Ferramentas da genética molecular Flashcards
Principais vetores da clonagem molecular
DNA de Plasmídeos de bactérias e leveduras
Transferência da sequência de RNA/DNA para uma célula ou MO • Crescimento em cultura e reprodução da sequência • Formação de clones com a sequência em grande quantidade Me refiro a
Clonagem molecular
Enzimas necessárias para clonagem molecular
1) enzimas de restrição (cortam o DNA em sequencias alvo
2) DNA ligase (ligação d sequência de DNA inserida no DNA do vetor
coleções de clones que possuem
vetores com inoculação do DNA de interesse,
sendo armazenadas para informação futura.
Bibliotecas
amplifica seletivamente
uma única molécula de DNA bilhões de vezes em poucas horas.
Reação em Cadeia polimerase (PCR)
Enzima utilizada para PCR
DNA polimerase.
- Desnaturação dos fragmentos de DNA
- Colocação de primers (oligonucleotídeos) nas extremidades opostas das fitas
com sentido e antissentido. - A DNA polimerase sintetiza dois novos filamentos de DNA tomando como
molde a sequência após a posição dos primers. - Síntese de 2 novas moléculas de DNA complementares entre si, ao mesmo
tempo: hibridizam e formam um novo DNA dupla hélice.
Reação em Cadeia polimerase (PCR)
aplicação da PCR na análise da quantidade de moléculas
da amostra, utilizando a quantidade final e o número de ciclos feitos pelo
procedimento.
PCR QUANTITATIVA
utilização da PCR para RNA, é necessário sua transformação em DNAc pela
enzima transcriptase reversa. TR-PCR. V ou F
V
HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Usada para isolamento e reconhecimento de sequências de
DNA/RNA.
Necessário já ter conhecimento da sequência.
Procedimento muito específico
• Separação dos filamentos de dupla hélice
• Preparação de DNA sintético complementar (sequência sonda)
• Marcação com composto radioativo/corante fluorescente
• Mistura DNA sonda com todo substrato: pareamento do DNA sonda com o DNA alvo: formação de
dupla hélice estável.
Sondas Moleculares de Ácidos Nucleicos
Uso para distinguir segmentos específicos de moléculas
de DNA ou RNA de milhões de segmentos em uma
amostra.
1. Desnaturação: separação de filamentos complementares,
criando fitas únicas.
2. Clivagem por enzimas de restrição
3. Amostras são colocadas em poço moldado em agarose com gel.
4. É aplicado um campo elétrico: fragmentos são separados pela
forma como deslizam no gel através da eletroforese.
5. Moléculas de DNA são transmitidas do gel para um pedaço de
papel de filtro por capilaridade
6. Incuba uma sonda radioativa de filamento simples de DNA
complementar ao segmento alvo
7. A sonda pareia com o segmento alvo tornando-o visível em
filme de RX.
Tecnologia padrão pra detectar sequências genéticas inteiras ou
parte delas (erros cromossômicos de inserções ou deleções)
Southern Blotting
Eficaz para avaliar mutações de única base ou poucas bases. Ex:
anemia falciforme e fibrose cística.
1. Síntese de um oligonucleotídeo (sequência pequena) complementar à
sequência alvo.
2. Introdução do oligonuceotídeo na amostra para parear com a sequência
alvo NORMAL.
3. Caso não haja mutação: hibridiza, caso haja mutação: não hibridiza.
Vantagem: sonda pequena. Consegue observar pequenas
mutações (base única) que passariam intactas por outras
técnicas que usam sondas maiores.
Análise com Sondas de Oligonucleotídeos (ASO)
Sequenciar fitas de DNA: descobrir suas bases nitrogenadas de formação. Utiliza a formação de filamentos de DNA pela enzima DNA polimerase e análogos de nucleotídeos (didesoxinucleotídeos: ddA, ddC, ddG, ddT). Utilizado em análise da sequência de bases, detecção de mutações individuais e fabricação de sondas
Sequenciamento de Sanger
Sondas fluorescentes que conseguem hibridizar
com sequências contidas em cromossomos (DNA
altamente condensado).
1. DNA dos cromossomos é fixado em lâmina e
desnaturado expondo as fitas únicas de DNA.
2. Sonda marcada com fluorescência consegue
hibridizar com DNA cromossômico.
Resultado: observa-se a localização cromossômica de
um segmento de DNA.
Misturas complexas: coram cromossomos inteiros,
individualizados, uma parte característica desses,
centrômeros.
Importante pra observar aberrações
cromossômicas: deleções duplicações e
translocações.
Hibridização In situ por fluorescência (FISH)
Útil para pequenas deleções e duplicações em segmentos de DNA individuais e em
casos de câncer.
Técnica comparativa: medir a diferença entre o número de
pares de base entre duas amostras de DNA, controle e
teste.
1. DNA total da amostra teste é corada de vermelho
2. DNA total da amostra controle é corada de verde
3. Amostras são misturadas tentando hibridizar uma
com a outra: controle e teste
É analisado a proporção em que essa hibridização não foi
perfeita, observando a proporção entre as sequências de
DNA de uma amostra e outra.
Hibridização comparativa do genoma (CGH)
