med vand
- Relativt lille tab af entropi

16

Hvilke muligheder er der for at undgå, at de 4 aa-rester i alfahelix-ender ikke har hydrogenbindingspartnere?

De kan hydrogenbinde ved solvent eller blive cappet af andre dele af proteinet

17

Hvad er phi- og psi-vinkler i parallelt betafoldeblad?

Phi: -119 grader Psi: +113 grader

18

Hvad er phi- og psi-vinkler i antiparallelt betafoldeblad?

Phi: -139 grader Psi: +135 grader

19

Hvilken aminosyre er bedst til at danne alfahelix?

Ala

20

Danner segmenter med mange enten positivt eller negativt ladede aminosyrer alfahelix?

Nej, ladningerne vil frastøde hinanden

21

Hvad gør høj forekomst af Asn, Ser, Cys og Thr for alfahelix' stabilitet?

Destabiliserer pga. deres form og volumen

22

Hvor langt er der ofte fra en positivt til en negativt ladet aa-rest i alfahelix?

3 aminosyrer, så de kan danne saltbro

23

Hvilke aminosyrer fidnes ofte i hhv. N-term. og C-term.?

N-term.: Negativt ladede C-term.: Positivt ladede

24

Hvilken type betasheet er mest stabil?

Antiparallel

25

Hvor er betasheets hydrogenbindinger?

Mellem strenge, der ligger ved siden af hinanden (men ikke nødvendigvis er tæt på hinanden i aminosyreskevensen, evt. i anden aa-kæde)

26

Hvor er R-grupperne placeret i betasheets?

Skiftevis pegende op og ned i forhold til foldebladet

27

Hvor lang er 1 periode (2 rester) i parallelt foldeblad?

6,5 Å

28

Hvor lang er 1 periode i antiparallelt foldeblad?

7 Å

29

Hvor findes betaturns og hvor mange aa-rester består de af?

Mellem antiparallelle betastrenge, består af 4 aa-rester

30

Hvordan er hydrogenbindingsmønstret i betaturns?

Den første aa-rests carbonylgruppe danner H-binding med aminogruppen i den fjerde rest

31

Hvor i proteinet findes betaturns ofte?

Nær overfladen, da aa-rest 2+3 kan H-binde med vand

32

Hvilke aa-rester findes ofte i betaturns og hvorfor?

Pro: Kan tage cis-konfiguration og give en favorabel drejning
Gly: Lille og fleksibel

33

Tegn et Ramachandran-plot og marker, hvor alfahelix (højrehåndet) og betasheets (parallelle+antiparallelle) befinder sig

Se s. 124 i Lehninger

34

Hvad undersøger man med circulær dichroisme-spektroskopi?

Forskellen i absorption mellem venstrehåndet og højrehåndet cirkulært polariseret lys.

35

Hvilket CD-spektrum har alfahelix?

Positivt bånd ved 192 nm
Negativt bånd ved 208 nm
Negativt bånd ved 222 nm

36

Hvilket CD-spektrum har beta-konformation?

Positivt bånd ved 195 nm
Negativt bånd ved 216 nm

37

Hvilket CD-spektrum har random coil?

Negativt bånd ved 197 nm
Positivt bånd ved 216 nm

38

Hvad absorberer UV-lyset i regionen 190nm - 250nm, som CD-spektroskopi forgår i?

Peptidbindingen

39

Hvad er tertiær struktur?

Det overordnede tredimensionelle arrangement af alle peptidkædens atomer.

40

Hvordan fastholdes tertiær struktur?

Svage interaktioner og svovlbroer

41

Hvad er kvaternær struktur?

Arrangementet af subunits

42

Hvad er hyppige funktioner af fibrøse proteiner?

Fx ydre beskyttelse og støtte

43

Hvad er hyppige funktioner af globulære proteiner?

Katalyse og regulation

44

Hvorfor er fibrøse proteiner uopløselige i vand?

Hydrofobe aminosyrer på overfladen.

45

Hvad er coiled coil?

To alfahelixes snoet sammen til en ventrehåndet helix

46

Hvilke aa-rester forekomme oftest i alfa-keratin - og hvorfor?

Ala, Val, Ile, Leu, Met og Phe - de er upolære og kan lave hydrofobe interaktioner og pakkes tæt

47

Hvordan sikres stabiliteten i alfakeratin

Via svovlbroer

48

Hvordan er collagen opbygget?

Tre venstrehåndssnoede alfakæder er snoet om hinanden til en højrehåndssnoet superhelix. Collagen er opbygget af Gly, Ala, Pro og 4-Hydroxyprolin. Disse er små nok og enten fleksible eller fastlåste nok til at give de rigtige knæk. Der kan være crosslinks med atypiske bindinger

49

Hvilke aa-rester findes i silkefibers betasheets og hvorfor?

Især Ala og Gly, da de er små nok til at betasheets kan blive pakket meget tæt

50

Hvad afgør et proteins opløselighed?

En blanding af temperatur, saltkoncentration og pH m.m.

51

Øget saltkoncentration får opløseligheden til at...?

