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Flashcards in Gentechnik Deck (88):
1

denaturieren

95 C ; Wasserstoffbrücken spalten

2

hybridisieren

60 C; Primer lagern sich an

3

polymerisieren

72 C; Taq-Polymerase kann arbeiten

4

Klonierung

Herstellung genetisch identischer Zellen (Klon)

5

Rekombination

Plasmid, dem ein neues Gen eingefügt wird

6

Ligation

Verknüpfung zweier DNA- oder RNA-Segmente an ihren Enden

7

Transformation

rekombinantes Plasmid in Bakterium einschleusen

8

Amplifikation

Vermehrung von DNA-Abschnitten

9

DNA-Klonierung

Einbau eines DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor mit anschließender Vermehrung des rekombinanten DNA-Moleküls

10

Restriktionsenzym

Enzyme, die die Restriktionsschnittstelle erkennen auf dem Plasmid und dieses dort schneidet

11

MCS (Multiple Cloning Site = Polylinker)

Auf der multiple cloning Site befinden sich alle möglichen Schnittstellen für Restriktionsenzyme. Diese wird aufgeschnitten und dort wird das fremd Gen eingesetzt.

12

Vektor

In der Gentechnik und der Biotechnologie versteht man unter einem Vektor ein Transportvehikel ("Genfähre") zur Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure (oft DNA) in eine lebende Empfängerzelle durch Transfektion oder Transduktion.

13

Schritte der Klonierung

1. Rekombinatin, Ligation
2. Transformation
3. Amplifikation
4. Replikation, Zellteilung
5. klonales Wachstum -> Selektion (DNA-Screenings)

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Selektion

Auslese

15

DNA-Screenings

Bezüglich

16

Gentransfer Methoden

- Viren: Eukaryoten
- Phagen: Prokaryoten
- Agrobacterium: Pflanzenzellen (Bakterien als Vesikel)
- Elektroporation: Protoplasten (Pflanzenzellen ohne Zellwand), T-Zelle, gram-negative Bakterien
- Particle Gin (Genkanone): Pflanzenzellen
- Liposomen (Lipofektion): Säugetiere, Protoplasten
- Mikroinjektion: Säugetiere
- Calciumchlorid- /Hitzeschock-Methode: Bakterien

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Gentransfermethode Mikroinnjektion

Mit einen sehr feinen Kanüle können die Zellmembran und die Kernhülle durchstochen werden, und Fremd-DNA kann direkt in den Kern injiziert werden.

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Gentransfermethode Viren

Das Fremdgen wird in ein wirtsspezifisches Virus eingebaut. Das Virus infiziert die Zelle und schleust dabei die Fremd-DNA ein. Verwendet man Retroviren, wird das Fremdgen in das Genom der Zelle eingebaut.

19

Gentransfermethode Agrobacterium

Durch Pflanzenstoffe veranlasst schleust Agrobacterium die T-DNA des Ti-Plasmids über Zellverletzungen in die Zelle. Dabei regulieren Gene auf der T-DNA autonom ihre Integration in das Genom der Zelle.

20

Gentransfermethode Elektroporation

Durch elektrische Entladungen werden vorübergehend Löcher in der Zellmembran erzeugt, durch die Fremd-DNA aus dem umgebenden Medium eindringen kann.

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Gentransfermethode Partikelpistole

Kleine Goldpartikel werden mit Fremd-DNA beschichtet, und damit wird die Zelle beschossen. Dabei gelangen beladene Partikel auch in den Zellkern. Mit der Partikelpistole können auch Pflanzenzellwände durchdrungen werden.

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Gentransfermethode Liposomen

Fremd-DNA wird von einer künstlich hergestellten Doppel-Lipidschicht der Zellmembran und entlassen ihre DNA in das Zellinnere.

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Selektionsmethoden der Wunsch-DNA
Wie finde ich den richtigen Klon?

- radioaktiv markierte Sonde
-> Nachteil: Sicherheitsproblematik (radioaktiv), teuer, Sequenz muss bekannt sein
- Antibiotikaselektion
-> Nachteil: keine Selektion nach einem Gen sondern nur nach rekombinantem (weiß nur in der Kolonie ist das Gen), Negativselektion (Selektion durch Nichtwachstum)
- Blau-weiß-Selektion (Selektion nach dem Lac Z-Gen)

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Klonierungsvektor

Klonierungsvektor m, ein gentechnisches Vehikel (Gentechnologie), das zur Übertragung von Fremd-DNA in einen Wirtsorganismus und zu deren Vermehrung (Klonierung) in diesem Organismus genutzt werden kann (Vektoren). Wird (zusätzlich) die Produktion eines von der DNA codierten Proteins bezweckt, verwendet man spezielle Expressionsvektoren.

