Sequenciamento Automatizado - Etapas da Técnica Flashcards
Técnicas - Etapas 6
1- Reação de PCR para o Sequenciamento
2- Precipitação da Reação de Sequenciamento
3- Preparação da Amostra para o Sequenciamento
4- Sequenciamento
5- Fragmentos são separados por cromatografia em gel (tubo capilar).
6- Detecção ocorre a partir de laser de argônio.
1-Reação de PCR para o Sequenciamento - O que ocorre? 2
TAQpol → no momento que adiciona um dDNTP → para → se liga a outro → e polimeriza um novo fragmento.
No final → obteremos fragmentos com tamanhos diferentes → que estarão sujos
1-Reação de PCR para o Sequenciamento - Problema
Dentro do tubo → também teremos tranqueiras indesejáveis e que podem dar problema na hora do resultado (restos de primer…) → então temos que limpar.
1-Reação de PCR para o Sequenciamento - Para limpar:
Precipitação da Reação de Dequenciamento
2-Precipitação da Reação de Sequenciamento - Função 2
Preservação dos Capilares do Sequenciador
Garantir a Qualidade das Sequências Produzidas
2-Garantir a Qualidade das Sequências Produzidas - Importância
Evitar que o equipamento entre em pane
2-Precipitação da Reação de Sequenciamento - O que é retirado? 3
Restos de Primer
ddNTPs
Alguns Sais
2-Precipitação da Reação de Sequenciamento - Importância
Tubo → deve conter somente os fragmentos → que vão estar na forma de fita dupla → e eles devem estar na forma de fita simples.
3-Preparação da Amostra para o Sequenciamento - Função
Desnaturação da Dupla Fita de DNA → com formamida e alta temperatura (70ºC/10m) → obtendo vários fragmentos de fita simples.
3-Preparação da Amostra para o Sequenciamento - Fragmentos Obtidos 2
Maiores
Menores → mais leves → vão na frente
3-Fragmentos de Dupla Simples - O que ocorre após a sua obtenção?
Sequenciamento.
4-Sequenciamento - Como é realizado?
Eletroforese por capilares
