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Flashcards in Méthodes d'étude Deck (77):
1

Filtration sur tamis : cellule, acellulaire et aseptique

cellule : 20 à 100 micromètres
Acellulaire : 0,4 micromètres
Aseptique : <0,2 micromètres

2

Centrifugation

V= (d^2(p-p0)g)/18n

3

Ultracentrifugation

20 000< 500 000G

4

Séparation zonale :
Sépare selon ?
Pratique pour séparer ?
Durée ?
Gradient ?

Selon la taille
Protéines, acides nucléiques, organites
Durée déterminée
Le plus souvent gradient préformé

5

Gradient zonale préformé, différents types

Naturel (Glucose, saccharose) -Favorables à la prolifération des bactéries- ou synthétique (Percoll, Ficoll)

6

Séparation isopycnique :
Sépare selon ?
Pratique pour séparer ?
Durée ?
Gradient ? (2exemples)

Sépare selon la densité
Macromolécules, protéines, acides nucléiques
Durée finie
Gradient automatiquement autoformé, exemples :
LiCl pour les lipoprotéines
CsCl2 pour l'ADN

7

Fractionnement total --> protocole de De Duve, 1ère étape

Homogénéisation pour perforer la membrane plasmique (sucrose C=0,25mol.L isotoniique)

8

Protocole de De Duve
Culot 1

NOYAUX : 800G pendant 10min

9

Protocole de De Duve
Culot 2

MITOCONDRIES, LYSOSOMES, PEROXYSOME : 12 000G pendant 20min

10

Protocole de De Duve
Culot 3

MICROSOMES, MEMBRANES : 50 000G pendant 2h

11

Protocole de De Duve
Culot 4

RIBOSOMES : 300 000G pendant 3h

12

Fractionnement partiel, quand ?

Après le protocole de De Duve

13

Fractionnement partiel, culot 2
Chloroplastes

Isopycnique de sucrose 24h à 65 000G
Chloroplaste : Percoll

14

Cytométrie de flux, en fonction de ?

En fonction de la taille ou en fonction d'un immunomarquage

15

*Milieu de culture, facteurs de croissance (2 types + exemples)

Géréraux : sérum de veau foetal
Spécifiques : VGET pour les cellules endothéliales vasculaire
FGF pour les fibroblastes

16

Atmosphère pour la mise en culture

5% de CO2
95% d'O2
100% d'humidité

17

* Ensemencement inoculum, 2 endroits

Fioles (cellules non adhérentes)
Boites + collagène ou fibronectine

18

Durée de la primo-culture ? Repiquage max combien de fois ? Sauf

7 à 15 jours, repiquage max 10 fois sauf hépatocytes (24 à 48h max)

19

Cultures organotypiques, qu'est ce que c'est ?

Quand la culture cellulaire se rapproche au plus de l'organe

20

Exemple de co-culture

Média artérielle où on fait pousser des cellules endothéliales vasculaires sur des cellules musculaires

21

Quel type de cellules croissent en îlots et à confluence créées une inhibition de contact ?

Cellules endothéliales

22

Etablissement d'un clon, exemple de l'utilisation de...

De lymphocytes B

23

Fusion, nom des produits ?

hybridomes ou hybrides

24

Fusion : 2 exemples

Lymphocyte B (=plasmocyte) + cellule tumorale (comme une myéloïde)

25

Transfection : but ?

Augmenter l'expression d'un gène, l'inhiber ou exprimer une molécule

26

Méthodes de transfection

* Directe au phosphate de calcium (créé un précipitant liant l'informatique génétique qui va être endocyté)
* Electroporation (modifie l'organisation des lipides)
*Lipofection (met en jeu des lipides qui interagissent avec le matériel génétique chargé formant un liposome endocyté)

27

Applications (x3)

Méthode GFP (green fluorescent protein)
-Protéine chimère, méduse, structure en tonneau, chromophore (ser gly tyr)

ARN interférents (siRNA) : inhibition de l'expression d'un gène

Cellules germinales > principe des OGM -exemple : souris knock out-

28

Vérifications (x2)

- Genotypage (vérifier la présence ou non de la séquence d'intérêt de l'ADN par PCR ou séquençage)
-phenotypage : expression de la protéine par extraction

29

Microscopie, pouvoir de résolution, formules

D = langda/2nsina

30

Pouvoir de résolution - relation avec la limite de résolution D

Le pouvoir de résolution est inversement proportionnel à la limite de résolution D

31

Pouvoir de résolution de l'oeil humain ? du microscope photonique ? du microscope électronique ?

0,2mm
0,2 micromètres
0,2 nm

32

Colorants vitaux : exemple ? pour repérer ?

Le rouge neutre pour repérer les vacuoles

33

Colorants histologiques (MO)

Hemalum basique violet noyaux (ADN)
Eosine acide Rose/Rouge cytosol (protéines)
Safran basique Jaune/Orange collagène (MEC)

34

Colorant pour repérer les noyaux (l'ADN) + couleur

Hemalum (violet)

35

Colorant pour repérer les protéines + couleur

Eosine (Rose/Rouge)

36

Colorant pour repérer le collagène

Safran (Jaune/Orange)

37

Fluorescence

Longueur d'onde d'émission > longueur d'onde d'excitation

38

Fluorescence détectable eu ?