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Expressionsvektor

Expressionsvektor m, ein besonderer Klonierungsvektor (Vektoren), der so konstruiert ist, daß eine an einer bestimmten Stelle innerhalb des Vektors eingebaute codierende DNA-Sequenz in mRNA transkribiert (Transkription) und nachfolgend in ein Genprodukt translatiert (Translation) wird. Als Expressionsvektoren können Plasmid- oder Bakteriophagen-Derivate (hierbei meist auf dem Lambda-Phagen basierend; Plasmide, Bakteriophagen) eingesetzt werden.

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Produktreinigung

Wird angewandte, wenn man nur ein Protein von vielen aus Bakterium will.

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DNA-Analyse

Bestimmung einer DNA-Sequenz = Sequenzierung mit Enzym

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Annealing- & Schmelztemperatur (Tm) Formel

Tm= 4x(G+C)+2x(A+T)
[C]

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Auf was muss man beim Primerdesign achten?

- G oder C am Ende der Primer (starke Basen 3 H-Brücken)-> erleichtert Primer seine Arbeit
- Annealingtemperatur darf nicht zu unterschiedlich sein (da sich dort drei Wasserstoffbrücken befinden)
- dürfen nicht komplementär sein, da sie sich sonst gegenseitig verbinden (Primerdimer)
- wenn ein Primer zu viel G u C hat und der andere zu viel A u T, ist die Temperaturdifferenz zu hoch
- beide Primer sollen ähnliche Tm haben (max. 2C Abweichung)
- das 5'-Ende darf nicht komplementär zum 3'-Ende sein, sonst entsteht ein Hairpin-Loop

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Schmelztemperatur Primer

Oder auch Denaturierung genannt.
- hängt von seinerLänge und dem GC Gehalt ab

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Annealing Temperatur Primer

Bei einer niedrigen Temperatur müssen die Basenpaarungen nicht immer zu 100 % übereinstimmen, womit lockere Bindungen entstehen können. Erhöht man die Temperatur, so kommt es zum Aufschmelzen solcher Verbindungen, da ihre Bindungsenergie nicht groß genug ist. Eine maximale Übereinstimmung der Basenpaarungen hat eine maximale Bindungsstärke zur Folge und somit auch eine optimale Spezifität.

Dies funktioniert jedoch nur so lange, bis die Schmelztemperatur von Primer und Zielsequenz erreicht ist. Deshalb wählt man bei Standard-PCRs meist eine Temperatur, die circa 3 °C unter der errechneten Schmelztemperatur liegt, damit ein Annealing der Primer an die Zielsequenz sichergestellt ist.

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Gen-Sonde

Gensonden sind Oligonukleotide (meistens einsträngige oder doppelsträngige DNA, seltener RNA), die eine komplementäre Basensequenz zum gesuchten Gen aufweisen und sich an die passende DNA-Sequenz einer (immobilisierten) DNA anlagern können. Die Stabilität der Anlagerung hängt von der Übereinstimmung der DNA-Sequenzen, dem GC-Gehalt und der Länge der Gensonden bzw. Anzahl der hybridisierten Basen ab. Durch intensives Waschen können alle nicht perfekt homologen Sequenzen wieder getrennt werden, um nur Signale bei exakten Übereinstimmungen zu bekommen.

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Antibiotikaselektion
Blau-Weiß-Selektion

Das Ziel der Blau-Weiß-Selektion ist die Identifikation transgener Bakterien mit gewünschten Modifikationen. Zum Einen werden diejenigen Bakterien identifiziert, die ein Plasmid aufgenommen haben und zum Anderen wird durch die Blau-Weiß-Selektion die Frage beantwortet, ob das Plasmid erfolgreich modifiziert wurde. Für die Bestimmung Plasmid-enthaltender Bakterien tragen die Plasmide ein Gen, welches eine Antibiotikaresistenz vermittelt, die der verwendete Bakterienstamm nicht bereits selbst besitzt. Kultiviert man die Bakterien auf einem Kulturmedium mit dem zur Resistenz passenden Antibiotikum, so überleben dort idealerweise nur diejenigen Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben.Für die Blau-Weiß-Selektion werden bestimmte Plasmide als Vektoren verwendet, die an der Position zur Insertion des Transgens in das Plasmid (an der Multiple Cloning Site) das Gen für eine β-Galactosidase (lacZ-Gen) enthalten. Das Gen für die Galactosidase wird als Reportergen verwendet.

