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MMD 1045 examen 1 > Génétique 6 > Flashcards

Génétique 6 Flashcards

Introduction au diagnostic moléculaire

1
Q

Définition du diagnostic moléculaire?

A

Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigenome

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Q

~ ___ nouveaux tests cliniques disponibles par jour

A

10

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Q

Combien de tests disponibles en ce moment?

A

Plus de 60 k

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4
Q

% de tests qui testent un panel de gènes?

A

10%

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5
Q

Que doit posséder un laboratoire diagnostic afin d’assurer la plus grande confiance dans les résultats?

A
  • Formation
  • Design du laboratoire
  • Contrôles de qualité
  • Programmes d’assurance de la qualité
  • Accréditation
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6
Q

Décrit l’ADN.
nb de liens H, charge et constitution

A

Acide nucléique = sucre + phosphate + base
Charge négative (phosphate)
Liens hydrogène
* G-C : 3
* A-T : 2

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7
Q

Décrit la structure du gène, de gauche à droite.

A
  • Promoteur
  • 5’ UTR
  • Codon d’initiation
  • Exon (GT)
  • Intron
  • 3’ UTR
  • Codon STOP
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8
Q

Fin d’exon?

A

GT

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9
Q

Début exon?

A

AG

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10
Q

Qu’est-ce qu’une variabilité du génome non pathologique?

A

Toute divergence de séquence d’ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associée à une pathologie génétique

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11
Q

Qu’est-ce qu’une variabilité du génome pathologique?

A

Un changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique

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12
Q

Est-ce qu’on possède beaucoup de variations sur notre génome?

A

Oui, plus de 5-6 M

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13
Q

Est-ce que la plupart de nos variations sont pathologique?

A

Non

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14
Q

Que peuvent être les variations non pathologiques?

A
  • Dans régions non codante
  • Polymorphisme
  • Touche un gène qui s’exprime seulement à l’état récessif et il n’y a pas une seconde variation
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15
Q

Causes externes des variations génétiques?

A
  • Radiations
  • UV
  • Chimique
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16
Q

Causes internes des variations génétiques?

A
  • Dépurination
  • Déamination
  • Radicaux libres
  • Erreurs de la polymérase
  • Erreur de réplication
  • Méthylation
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17
Q

Les dinucléotides CG sont des endroits de prédilection pour les ________

A

mutations

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18
Q

Décrit la mutation la plus fréquente des îlots CpG

A
  1. C →methyl-C
  2. Methyl-C →U
  3. U→T
  4. CG → TG
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19
Q

Nomme les 3 types de variations selon la taille.

A

Grandes: CNV, LINE
Moyenne: microsatellites
Petites: SNP, indels

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20
Q

Que sont les microsatellites?

A

Répétition d’une petite séquence (ex: CA)

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21
Q

Que sont les SNP?

A

Changement d’un seul nucléotide

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22
Q

En quoi sont classés les petits réarrangement?

A
  • Substitution
  • Insertion
  • Délétion
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23
Q

En quoi sont classés les substitutions?

A

Transition
Transversion

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24
Q

En quoi sont classé les insertions?

A

Mutation dynamiques

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25
Q

En quoi sont classés les grands réarrangements?

A

Insertion
Délétion
Équilibré

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26
Q

Quelle mutation est la plus fréquente?

A

Substitution

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27
Q

Nomme les 4 conséquences possibles des variations.

A
  1. Homologue (silencieux)
  2. Faux-sens (missense)
  3. Non-sens (nonsense)
  4. Altération du cadre de lecture (frameshift)
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28
Q

Homologue?

A

Change un codon pour un autre codant pour le même acide aminé

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29
Q

Faux-sens?

A

Change le codon pour celui codant pour un autre acide aminé

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30
Q

Non-sens?

A

Change le codon pour un codon stop

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31
Q

Frameshift?

A

Insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3, entraînant une modification du codon et de ceux en aval

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32
Q

Éléments à considérer pour évaluer le degré de danger d’une mutation?

A
  1. Fréquence population
  2. Conservation
  3. Impact ARNm
  4. Impact sur la protéine
  5. Fonction du gène
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33
Q

Gène récessif?

A

Le phénotype est exprimé seulement à l’état homozygote

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34
Q

Dominant?

A

Le phénotype est exprimé à l’état hétérozygote

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35
Q

Perte de fonction?

A

Une réduction dans la quantité de la protéine produite, ou une réduction de l’activité de la protéine, entraîne le phénotype

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36
Q

Gain de fonction?

A

Une augmentation dans la quantité de la protéine produite, une augmentation de l’activité de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraîne le phénotype

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37
Q

Nomme les 5 mécanismes associés aux gains de fonction.

A
  • Augmentation du dosage génique
  • Altération de l’expression de l’ARNm
  • Activité accrue de la protéine
  • Nouvelle fonction de la protéine
  • Altérations toxiques à la protéine
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38
Q

Exemples de mutations dynamiques?

