Tema 4. CRISPR-Cas Flashcards
¿Qué son los sistemas CRISPR-Cas?
Son sistemas genéticos, que confieren resistencia frente a DNA o RNA exógeno procedente de virus o plásmidos. Presente 2 componentes:
a) Locus cas: da lugar a proteínas Cas, las cuales están asociadas a CRISSPR
b) Locus CRISPR: son repeticiones palindrómicas cortas regularmente espaciadas y agrupadas
Los espaciadores son secuencias que se parecen a secuencias de virus
Cuando una infección no acaba en lisis, la célula puede coger un segmento del virus e incorporarlo entre 2 repeticiones quedándose con un elemento identificativo del virus. Esto se hereda tras cada división celular.
La expresión del locus-CRISPR genera un pre crRNA y las proteínas Cas se encargan de individualizar estos crRNA. Luego un virus infecta a la bacteria, la secuencia homóloga del crRNA como es complementaria al DNA del virus lo bloquea.
¿Cómo se clasifican los sistemas CRISPR?
Hay 6 tipos de sistemas en 2 clases. En la clase 2 se encuentra la Cas9, que solo van a utilizar una proteína para llevar a cabo la interferencia y la rotura del invasor. Mientras que la clase I necesita un complejo de proteínas para llevar a cabo el reconocimiento del fago, interferencia y destrucción
¿Cómo es el sistema CRISPR-Cas de Tipo II de la bacterias Streptococcus pyogenes?
El trans-activating crispr RNA contiene 2 promotores en sentido contrario
Primero, la proteína Cas9 interacciona con el tracrRNA y la RNAasa III formando un complejo. La RNAasa III corta y da lugar a estructuras proteicas que se quedan con un trozo de tracrRNA, el cual hibrida con el crRNA. Después, unas proteasas cortan dando lugar al crispr cas maduro el cual puede identificar y cortar la diana (donde haya complementariedad con el espaciador)
Para que el complejo llegue a la diana (en este DNA invasor), el espaciador debe reconocer a su secuencia complementaria e hibridar, y además, para que la bacteria no corte su propio DNA, debe cumplirse que al lado de la secuencia complementaria diana haya una secuencia PAM. Entonces, el complejo de interferencia cortará. Se produce un lazo RNA-DNA y se corta 8corte de doble cadena)
¿Cómo es una endonucleasa de diseño basada en el sistema CRISPR-Cas de tipo II?
La secuencia PAM debe estar aguas abajo. Para facilitar el corte, sería más fácil si en vez de suministrar el crRNA y el tracrRNA por separado, se suministraran juntos. Este contiene el DNA espaciador
Es un sistema bacteriano de inmunidad contra DNA foráneo que se basa en una nucleasa (Cas9). La identificación de la secuencia donde va a cortar no depende de un dominio de unión a DNA sino de una molécula de RNA. Solamente tendremos que modificar una secuencia de DNA que cuando se transcriba de lugar al RNA necesario
Para cada experimento solamente hay que cambiar ese vector de DNA, por lo que tiene la ventaja de que depende de una única proteína y de una molécula de RNA, fácil de sintetizar, más barato y sencillo
¿Cuáles son los motivos de corte en la endonucleasa Cas9?
Cas9 puede producir 2 cortes, ya que tiene dos dominios que pueden actuar como nucleasas: RuvC y HNH (corta en la cadena donde se produce la hibridación entre el DNA diana y el guía). Se diferencia de los ZFN en que aquí lo que te lleva al DNA es el RNA guía, fácil de sintetizar. No hace falta sintetizar 2 proteínas para cada cadena al tener 2 dominios nucleasa
Las nikasas son variantes que solamente cortan en una cadena, según se elimine RuvC o HNH. Sirven para eliminar los cortes no deseados, es decir, fuera de la diana
Las deadCas9 no cortan en DNA, sino que sirven para reconocer sitios del DNA. También se puede fusionar a un activador de la transcripción y llevarlo donde se quiera. Se puede usar Cas9 para múltiplex (que reconoce varios sitios del genoma)
¿Cómo es el corte del DNA diana por la endonucleasa Cas9?
Se dedujo que los cortes no eran romos, sino que había una diferencia de un par de bases quedando extremos escalonados (cohesivos)
¿Cómo se edita el genoma con Cas9, RNA guía y DNA donante?
La Cas9 se puede suministrar en forma de DNA, RNA o riboproteína
Una vez tenemos el corte de doble cadena, lo demás depende de los mecanismos de reparación de la célula. Se suministra un DNA molde que medie la recombinación homóloga para que la región cortada se sustituya por el DNA molde. Esto permite eliminar una mutación o bien introducir otra
¿Cómo son los ingresos en el mercado de CRISPR-Cas?
El uso de la tecnología CRISPR ha permitido un gran aumento de los ingresos percibidos por las empresas