MO + confocal

39

Fluorescence, protéines : 2 produits + couleur de chacun, + processus

FITC marque en jaune/vert
Rhodamine marque en rouge
Par reconnaissance anticorps/antigène ou par liaisons covalentes

40

Fluorescence, ADN : 2 produits + couleur de chacun + processus

Bromure d'éthidium marque en orange (intercalent incorporé lors de la réplication)
DAPI marque en bleu

41

Microscopie optique, possibilité d'observer des préparations colorées ?

Oui

42

Microscope bi-photonique (=confocal), on peut observer n'importe quel objet ?
Particularité

Objet EPAIS (marqué par un fluorochrome
Image 3D

43

Microcopie à fond clair, particularité, préparations colorées ?

Préparations colorées ou non
Utilisation d'une huile à immersion possible (qui augmente l'indice de réfraction)

44

Méthode commune pour la microscopie optique

1) Fixation à l'éthanol, au glutaraldéhyde ou au formol puis déshydratation (bains d'alcool de concentrations croissantes) puis bain de toluène pour éclaicir
2) Imprégnation à chaud avec de la paraffine
3) Inclusion dans la paraffine pour rigidifier et faciliter la coupe
4) Coupe grâce à un microtome (4-5micromètres)
5) Marquage (simple à triple)
6) Montage

NB : toutes les méthodes peuvent être automatisées

45

Méthode pour la microscopie électronique

1) Fixation, tetraoxyde + osmium OsO4
- pas d'imprégnation -
3) Inclusion (résine époxy, pas de paraffine)
4) Coupe au couteau à diamant 30nm
- pas de marquage -
5) Montage

46

Microscope électronique, MET, méthodes

Cryofracture : congélation rapide après inclusion pour observer les structutres subcellulaires (+ ombrage métallique)
Cryodécapage : après cryofacture : sublimation sous vide et ombrage au platine déposé sur un film de carbone (on observera la réplique métallique)

47

MEB résolution ?
Meilleure ou pire que celle du MET ?

20nm
moins bonne maus vue 3D

48

Marquage et immunomarquage, or colloïcal

Méthode enzymatique pour détecter la présence du sbustrat
Détection au ME ou MO

49

Anticorps monoclonal méthode pour le créer

Récupérés à partir de l'ascite ou grâce à la production d'hybridomes

50

Anticorps polyclonal méthode pour le créer

A partir de sérum (= fraction de sang coagulé)

51

Spécificité anticorps monoclonal ? Polyclonal ?

Chromatographie d'affinité
Chromatographie échangeuse d'ions

52

Test après purification

Western blot > spécificité
Titrage > affinité

53

Méthodes directes (immunologie)

Fluorochrome
Enzyme
Particule d'or

54

Méthode indirecte (immunologie)

Anticorps primaire souvent monoclonal (reconnait par son fragment FAB)
Anticorps secondaires reconnaissent par FC puis on revient aux méthodes directes (enzyme = peroxydase de Raifort HRP, béta-galactosidase ou phhosphatase alcaline)

55

Lyse des cellules

3 méthodes :
Sonification (ultrasons)
Lyse alcaline (soude, ammoniac) à pH basique
Lyse enzymatique (protéases ou lysosymes)

56

Solubilisation, protéines intrinsèques

Détergents amphiphiles (tête hydrophile)

57

Solubilisation, protéines intrinsèques +

Chlorure de benzaldénium

58

Solubilisation, protéines intrinsèques -

Desoxycholate de sodium

59

Solubilisation, protéines intrinsèques 0

CHAPS

60

Solubilisation, protéines intrinsèques non chargé

n-octylglucopyranoside

61

Protéines méthodes non dénaturantes

Sels neutre
Point isoélectrique

62

Rappel : anode + ou - ?

+

63

Etudes des protéines par électrophorèse, ME (mobilité) = ?

ME = Q/viscosité = Q/rayon de Stocks

64

SDS page

agent anionique, garde que la structure primaire, 5min à 100°C
NB : SDS = sodim dodécylsulfate = laurylsulfate

65

Coloration des gels : Protéines ? ADN ? AA, oses, nucléotides ?

Protéines : bleu de coomassie
ADN : BET
AA, etc : précurseur radiomarqué

66

Révélation électrophorèse : protéines

Pour les protéines : western blot
1) SDS PAGE
2) Electro-transfert
3) Immuno-blot

67

Révélation électrophorèse : acides nucléiques

Southern blot pour l'ADN
Northern blot pour l'ARN

68

Patch clamp

enregistre les courants ioniques à travers les canaux membranaires
- Solution à l'intérieur = agoniste ou antagoniste des récepteurs-canaux

69

Indicateurs fluorescents pour l'étude des concentrations en ions

Dosage Ca2+ cytosolique (méthode au fura-2)
1 molécule de fura-2 > 1 seul Ca2+
Dosage des H+

70

"pulse"

Incorporation de précurseurs marqués (incubations)

71

3H-thymidine

nucléoside marqué = tritum, incorporer dans l'ADN avant les mitoses
rayons béta

72

3H ou 14C-leucine

Pour étudier la trauction et la localisation des protéines
rayons béta

73

32P

--> Acides nucléiques (ADN, ARN) + phosphorylation des protéines
rayons béta

74

35S-met

rayons gamma

75

"chase"

Incorporation de précurseurs non radioactifs

76

"chase" exemples (x2)

alpha-amanithine --> transcription
cycloheximide --> traduction

77

Angle du rotor

15 a 35°