Durch Einfügung eines Transgens in die Multiple Cloning Site wird die Galactosidase inaktiviert. Dadurch enthalten nach einer Transformation der Plasmide die transgenen Organismen im Gegensatz zu den nicht transgenen Organismen keine funktionsfähige Galactosidase, sofern der zur Transformation verwendete Bakterienstamm kein weiteres Gen für eine Galactosidase enthält.

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Reportergen

Da sich auf dem Reportergen die MCS befindet und dann dazwischen ein Fremd Gen eingesetzt wurde, kann das Reportergen nicht mehr abgelesen werden, da es ja aufgeschnitten wurde. Dies zeigt dann, dass die Transformation des Fremd-Gens funktioniert hat.

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Wie kann man das Plasmid in der richtigen Richtung in das Bakterium transformieren?

Man benutzt zwei verschiedene Restriktionsenzyme, da die verschiedenen Enden nicht zusammen kleben können.

35

Ablauf Bakterienklon mit Wunsch-DNA finden -> radioaktive DNA-Sonde

1. Bakterienkolonien mit klonierten Segmenten fremder DNA auf Nährboden
2. Kolonien werden auf Filter gestempelt
3. Zellen auf Filter werden zerstört ( um an DNA ran zu kommen) und die DNA denaturiert (um einzelsträngige DNA zu haben, damit sich Sonde anlagern kann)
4. radioaktivmarkierte Sonde wird zum Filter gegeben (Sonde ist komplementär zu Wunschgen und lagert sich an ihm an)
5. Autoradiographie wird durchgeführt um zu sehen welche Kolonie radioaktiv ist auf Röntgenfilm
6. Autoradiographie wird mit der Mutterplatte verglichen

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Repressor (nur auf Expressionsvektor)

bindet an den silencer dadurch kann der aktivator nicht mehr am enhancer binden somit kann keine expression stattfinden

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Markergen/ Selektionsgen

Gibt an ob die Zellen das Plasmid enthalten, oft durch eine Resistenz

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Gemeinsamkeiten und Unterschiede von Klonierungsvektor und Expressionsvektor

Gemeinsamkeiten:
- ori: brauchen beide als Replikationsstart
- Marker-Gene: brauchen beide, damit man erkennt, ob Transformation erfolgreich war(Resistenz)
- Reporter-Gene: beide, damit man weiß, ob es nun ein rekombinantes Plasmid ist
-MCS: beide, Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme auf Reportergen, um Fremd-Gene einfügen zu können

Unterschiede:
- P (Promotor): nur Expressionsvektor, zum Start der Transkription
- RBS (Ribosomenbindungsstelle): nur Expressionsvektor, SDS (seine dalgano sequenz) als ribosomale Bindungsstelle
- T (Terminator): nur Expressionsvektor, Ende der Transkription

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Blau-weiß-Selektion- Vektoren mit Lac-Z-Gen

Das Ziel der Blau-Weiß-Selektion ist die Identifikation transgener Bakterien mit gewünschten Modifikationen. Zum Einen werden diejenigen Bakterien identifiziert, die ein Plasmid aufgenommen haben und zum Anderen wird durch die Blau-Weiß-Selektion die Frage beantwortet, ob das Plasmid erfolgreich modifiziert wurde. Für die Bestimmung Plasmid-enthaltender Bakterien tragen die Plasmide ein Gen, welches eine Antibiotikaresistenz vermittelt, die der verwendete Bakterienstamm nicht bereits selbst besitzt. Kultiviert man die Bakterien auf einem Kulturmedium mit dem zur Resistenz passenden Antibiotikum, so überleben dort idealerweise nur diejenigen Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben.

Für die Blau-Weiß-Selektion werden bestimmte Plasmide als Vektoren verwendet, die an der Position zur Insertion des Transgens in das Plasmid (an der Multiple Cloning Site) das Gen für eine β-Galactosidase (lacZ-Gen) enthalten. Das Gen für die Galactosidase wird als Reportergen verwendet.

