M3 Imagerie fluorescence Flashcards
Les molécules capables d’émettre de la fluorescence? composition?
fluorophores (=fluorochromes)
groupe aromatique + dbles liaisons
FRET
Repose sur un transfert energétique entre deux fluorophores. L’énergie émise par le 1er fluorophore va servir d’excitation pour le 2ème fluorophore (si suffisamment proches). On excite donc le 1er pour mesurer l’émission du 2ème.
Sonde AMPc composition
composée d’un domaine qui lie l’AMPc et de deux fluorophores (CFP et YFP)
–> Sonde ratiométrique car calcul du ratio de fluorescence
Sonde AMPc principe détaillé
Lorsque la sonde n’est pas liée à l’AMPc, les fluorophores sont suffisamment proches pour qu’il y ait FRET lorsque l’on excite CFP
Lorsqu’il y a de l’AMPc produit, la sonde va lier l’AMPc et changer de conformation. De ce fait, il n’y aura plus de FRET et par conséquence YFP ne sera plus excité par CFP
Lorsque CFP sera excitée on aura une émission lumineuse de CFP à une longueur d’onde (qui correspondra à sa longueur d’onde maximal)
–> Sonde ratiométrique car calcul du ratio de fluorescence
Sonde AMPc principe détaillé
Lorque la sonde n’est pas liée à l’AMPc, les fluorophores sont suffisamment proches pour qu’il y ait FRET lorsque l’on excite le 1er F.
Lorsqu’il y a de l’AMPc produit, la sonde va lier l’AMPc et changer de conformation. De ce fait, il n’y aura plus de FRET et par conséquence F2 ne sera plus excité par F1
Lorsque F1 sera excitée on aura une émission lumineuse de F1 à une longueur d’onde (qui correspondra à sa longueur d’onde maximal)
Décalage de Stokes
Après excitation du fluorophore: passage d’un état fondamental à un état excité (spectre d’excitation du fluorophore),
le décalage de stoke correspond à une perte d’énergie durant la RELAXATION VIBRATIONNELLE qui le fait passer d’un état excité instable à un état excité semi-stable.
Le retour à l’état fondamental s’accompagne d’une émission de photons (spectre d’émission du fluorophore)
Décalage de Stokes
Après excitation du fluorophore: passage d’un état fondamental à un état excité (spectre d’excitation du fluorophore),
le décalage de stoke correspond à une perte d’énergie durant la RELAXATION VIBRATIONNELLE qui le fait passer d’un état excité instable à un état excité semi-stable.
Le retour à l’état fondamental s’accompagne d’une émission de photons (spectre d’émission du fluorophore)
que se passe-t-il pendant la ELAXATION VIBRATIONNELLE ??
perte d’énergie sous forme de chaleur
quels sont les différents filtres?
- Short Pass (passe bas):laisse passer les longueurs d’ondes courtes: ex short pass 500 laisse passer la lumière jusqu’à 500
- Long Pass (passe haut): laisse passer les longueurs d’ondes longues: ex long passe 600 ne laisse passer qu’après 600
- Band-Pass (passe bande): Laisse passer un intervalle de longueurs d’ondes
Le photoblanchiment?
quand on excite trop longtemps le fluorophore, il se dégrade à cause de l’oxygène
Sonde ratiométrique DEF? NOMS?
Le ratio (R) sonde liée sur sonde libre (c’est à dire F410/F480 pour Indo-1 ) est proportionnel à la concentration en calcium dans les cellules.
Sonde ratiométrique?
Le ratio (R) sonde liée sur sonde libre (c’est à dire F410/F480) est proportionnel à la concentration en calcium dans les cellules.
Indo-1? fonctionnement
- La sonde Indo-1 est une sonde/bio-senseur calcique ratiométrique (mono excitation, double-émission).
Quand Indo-1 excitée à 340nm: - la sonde LIBRE de calcium émet une fluorescence à 480nm,
- la sonde LIEE au calcium émet de la fluorescence à 410nm.
–> on mesure ensuite le ration F410/F480
FURA-2?
Possède 2 longueurs d’onde d’excitation et une longueur d’onde d’émission.
Les valeurs des longueurs d’onde d’excitation sont de 340nm et 380nm,
la longueur d’onde d’émission est à 510 nm.
mode d’action de la sonde FURA-2
- -> Excitable à 380nm ( liée au calcium),
- -> Excitable à 340nm (NON lié).
Dans les deux cas, Fura-2 émet à 510 nm.
–>mesure à 380 et 340 (excitation/émission) –> ratio
