BCM328 - Examen de laboratoire

Question 1

Qu’est-ce qu’est la précipitation au sulfate d’ammonium?

Answer 1

Technique facile basée sur la différence de solubilité des protéines en présence d’un sel, ce qui donne une précipitation différentielle de protéines dans un échantillon.

Question 2

Pourquoi on utilise plus communement le sulfate d’ammonium comme sel dans une précipitation au sel?

Answer 2

-très peu couteux
- très soluble, même à fortes concentrations.
-dissolution n’affecte pas la température
-Ne dénature pas les protéines

Question 3

Le sulfate d’ammonium induit l’agrégation et la précipitation des protéines en…….

Answer 3

Réduisant leur solubilité par:
1) Une compétition pour les molécules d’eau dispo en solution
2) Neutralisation des résidus chargés à la surface des protéines.

Question 4

Avantages de la précipitation au sulfate d’ammonium?

Answer 4

-méthode de purification efficace
-permet d’éliminer certaines protéines indésirables
-enlever des produits solubles non-voulus
-Concentrer l’échantillon
-Maintient de l’activité biologique + conformation des protéines.

Question 5

Explique la méthode de précipitation au sulfate d’ammonium.

Answer 5

-Ajouter lentement et graduellement du sel jusqu’à une certaine concentration qui ne cause pas la précipitation de la protéine.
-Les autres protéines qui précipitent à cette concentration sont éliminés (centri)
-Le surnageant qui contient le produit soluble = éliminé
-Culot qui contient protéine d’intérêt = conservé

Question 6

precipitation au sulfate d’amonium (NH4)2SO4

Answer 6

-première étape dans l’isolement d’une protéine
-basée sur la difference de solubilité des protéines en présence d’un sel
-en augmentant la concentration de sel = précipitation différentielle des protéines retrouvés dans l’échantillon
-méthode de purification = élimine protéines indésirables , enlève produits solubles non-désirés et concentre l’échantillon.

Question 7

Caractéristiques du sulfate d’ammonium

Answer 7

• Très soluble
  -Sa dissolution ‘affecte pas la température de la sol.
  -Ne dénature pas les protéines
  -Induit l’agrégation + précipitation des protéines en réduisant leur solubilité par:
  1) Compétition pour les molécules d’eau dispo en sol (déshydratation)
  2) Neutralise résidus chargés à la surface des protéines.

Question 8

Méthode: Sulfate d’ammonium

Answer 8

Ajouter lentement + graduellement jusqu’à certaine concentration qui ne cause pas la précipitation de la protéine d’intérêt.
-Incubation sur glace
-centrifugation (élimination d’autres protéines qui précipitent)
-Ajout d’une concentration qui va causer la précipitation complète de la protéine (présente dans le culot )
-ce culot est dissout dans un tampon faible en sel (tampon tris).

*NOTE: Pour la methode sulfate d’ammonium (albumine): 1. Précipation à 20% de saturation. 2. Précipation à 50% de saturation. 3. Précipation à 100% de saturation. Les étapes ci-dessus sont effectuer avec les 3 précipitations.

Question 9

Colonne de desselage (6)

Answer 9

1. type de chromatographie d’exclusion (ex: Cytiva PD.10)
2. utilisé pour éliminer les sels d’une solution protéique.
3. molécules separés sur la colonne en fonction de leur taille et leur forme
4. les molécules plus que 6kDa sont exclue de la matrice et seront eluées en premier dans le volume mort (V0).
5. les petites molécules (sulfate d’ammonium ) sont incluses dans le gel et seront retardées pour être eluées.
6. but = enlever sulfate d’ammonium dans solution d’albumine.

Question 10

Comment vérifier l’efficacité de la colonne de desselage?

Answer 10

-Conductimètre (mesure de la capacité d’un liquide à faire passer un courant électrique). La valeur augmente en fonction de la concentration des constituants ionisés.
uS par cm (micro-siemens).