Durch Einfügung eines Transgens in die Multiple Cloning Site wird die Galactosidase inaktiviert. Dadurch enthalten nach einer Transformation der Plasmide die transgenen Organismen im Gegensatz zu den nicht transgenen Organismen keine funktionsfähige Galactosidase, sofern der zur Transformation verwendete Bakterienstamm kein weiteres Gen für eine Galactosidase enthält.

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Verwendung von Klonierungsvektor und Expressionsvektor

Klonierungsvektor:
DNA-Vermehrung und DNA-Lagerung

Expressionsvektor:
Expression der Wunsch-DNA als Protein
heterolog

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Eukaryotische Vektoren
retrovirale Vektoren
(für Tiere)

Retroviren sind gehüllte Viren, die tierische Zellen infizieren. Sie besitzen Erbgut, welches einzelsträngige RNA (ssRNA) ist, die durch Reversetranskriptase ( RNA-Abhängige DNA-Polymerase) in DNA übersetzt wird. Diese DNA wird in die DNA des Wirtes eingebaut.
Retroviren werden genutzt um Animal Zellen stabil zu transformieren. Das Virengenom wird so verändert, dass es die gewünschte fremd DNA enthält und der Virus nur noch in der Lage ist die gewünschten Animal es Zellen zu infizieren und die Wünschens in das Genom des Wirtes zu integrieren.
Eine wichtige Voraussetzung bei der Modifikation des vitalen Genoms ist, dass die als Vektoren verwendeten Viren nicht mehr in der Lage sein dürfen neue Viren zu bilden. Dabei werden alle Gene auf dem vitalen Genom, die für Bestandteile für neue Gene, durch das Wunschgen ersetzt. Diese werden entfernt, weil wir keine neuen Viruspartikel wollen. Außerdem muss die Reverse Transkriptase (sind Enzyme, die die Umschreibung von RNA in DNA katalysieren), sowie die Integrase (ist ein Enzym von Retroviren, das für den Einbau viraler DNA-Stränge in die Chromosomen der Wirtszelle zuständig ist) in der Virushülle verpackt sein.

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Eukaryotische Vektoren
Ti-Plasmid/ Ti-Vektor
(Für Pflanzen)

Das Ti-Plasmid, welches aus dem Agrobacterium stammt, vermittelt dem Bakterium die Fähigkeit Pflanzenzellen genetisch zu verändern, so dass sich Wurzelgallen bilden, in denen Bakterien leben. Die Pflanzenzellen wird umprogrammiert, so dass sie ein krebsartiges Zellwachstum hervorruft. Außerdem übertragen die Bakterien mittels des Ti-Plasmids Gene in das Pflanzengenom, dass die Pflanze Opine herstellt, die die Bakterien selbst nicht verstoffwechseln können, und das Agrobacterium diese Opine als Nahrungsquelle nutzen kann.
Ti-Plasmid wird genutzt, Pflanzenzellen stabil zu transformieren, d.h. das Ti-Plasmid wird so verändert, dass es die fremd-DNA enthält, die dann mittels Bakterium in die Pflanzenzellen eingeschleust wird. Eine wichtige Voraussetzung bei der Modifikation des Ti-Plasmids zum funktionellen Vektor ist ebenfalls, die tumorvermittelnden Gene zu entfernen, weil wir die Pflanze ja nicht beschädigen wollen.
Wichtig für diesen Vektor ist:
- Fremdgen
- Markergen (Markergene werden benutzt um zu überprüfen, ob eine Transformation - also die Einführung eines Gens in eine neue Zelle - erfolgreich war) für Pflanze
- Markergen für Ecoli
- tumorvermittelndes Gen eliminieren

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Aufbau eines Expressionsvektors zur Produktreinigung (wollen nur ein Protein von vielen aus Bakterium)

Es befinden sich viele verschiedenen Proteine im Bakterium und ein Wunschprotein, welches wir haben wollen. Die Zelle wird zerstört, ohne Proteine dabei zu zerstören. Mit dem Zelllysat wird eine Säulenchromatografie durchgeführt. Da sich an der Säule Nitriloessigsäue befindet, welche Histidin bindet, die sich dann mit dem Wunschgen verbinden. Mit einem Puffer wird dieses ganze Gemisch ausgewaschen und zurück bleiben unsere Wunschproteine, welche an Histidin gebunden sind. Um das Wunschgen vom Nickel zu lösen, wird dem Nickel Imidazole angeboten, zu welchem Nickel affiner ist und lieber eine Bindung eingeht. Nun haben wir ein 6xHis-tagged Protein.

