Cours 1 Flashcards
Qu’est ce qui est nécessaire à la purification d’une protéine
-Enrichissement immense
Quelle est la première étape de la purification des protéines?
-Les dissoudre dans une phase liquide
-protéines doivent généralement être libre des cellule
- libération demande la lises des cellules
Quelle est la décision nécessaire avant d’effectuer la lyse d’une cellule pour la purification de protéine?
- Protéine intacte(étudier la fonction des protéines)
- dénaturer les protéines (pour l’extraction d’ADN ou ARN)
Quelle sont les méthode de désintégration mécanique?
- Déchiquetage mécanique (blender)
- broyage
- Homogénéisateur(Potter et Téflon)
- Rupture par haute pression(disrupteur de cellules de type French press)
- sanitation par vibration ultrasonique
- Cryolyse
Lyse osmotique
- method la plus douce pour la lyse osmotique
- Cellule en solution hypotonique([solution]<[cellule])
- résulte en pression osmotique = gonflage puis l’éclatement de la cellule
- Cellule simple, par de paroi, souvent animal
Méthode de solubilisation lors de paroi cellulaire
- utilisation d’une enzyme qui dégrade les parois cellulaire (p.ex: lysozyme)
- Double action: dégrade paroi et perturbe ;a membrane
- Une fois cellule est brisé, le lisant obtenu peut être filtré ou centrifugé pour enlever le débris cellulaire
Experience ADN- PCR
Facteur qui affect l’intégrité structurale et leur stabilité
pH: maintenir le pH dans la zone Physiologique (6.5-8)
Température : Dénaturées à haute températures, dénaturation lente possible à 25°C, purification à 0-5°C, protéine conservé à -20 à -80°C
Protease: enzyme qui hydrolyse les liens peptique, libéré pendant lyse de la cellule, on ajout des inhibiteurs protées
C’est quoi des méthode de fractionnement?
Utilisée les propriétés physico-chimiques deb la protéine pour l’isolement progressive des autre substance chimique.
Les propriétés exploité sont:
- solubilité (précipitation)
- charge ionique (Chromatographie par échange d’ions , l’électrophorèse, focalisation isoélectrique )
- taille moléculaire(ultracentrifugation, chromatographie par filtration sur gel, électrophotèse)
- propriétés d’absorption et de liaison à d’autre molécules biologique (chromatographie d’affinité)
Solubilité et précipitation des protéines
La distribution des résidus d’acide aminé de type hydrophobe à la surface des protéine est aussi importante dans la solubilité des protéines que les résidus de type polaire ou chargés
- Attraction entre surface hydrophile et molécule d’eau, Crée une interface ou les molécule d’eau s’oriente pour formé une surface hydraté qui améliore la solubilité, réduise attraction dipolaire-dipolaire et l’association avec d’autre solutés
La solubilité dépend:
- interaction polaire avec la solution aqueuse
- interaction ionique avec les sels en solution
- forces électrostatiques répulsive entre molécules ou agrégats de charge similaire
C’est quoi un agrégats?
Formé par la
Variable utilisé pour diminué la solubilité
- force ionique
- ajout de solvant organique
- température
- pH
- Ajout de polymère inertes
Solubilité des protéine à faible concentration de sels
- solubilité de protéine en solution aqueuse dépend de la concentration des ions dissous dans une solution
- concentration exprimé par force ionique(note de cours 30)
- Varie selon nature des ion et augmente avec concentration de sels en solution
- dans la zone de force ionique de 0.5M, augmentation nommé “ salting in”, car les sels lient directement les protéines et réduit leur charge net (sel augment interaction avec l’eau et répulsion entre protéines(agrégation))
dessalage des concentration de sels élevées
- Dessalage = salting out
- une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la surface d’une protéine.
- au fur et à mesure que les ions de sels deviennent solvatés, les molécules d’eau libres deviennent moins nombreuses.
- Il y aura une plus grande tendance pour la protéine de perdre des molécules d’eau autour des résidus hydrophobes
- ce qui favorise l’agrégation, puisque les régions hydrophobes exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt qu’avec de l’eau
La nature des sels utilisé pour la précipitation de protéines
- Les sels qui se lient et interagissent directement avec la protéines peuvent avoir bin effectuer déstabilisant et sont désignés «chaotropique »(désordre)
- sels optimaux sont ceux qui encouragent l’hydratation des régions polaire et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans avoir aucune interaction avec la protéine«kosmotropique»(agent structural)
- anions multivalent comme le sulfate, phosphate et le citrates avec des cation comme le potassium, sodium et ammonium, préféré
- le plus utilisé sulfate d’amonium