A
  • Steinert
  • X fragile
  • Huntington
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39
Q

But de l’isolation génétique?

A

Isoler l’ADN du reste du contenu cellulaire (majoritairement protéines)

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40
Q

Quelles cellules sont utilisées pour l’isolation de l’ADN?

A

Cellules nucléées (sang: leucocyte)

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41
Q

De quoi faut-il se servir pour isoler l’ADN?

A

Il faut se servir des caractéristiques spécifiques de l’ADN p/r au reste du contenu cellulaire

42
Q

Nomme les deux produits utilisé pour isoler l’ADN.

A

Phénol-Chlorophorme
Sels chaotropiques

43
Q

Que fait l’ADN en présence de sels chaotropiques?

A

Adsorbe sur colonne de verre/membrane

44
Q

Que font les autres substances en présence de sels chaotropiques?

A

solubles dans l’eau

45
Q

Avantages des sels chaotropiques?

A

Non-toxique
Automatisable

46
Q

Réaction de l’ADN en présence de Phénol-Chlorophorme?

A

Hydrosoluble

47
Q

Réaction des autres composantes en présence de Phénol-Chlorophorme?

A

Phase organique

48
Q

Désavantages du Phénol-Chlorophorme?

A

Toxique

49
Q

Nomme les deux technique qui permettent d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN.

A
  • Densité optique
  • Teintures intercalantes (SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium)
50
Q

Que fait la densité optique?

A
  • λ 260nm = absorbance max ADN (280mm pour protéines)
  • Estimation de la quantité de l’ADN (ratio 260/280 estime pureté)
51
Q

À quoi servent les teintures intercalantes?

A
  • Composés qui se fixent à l’ADN double brin
  • Estimation de la quantité et de la taille de l’ADN
52
Q

De quoi est formé la sonde?

A
  • Séquence d’ADN complémentaire
  • Marquage (fluo, radioactif)
53
Q

La détection du signal indique la présence de la _____________________.

A

séquence complémentaire

54
Q

Qu’est-ce que l’électrophorèse capillaire?

A

On sépare les molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel (e.g. Agarose)

55
Q

Nomme une technique sur l’ADN génomique.

A

Buvardage Southern

56
Q

Nomme des exemples de techniques sur produits de PCR.

A
  • PCR-migration (fragment sizing)
  • Allele-specific oligonucleotides
  • PCR-digestion
  • Allele-specific primer extension (ASPE)
  • PCR-séquençage
  • PCR en temps réel
  • MLPA
57
Q

Qu’est-ce que le buvardage Southern?

A

Technique qui combine électrophorèse sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’hybridation par une sonde marquée complémentaire à l’ADN cible

58
Q

Nomme les 5 étapes du buvardage de Southern.

A

A. Digestion de l’ADN génomique
B. Électrophorèse capillaire
C. Transfert sur membrane
D. Hybridation
E. Détection par autoradiographie

59
Q

Que permet de quantifier le buvardage de Southern?

A

Les grandes expensions

60
Q

Nomme les composantes (6) de la réaction de PCR.

A
  1. ADN du patient
  2. Amorces
  3. Polymérase
  4. Nucléotides
  5. Tampon (ions, magnésium)
  6. Autres additifs si nécessaire
61
Q

La PCR fait _________ la quantité d’ADN à chaque cycle

A

doubler

62
Q

Nb d’ADN si 30 cycle de PCR?

A

2^30

63
Q

Que permet de détecter le PCR-migration?

A

Permet de détecter des insertions ou des délétions

64
Q

Qu’est-ce que le PCR migration?

A
  • Électrophorèse capillaire des produits de PCR
  • Détection du signal - la distance où se situe la bande par rapport au puits reflète sa taille
65
Q

Applications du PCR migration?

A

Analyses d’identité génétique:
* Instabilité des microsatellites
* Contamination foeto-maternelle
* Judiciaire
Insertions et délétions récurrentes

66
Q

Qu’est-ce que le PCR digestion?

A

Digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique

67
Q

Desing du PCR digestion?

A

mutation crée ou abolit site de restriction

68
Q

Exemples d’un PCR digestion?

A
  • EcoR1 coupe à G_AATTC
  • Dra I coupe à TTT_AA
69
Q

Applications de la PCR digestion?

A
  • Mutations ponctuelles récurrentes
  • Il est habituellement possible de trouver un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
70
Q

Qu’est-ce que “Allele Specific Primer Extension”?

A
  • Amplification PCR
  • Jeu d’amorces marquées fluorescence dont certaines ont mismatch 3’
  • Extension ssi match 3’
  • Détection
71
Q

Caractéristique de l’appareil pour le séquençage Sanger?

A

Appareil qui permet l’électrophorèse sur gel (polymère) et détection de fluorescence avec précision de 1 nuléotide

72
Q

Étapes du séquençage Sanger?