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DNA-Analyse
Bestimmung einer DNA-Sequenz = Sequenzierung mit Enzym: Taq-Polymerase Richtung: 5'->3'
Bausteine: 4 Nukleotide
Für Sequenzierung: bei Einbau dd Nukleotide kommt es zum Kettenabbruch, da sich bei H keine neue Base anlagern kann.

Versuch:
1. unbekannte DNA = Matrizenstrang (die amplifiziert und denaturiert wurde)
2. wird in ein Gemisch mit "normalen" Nukleotiden gegeben.
3. dieses Gemisch wiederum wird auf vier weitere Bechergläser verteilt, die einmal ddTTP, ddGTP, ddCTP und ddATP enthalten.
4. Zugabe aller dNTPs zu allen Ansätzen
5. Zugabe der Polymerase
6. Gel-Elektrophorese mit allen vier Ansätzen 3'->5' schauen welches der Ansätze weit vorne eine Bande hat und dann nach der Reihe die Buchstaben aufschreiben welches die gesuchte Sequenz ist.

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Bearbeiten der PCR-Enden (Trimmen)

Annahme rechts und links im Wunschgen sind keine geeigneten Schnittstellen. -> Einfügen von Schnittstellen für Restriktionsenzym (hängt jedoch nur an Primer dran, bindet nicht richtig, da keine komplementären Basen vorhanden sind) macht man vor dem PCR und danach hat man an allen spezifischen PCR-Produkten links und rechts die Restriktionsenzymserkennungssepuenzen.

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Relegation

Wenn Plasmid zsmklebt (aufgrund gleicher stickt-ends)

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Selektion bei Expressionsvektoren
Ziel: Reinigung des exprimierten Proteins z.B. Insulin

1. Prokaryotische Expressionsvektoren z.B. mit GFP
Plasmid mit Markergen (Resistenz), Promotor (Anfang der Replikation), MCS mit Wunschgen und danach direkt Terminator ( Ende der Replikation). Wunschprotein mit GFP entstehen-> man sieht wo das Wunschgen enthalten ist wegen GFP auf Agarplatte

2. His-Tag-Methoden (markieren des Wunschproteins mit Histidin (AS)) -> prokaryotische Expressionsvektoren:
H2N-Wunschprotein-His-His-His-His-His-His-COOH -> Fusionsprotein (Ein Fusionsprotein (auch Hybridprotein) entsteht durch die gemeinsame Expression zweier Gene oder Genteile, die hintereinander im Genom liegen. Durch Entfernung des Stopcodons hinter dem ersten Gen oder durch eine Verschmelzung durch eine Chromosomenveränderung (z. B. eine Translokation) werden beide Gene so abgelesen, als ob es sich um ein einziges Gen handeln würde)

-> Eukaryotische Expressionsvektoren:
- retrovirale Expressionsvektoren (Animal)
- Ti-Vektor/ Ti-Plasmid (Pflanzen)

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SDS

Ribosomale Bindungsstelle -> nur bei Expressionsvektoren

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housekeeping Gene

Ein Haushaltsgen (auch englisch housekeeping gene, nicht-reguliertes Gen, konstitutiv exprimiertes Gen) ist ein Gen, welches unabhängig von Zelltyp, Zellstadium und äußeren Einflüssen exprimiert wird, im Gegensatz zu den regulierten Genen.
Haushaltsgene sind typischerweise Gene, die die Strukturmoleküle und Enzyme, die mit dem Grundstoffwechsel von Zellen zusammenhängen, beispielsweise mit dem Glukose-Stoffwechsel, codieren.[2]
Sie enthalten oft keine TATA-Box, dafür aber CAAT- oder GC-Boxen.

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Hydrolyse

Die Hydrolyse (altgr. ὕδωρ hydor „Wasser“ und λύσις lýsis „Lösung, Auflösung, Beendigung“) ist die Spaltung einer (bio)chemischen Verbindung durch Reaktion mit Wasser.[1] Dabei wird (formal) ein Wasserstoffatom an das eine „Spaltstück“ abgegeben, der verbleibende Hydroxyrest an das andere Spaltstück gebunden. Die Umkehrung der Hydrolyse ist eine Kondensationsreaktion. Sofern bei der Reaktion auch das Lösungsmittel Wasser ist, zählt die Hydrolyse zu den Solvolysen.
Allgemein gilt:
X−Y+H−OH⟶X−H+Y−OH
Hydrolyse der Verbindung XY.