Falde

52

Hvad bruges dialyse til under oprensning af proteiner?

Fx til at fjerne salte, der har været brugt til at udfælde proteiner

53

Hvad er bundet til cationbytteres stationære fase?

Anioniske grupper (negativt ladede)

54

Hvad er bundet til anionbytteres stationære fase?

Cationiske grupper

55

Hvad afgør et proteins affinitet for grupperne i den stationære fase i ionbytterchromatografi?

pH og koncentrationen af konkurrerence frie salte

56

Et negativt ladet protein vil bevæge sig hurtigt igennem en matrix med ____ ladede grupper.

Negativt

57

Hvor lang skal en søjle være?

Lang nok til at skille båndene ad, men ikke lang nok til at hvert bånd bliver for spredt.

58

Kommer det største eller mindste protein først ud af søjlen i gelfiltrering/size-exclusion chormatography?Hvorfor?

Det størst kommer først ud, da de små proteiner tager en labyrint-agtig vej gennem polymerkugler i søjlen.

59

Hvad er princippet i affinitetschromatografi?

Søjlematerialet har ligander bundet, så proteiner, der kan interagere med liganden forsinkes gennem gelen. De vaskes bagefter ud med fx en saltopløsning

60

Hvad afgør, hvor hurtigt, et protein vandrer ved elektroforese?

Form og ladning-til-masse-forhold

61

Mobiliteten µ i gelelektroforese er givet ved...?

V/E (hastighed over elektrisk potential) eller Z/f (f=friktionskoefficient og nettoladningen =Z)

62

Hvad giver proteinet dets ladning til gelelektroforese?

SDS giver negativ ladning, der tilnærmelsesvis er proportional med massen

63

Hvilken størrelse proteiner vandrer hurtigst i SDS-gel?

Små proteiner

64

Adskilles subunits af SDS?

Ja

65

Hvad betyder et tag i affinitetskromatografi?
Hvad bruges det til?

Et protein, der sættes på det analyserede protein via genteknologi. Hvis man analyserer et protein, der ikke binder nogen kendt ligand, kan man i stedet bruge et tag, der binder en bestemt ligand, der så påsættes søjlen. Tagget kan senere fjernes med en protease - der kan dog sidde lidt tilbage, der kan påvirke analysen.

66

Hvad er enheden på x-aksen i massespektroskopi?

m/z

67

Hvad er fordelene ved massespektroskopi?

Kræver lille prøvemængde
Giver præcist resultat for massen
Det går hurtigt
Muliggør undersøgelse af ligandbinding, når massen er kendt

68

Hvordan gøres en prøve klar til massespektroskopi?

Der påsættes protoner

69

Hvad bruges tandem MS til?
Hvordan sker det?

Bruges til sekvensering af korte polypeptider
Det foregår ved at peptider kløves og får påsat en ladning, enten +1 eller +2. I et kollisionskammer spaltes en peptidtype fra kammer 1 forskellige steder (oftest ved peptidbindingen). Disse fragmenter analyseres i kammer 2, og ved at se på masseforskellen mellem peaks i spektret kan man identificere aminosyresekvensen.

70

Hvad er problemet med Ile og Leu i MS?

De har samme masse og kan derfor ikke bestemmes

71

Hvor findes alfahelix ofte i proteinet?

På ydersiden med en hydrofil og en hydrofob del (N-cap og C-cap sidder begge i hydrofob del.

72

Hvordan stabiliseres yderstrenge i betafoldeblade?

Hydrogenbinding til solvent og polære sidekæder

73

Hvad er et mixed betasheet?

Når to yderstrenge fra forskellige subunits' betasheet binder i interface

74

Hvad er supersekundærstruktur?

= motiv, karakteristisk foldningsmønster af flere sekundærstrukturer og deres forbindelser. Genkendeligt arrangement.

75

Nævn eksempler på supersekundærstruktur

Fx helix-loop-helix, greek key, beta hairpin.
Små motiver kan være en del af større motiver

76

Hvad skal man overveje, inden man påbegynder oprensning af protein?

Formål (fx renhed eller strukturbestemmelse), kilde (naturligt eller rekombinant), tilgængelige metoder (herunder pris i forhold til udbytte)

77

Nævn en metode, der er stor kapacitet, men lille resolution og en der har lille kapacitet, men stor resolution

1: Behandling med salt, fx ammoniumsulfat, for at udfælde protein
2: Fx kromatografi eller gelelektroforese

78

Hvilke egenskaber kan man lave karakterisering og oprensning på baggrund af?

pI, masse, ladning og ladningsfordeling, størrelse og form, opløselighed, hydrofobicitet og ligandbinding

79

Hvad kan det anvendes til, at alfa-helix, betasheet og random coil har forskellige spektre i CD spektroskopi?

Det kan give et estimat af fraktionen af de to sekundærstrukturer i et protein, dvs. om der er høj/lav forekomst af alfa-helix og beta-sheets.
Man kan desuden undersøge udfoldning af proteinet eller konformationelle ændringer ved at sammenligne spektre af proteinet under forskellige forhold.