A
  1. Amplification PCR
  2. Dénaturation
  3. Réamplification avec mélange de nucléotides et de nucléotides modifiés qui sont marqués par la fluorescence
73
Q

Caractéristiques des ddNTP?

A

pas de -OH au C3 du ribose (chain termination)

74
Q

L’incorporation du ddNTP vs le dNTP est __________.

A

aléatoire

75
Q

Applications du séquençage de Sanger?

A
  • Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène
  • Méthode de choix pour substitutions
  • Bonne méthode pour petites insertions ou délétions
  • Ne détecte pas les grandes anomalies de dosage
76
Q

Qu’est-ce que le PCR temps-réel?

A

Réaction de PCR avec détection du produit simultanée

77
Q

Possibilités du PCR temps-réel?

A
  • Discrimination allélique
  • Quantification (relative/absolue)
78
Q

Décrit l’essai TaqMan.

A
  1. La sonde TaqMan est composée d’un rapporteur et d’un «quencher»
  2. La sonde se lie à l’ADN de même que l’amorce
  3. La Taq libère le rapporteur ce qui génère de la fluorescence
79
Q

Décrit le PCR temps réel pour discrimination allélique.

A
  • Amorce marquée
  • Sonde marquée
  • Même logique que méthodes de PCR traditionnel, mais moins de manipulations
80
Q

Décrit le PCR temps réel quantitatif.

A
  • On fixe un seuil arbitraire (unités relatives de fluorescence (RFU))
  • Ce seuil est le même pour tous les patients testés
  • Comme dans la PCR la quantité d’ADN double à chaque cycle
81
Q

Explique le résultat de ce scénario:
Échantillon 1, seuil atteint après 24 cycles (n)
Échantillon 2, seuil atteint après 25 cycles (n+1)

A

Puisque le nombre de molécules d’ADN double à chaque cycle, et que le seuil est le même pour les deux échantillons, il y avait 2X moins d’ADN dans l’échantillon 2 au départ

82
Q

À quoi sert MLPA?

A

Recherche de délétions ou duplications

83
Q

Méthode de MLPA?

A
  1. Sonde en deux sous-unités (2 oligonucléotides) qui doivent s’hybrider côte-à-côte sur l’ADN du patient
  2. Ligase scelle ensuite les 2 sous-unités
  3. Amplification PCR
  4. Électrophorèse capillaire
84
Q

Que permet le SNG?

A
  • Permet de multiplier l’information obtenue d’une analyse
  • Possible d’analyser plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps
85
Q

Comment fonctionne le SNG?

A
  1. Fragmentation de l’ADN
  2. Liaison d’adapteurs
  3. Capture
  4. Amplification en //
  5. Séquençage en //
  6. Analyse bioinformatique
86
Q

Décrit la partie d’analyse bioinformatique.

A
  1. Il faut procéder à l’alignement de ces séquences au bon endroit du génome humain
  2. Ensuite identifier si des variations de séquence sont présentes
  3. Ensuite déterminer si certaines de ces variations sont pathologiques et situées dans des gènes qui pourraient expliquer le phénotype du patient
87
Q

Le _% du génome qui contient les régions codantes

A

1

88
Q

Nomme les deux applications du SNG.

A
  1. Exome
  2. ADN foetal circulant
89
Q

Décrit l’ADN foetal circulant.

A
  • Produit par l’unité placentaire
  • Courte taille
  • Courte T½
  • Variation absente chez la mère
90
Q

Qu’est-ce qui nous permet de reconnaitre le début d’un exon et d’un intron?

A

Des séquences particulières

91
Q

Qui a la plus grande diversité d’allèle entre les microsatellites et le SNP?

A

Microsatellites

92
Q

Quelle région a besoin d’avoir plus de triplets répétés pour être muté, exon ou intron?

A

Intron

93
Q

Vrai ou faux? Toutes les polymérases font des erreurs.

A

Vrai

94
Q

Vrai ou faux? Toutes les polymérases ont le même taux d’erreur?

A

Faux

95
Q

Nomme trois façons de fragmenter l’ADN pour le SNG.

A
  • Sonication
  • Nébulisation
  • Digestion
96
Q

En quoi consiste la capture?

A

Tu choisis les séquences du génome que tu veux séquencer (ex: exome)

97
Q

Que comprends la lisaison d’adaptateurs?

A
  • Liaison d’adaptateurs
  • Ajout code barre
98
Q

Qu’est-ce que l’amplification en //?

A

PCR sur une flocelle

99
Q

Qu’est-ce que le séquençage en //?

A

Hybridation avec nucléotides fluorescents, un par un

100
Q

À quoi sert le SNG pour l’exome?

A

Trouver un CNv pathologique pour un patient (certains sont aux même endroit, d’autres non)

101
Q

À quoi sert le SNG pour l’ADN foetal circulant?

A
  • Sexe foetus
  • Facteur Rh
  • Trisomie

MMD 1045 examen 1 (13 decks)

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