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Gelelektrophorese

Moleküle sind unterschiedlich groß und damit auch unterschiedlich stark oder schwach geladen, weshalb sie sich entsprechend ihrer Ladung weiter oder kürzer durch die Gelmatrix bewegen. Das Gel selbst beeeinflusst neben der Ladung zusätzlich, wie weit sich die Moleküle bewegen, denn: lange- werden im Vergleich zu kurzen Molekülen, eher an der Bewegung gehindert. Auf diese Weise lagern sich Moleküle mit gleicher Größe bzw. gleicher Ladung in Banden zusammen.
Die DNA wird nun in die die Matrix eingebracht. Desoxyribonukleinsäure ist wegen seines Phosphats negativ mit Anionen geladen und bewegt sich folglich in Richtung der Anode.

Nochmal zur allgemeinen Übersicht:
Anionen (negativ geladen) wandern in Richtung Anode (positiv geladen)
Kationen (positiv geladen) wandern in Richtung Kathode (negativ geladen)

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ELISA

herausfinden von wunschprotein mit antikörpern die an enzym gebunden sind welches einen farbstoff in einen anderen umwandeln kann

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Antikörper

https://www.antikoerper-online.de/images/news/resources_antibody_1_de.jpg

FUNKTION
Im Verlauf einer Immunantwort erfüllen Antikörper verschiedene Funktionen. Sie dienen zum einen dazu eingedrungene Antigene abzufangen und zu blockieren, so dass sie ihre schädliche Wirkung nicht entfalten können, oder es wird verhindert, dass das Antigen mit Körperzellen interagiert (z.B. wird das Eindringen von Viren und Bakterien in Körperzellen verhindert).
Antikörper dienen auch der Opsonierung von Krankheitserregern. Hier stellen die Antikörper eine Markierung, z.B. für Phagozyten (Fresszellen), dar. Die Phagozyten treten mit den konstanten Bereichen des Antikörpers in Kontakt und werden dazu veranlasst den Erreger (z.B. ein Bakterium) aufzunehmen und zu verdauen.
Antikörper können auch an Körperzellen binden und dadurch so genannte NK-Zellen (natürliche Killerzellen) veranlassen, die Zelle selektiv abzutöten. Das ist dann sinnvoll, wenn eine Zelle mit einem Erreger (z.B. einem Virus) infiziert ist. Weitere wichtige Funktionen sind die Aktivierung verschiedener Zelltypen des Immunsystems und des Komplementsystems.

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Chromatographie

Die Chromatographie lässt sich am einfachsten durch einen Vergleich erklären:

Ein reißender Fluss kann einiges an Treibgut mit sich führen. Die Geschwindigkeit, mit der das Treibgut weiterbewegt wird, hängt ab

von der Art des Treibguts (Sandkörner werden schneller als Kieselsteine transportiert),
von der Beschaffenheit des Flussbetts (raue Oberflächen erhöhen die Reibung des Treibguts und verringern somit die Geschwindigkeit des Abtransports)
von der Strömungsgeschwindigkeit.
In der Chromatographie werden unterschiedliche Substanzen (= Treibgut) in der so genannten mobilen Phase (= Wasser) auf einer stationären Phase (= Flussbett) befördert. Aufgrund der Wechselwirkungen (siehe die Einteilung unter Trennprinzipien) zwischen der Probe, der stationären Phase und der mobilen Phase werden einzelne Substanzen unterschiedlich schnell weitertransportiert und somit voneinander getrennt: Ein Gemisch aus Sand, sehr kleinen und etwas größeren Kieselsteinen wird an einer Stelle des Flusses eingebracht; nach beispielsweise hundert Metern kommt zuerst der gesamte Sand an (verteilt auf ein paar Meter) und nach einer gewissen Wartezeit kommen alle kleineren Kieselsteine und noch viel später die größeren, jeweils auf eine gewisse Strecke auseinandergezogen.

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cAMP

Cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein biochemisch vom Adenosintriphosphat (ATP) abgeleitetes Molekül, welches als Second Messenger bei der zellulären Signaltransduktion dient und insbesondere zur Aktivierung von Proteinkinasen führt.

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Signaltransduktion

die gesamte Signalkette von der Erkennung (Bindung) des Signals am Rezeptor bis zur Zellantwort wird als Signaltransduktion bezeichnet.

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Genexpression

Genexpression, auch kurz Expression oder Exprimierung, bezeichnet, im weiten Sinn, wie die genetische Information – eines Gens (Abschnitt der DNA) – zum Ausdruck kommt und in Erscheinung tritt, also wie der Genotyp eines Organismus oder einer Zelle als Phänotyp ausgeprägt wird. Im engeren Sinn wird unter Genexpression die Biosynthese von Proteinen (siehe Proteinbiosynthese) anhand der genetischen Information mitsamt allen dafür nötigen vorangehenden Prozessen verstanden, beginnend mit der Transkription als Synthese von RNA.

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Metabolit

Der Metabolit (griechisch μεταβολίτης metabolítes ‚der Umgewandelte‘, Plural: Metaboliten) ist ein Zwischenprodukt (Intermediat) in einem meist biochemischen Stoffwechselweg.

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Konjugation (natürlicher Gentransfer bei Bakterien)

Konjugation (lateinisch coniugare paarweise zusammenbinden) bezeichnet in der Mikrobiologie die Übertragung von Teilen des Genoms von einer Spenderzelle (Donor) auf eine Empfängerzelle (Rezipient) durch direkten Zellkontakt.

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F-Plasmid

Das F-Plasmid (Abk. für Fertilitätsplasmid, auch Fertilitätsfaktor genannt) ist ein Plasmid, das Bakterien die Fähigkeit zur Konjugation (horizontaler Gentransfer) verleiht. Das F-Plasmid ermöglicht einen gerichteten Gentransfer vom Spender (dieser besitzt den F-Faktor, wird auch als F+ bezeichnet) zum Empfänger (F−). Dabei wird auch das F-Plasmid selbst mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf den Empfänger übertragen. Dadurch wird der Empfänger (Rezipient) ebenfalls zu einem Spender (Donator). Daher sind alle Bakterienzellen, die ein F-Plasmid besitzen, potenzielle Spenderzellen.

60

R-Plasmid

Resistenzplasmid

61

Hfr-Zellen

entsteht durch Integration des F-Plasmids (als Episom) in das Chromosom

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Inkubation

hhg

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Virulenz

Virulenz w [Adj. virulent], die Fähigkeit von Krankheitserregern (Viren, Bakterien, Protozoen, Pilze), eine Erkrankung im befallenen Organismus hervorzurufen. Die Virulenz ist Ausdruck der Wechselbeziehungen zwischen Erreger (Pathogene) und Wirtsorganismus. Sie wird bestimmt durch im Genom des Erregers codierte Virulenzfaktoren (Virulenzgene), die dem Erreger die Fähigkeiten verleihen, sich in Geweben des Wirts zu vermehren und auszubreiten, die Immunantwort des infizierten Wirtsorganismus zu vermindern sowie toxische Substanzen zu bilden

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T-Phagen

T-Phagen sind Viren, die sich als Bakteriophagen auf den ausschließlichen Befall von Escherichia coli Darmbakterien spezialisiert haben (Coliphagen) Quelle: http://symptomat.de/T-Phagen

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virulente Phagen

vernichten durch ihre Vermehrung die Wirtszellen

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lytischer Phagenzyklus

Der lytische Zyklus beschreibt bei Viren die Entwicklungsphase, in der die Wirtszelle lysiert wird, nachdem neue Virionen gebildet wurden. Dabei entsteht ein zytopathischer Effekt. Einen Grenzfall bilden Viren, die im lytischen Zyklus ihre Wirtszelle erhalten, da sie sich direkt an die Zellmembran anlagern und unter Abschnürung eines Vesikels die Wirtszelle verlassen (Knospung nicht-lytischer Viren).

67

lysogener Phagenzyklus

Der lysogene Zyklus erhält dagegen die Wirtszelle und ist meistens mit einer verminderten Synthese viraler Gene verbunden und wird gelegentlich auch als Ruhephase oder latente Phase bezeichnet. Viren mit einem heftigen, aber transienten Infektionsverlauf besitzen meist keinen lysogenen Zyklus (engl. hit and run viruses).

68

Transduktion

Als Transduktion wird in der Genetik der Gentransfer zwischen Bakterien durch Viren bezeichnet. Dabei werden meistens virale, aber gelegentlich auch bakterielle Gene übertragen, ohne dass Bakterien Kontakt miteinander haben. Die Infektion von Zielzellen mit viralen Vektoren wird ebenfalls als Transduktion bezeichnet, wobei auch hier fremde Gene mit Hilfe von Viren übertragen werden.
Die Transduktion ist neben der Transformation und der Konjugation eine von drei Möglichkeiten des natürlichen Gentransfers bei Prokaryoten.

69

spezielle Transduktion

erfolgt im lysogenen Vermehrungszyklus die Integration der transduzierenden Phagen immer an der selben Stelle des Bakteriengenoms, so können nur die der Integrationsstelle unmittelbar angrenzenden Gene durch Transduktion übertragen werden.

70

allgemeine Transduktion

die Integration anderer temperenter Phagen kann an beliebigen Stellen des Wirtsgenoms erfolgen, weshalb dies Phagen beliebige bakterielle Gene durch Transduktion übertragen können.

71

Polylinker

Ein Polylinker oder auch Multiple Cloning Site (MCS) ist ein künstlich geschaffenes DNA-Oligonukleotid aus rund 50bp, welches in ein Plasmid eingesetzt wurde und dessen Sequenz direkt hintereinander verschiedene Restriktionsschnittstellen für Restriktionsendonukleasen enthält.
Der Polylinker bietet die Möglichkeit mit Hilfe von Restriktionsenzymen Fremd-DNA in das Plasmid einzubauen. Er liegt in einem Bereich der keine essentielle Funktion für das Plasmid hat. Der wiederholte Einbau von Fremd-DNA an derselben oder nahezu selben Stelle ist möglich.

72

Oligonukleotide

Oligonukleotide (von griechisch oligo ‚wenige‘) sind aus wenigen Nukleotiden (DNA oder RNA) aufgebaute Oligomere. Die Nukleotidsequenz besteht für viele der Anwendungen zwischen 15 und 30 Nukleotideinheiten.

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cDNA

Die cDNA (englisch complementary DNA, deutsch komplementäre DNS) ist eine DNA, die mittels des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA (wie mRNA und ncRNA) synthetisiert wird. Anwendung findet die cDNA in der Molekularbiologie, Transkriptomanalyse sowie in der medizinischen Diagnostik.

74

genomische Genbank

Eine Genbibliothek, auch genomische Bibliothek, DNA-Bibliothek oder Genbank, beherbergt das gesamte Genom eines Organismus in Form von definierten DNA-Teilstücken auf Vektoren in einzelligen Träger-Organismen oder Phagen. Diese Träger-Organismen dienen der Speicherung und Vervielfältigung der Fragmente zum Zweck molekularbiologischer Untersuchungen.

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cDNA-Genbank

huhuun

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Verwendung Genbanken

genomische Genbank:
-gesamte dna notwendig
-bei nicht transkribierten sequenzen (enhancer, silencer)
-suche nach intronsequenzen

cDna-Genbank:
-bei suche nach exprimierten genen

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Screening

juhu

78

His-tag-methode

huhzgz

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retrovirale Vektoren

-bei Tieren
-retrovirales wird zu retroviralem vektor, indem die bestandteile für neuen virus durch markergen und transferiertes gen ersetzt werden (wollen nicht dass zelle krank wird) -> liegt als ssRna in virus vor + Integrase(codiert für enzym welches wunschgen in dna einfügt) und reverse transkriptase(macht aus rna einzelstrang einen dna doppelstrang)

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Ti-Plasmid

-bei Pflanzenzellen genutzt
-tumorvermittelnde gene müssen eliminiert werden
-Fremdgen
-Markergen für Pflanze
-Markergen für E.coli

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sds-page

junu

82

western blotting

nhu

83

Affinitätschromatographie

huhu

84

Sanger-Sequenzierung
Kettenabbruch-Methode

4 verschiedene Ansätze mit einmal dATP, dCTP, dGTP, dTTP und entweder ein ddGTP oder ddATP oder ddTTP oder ddCTP mit Primer und dem gewünschten einsträngigen DNA fragment durch eine Kapillarelektrophorese in einer Kapillare werden die kleinsten dna stücke ganz oben nah am + pol sein und das längste unten. Mit Hilfe eines Laserstrahls wird eine Photodetektion gemacht, bei der die verschiedenen Ausschläge die jeweilige Base bedeuten

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Autoradiogramm

Exposition des Filters (Röntgenfilm oÄ)

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Western Blot -> Übertragung von Proteinen auf einen Filter
Southern-Blot-> DNA wird übertragen
Northern-Blot-> RNA wird übertragen

Ablauf: