FL 3

Question 1

Vilken är den vanligaste metoden för storleksseparation?

Answer 1

Gelelektrofores.

Question 2

Vilka format finns på elektrofores?

Answer 2

• Tubgeler är den första designen men används nästan aldrig längre.
• Vertikala geler används oftast vid separation av proteiner.
• Horisontella geler används oftast för DNA och 2D-separation av proteiner. Denna metod är enklare än vertikala geler.
• Kapillärer (tunna kapillärer med gel i).

Question 3

Hur går gelelektrofores till?

Answer 3

Provet tillsätts i en ände av en gel med porer (ex. agarose eller polyakrylamid). Över delen läggs ett elektriskt fält. Små molekyler vandrar snabbast.

Question 4

Hur kan man använda fluorescens för att detektera DNA?

Answer 4

En fluorofor (etidiumbromid) interkalerar mellan baserna i DNA. Detta innebär att den lägger sig mellan baserna och binder in till DNA. Detta leder till att etidiumbromid blir starkt fluorescerande pga påverkan från närliggande, kemisk miljö.

Question 5

Vilken slags gel brukar man använda för proteiner?

Answer 5

Vertikala geler. Använder oftast inte fluorescens.

Question 6

Vad är isoelektrisk fokusering (IEF)?

Answer 6

Metoden separerar proteiner baserat på deras pI. Gelen har en pH-gradient och går från sur till basisk. Oftast horisontella geler. Måste kyla pga värme genereras. Om vi har ph-gradient och tillsätter proteiner och slår på elektriskt fält så kommer proteinerna vandra till området där de är neutrala.

Question 7

Vad är 2D-gelektrofores?

Answer 7

En kombination av IEF och SDS-PAGE. Proteiner med samma storlek men olika pI (och tvärtom) kan separeras. I den första dimensionen kör man vanligtvis IEF i stavromad gel. Delen inkuberas i buffert med SDS. Andra dimensionen, SDS-PAGE körs genom att placera IEF-gelen i ena änden av polyakrylamid.

Question 8

Hur kan man kombinera 2D-gelelektrofores med MS?

Answer 8

Genom att skära ut olika spottar från 2D-gelen och köra masspektrometri kan man identifiera massan i vardera punkt i syfte att få en bild över vilka proteiner som fanns i cellen eller vävnaden.

Question 9

Vad är kapillärelektrofores?

Answer 9

Det använder en princip som är identisk för plana geler. Skillnaden är att gelen befinner sig i en tunn kapillär som man har laddning över. Prov finns i bägare (anod), sugs upp i kapillär och hamnar i annan bägare (katod). På kapillär finns detektor som mäter ex. Abs280. När proteinerna passerar får man en peak för absorbans, kromatogram skapas.

Question 10

Vad är skillnaderna mellan klassisk och kapillärelektrofores?

Answer 10

Klassisk är tidskrävande, labintensiv, semi-kvantitativ och parallelliserad. Kapillär är snabb, automatiserad, har hög upplösning, är något svårare att parallellisera, dyrare & mer komplicerad utrustning, har on-line detektiv och små provvolymer.

Question 11

Vad är den största fördelen med kapillärelektrofores?

Answer 11

Att man kan ha mycket mindre provvolymer än vid vanlig. Särskilt bra om man har dyrbara och små mängder av provet då det förstörs av elektrofores.

Question 12

Vad kan man använda SEC till?

Answer 12

Till att detektera potentiell aggregering (och se multimerer). För exakt storlekskvantifiering krävs dock standards med känd storlek.

Question 13

Hur kan analytisk HPLC utföras?

Answer 13

Man hydrolyserar sitt prov, oftast med syra. Provet bryts ned till fria aminosyror och HPLC körs. Från standards vet man när varje aminosyra elueras och kan då kvantifiera mängden av aminosyrorna i provet. Syftet är att ta reda på total proteinkonc. Först bestämmer man konc. av varje aminosyra och då måste man veta sekvensen. Man kan räkna tillbaka och se om det stämmer.

Question 14

Varför används antikroppsbaserade metoder?

Answer 14

För att de är väldigt specifika, har hög affinitet till skillnad från vanlig spektroskopi. Plus att antikroppar är relativt enkla att ta fram.

Question 15

Vad kan antikroppsbaserade metoder användas till?

Answer 15

Till detektion och målsökning, även i komplexa prov.

Question 16

Vad är antikroppar?

Answer 16

En klass av proteiner som binder specifikt till andra molekyler (antigener).

Question 17

Hur produceras antikroppar i däggdjur?

Answer 17

De genereras av immunsystemet som svar på främmande substanser/patogener (immunogener) och inhiberar och/eller aktiverar andra delar i immunsystemet.

Question 18

Vilka klasser av antikroppar finns?

Answer 18

IgG, IgM, IgA, IgE & IgD

Question 19

Vilken klass av antikroppar används främst i immunokemi/teknik och terapi?

Answer 19

IgG då denna oftast ger gensvar vid immunocering.

Question 20

Hur ser en antikropp ut?

Answer 20

Den har fyra polypeptidkedjor varav två tunga och två lätta. De hålls samman av disulfidbryggor och det finns även posttranslationella modifieringsställen.

Question 21

Vad är Fc-regionen?

Answer 21

Den har flera bindningsställen för receptorer i immunsystemet, vilket medierar immunsvar. Denna region har även bindning till staphylococcal protein A (SpA). Staphylococcus använder protein A i syfte att dölja sig för immunsvaret.

Question 22

Vad är Fab-regionen?

Answer 22

Den har C- och V-domäner. Regionen som binder antigener sitter i ändan av den variabla domänen.

Question 23

Vad är en bivalent molekyl?

Answer 23

Ex. IgG har två Fab-regioner och är då en bivalent molekyl.

Question 24

Vad är complementarity-determining regions (CDR)?

Answer 24

Det är sekvensvariationen i tre hypervariabla regionen som främst bildar site för antigenbindning.

Question 25

Vad är en paratop?

Answer 25

Den del på antikroppen som binder antigenet.

Question 26

Vad är en epitop?

Answer 26

Den del på antigener där antikroppen binder in.

Question 27

Hur får man fram polyklonala antikroppar (pAbs)?

Answer 27

Ex. om man har insulin och vill ha antikropp så injicerar man humant insulin i en mus ex. Detta kallas immunisering. Det kickar igång musens immunsvar och antikroppar mot insulinet produceras. Man tappar sedan blod från musen och kan utifrån det rena fram antikropparna.

Question 28

Hur tar man fram monoklonala antikroppar?

Answer 28

Man kan injicera humant insulin i musen och sen ta ut antikroppsproducerande B-celler (dödliga). Fusera dessa med cancerceller (odödliga) så att antikroppar kan odlas i labb. Fusionen kallas hybridoma och är odödliga celler. Screenar efter hybridomas som matchar antikroppen. När den rätta hittas odlar man just den cellen i labbmiljö.

Question 29

Vad är en linjär epitop?

Answer 29

Den består av en kontinuerlig (oveckad) sträcka aminosyror av primärsekvensen.

Question 30

Vad är en strukturell/diskontinuerlig epitop?

Answer 30

De består av avlägsna aminosyror (i primärsekvensen) vilka förs samman i rymden vid veckning av proteinet.

Question 31

Varför är det viktigt att veta om en epitop är linjär eller strukturell?

Answer 31

Om metoden innebär detektering av denaturerat protein så är det bättre att antikroppen känner igen en linjär epitop som är oveckad. Om den känner igen strukturell kan den inte binda om proteinet denaturerats då det blir oveckat. Det slutar alltså binda och har tappat sin funktion.

Question 32

Vilka skillnader finns mellan pAbs och mAbs?

Answer 32

pAbs är relativt billigt/enkelt att generera, mAbs är mer komplicerat & dyrt. pAbs är
mix av olika antikroppar, mAbs är en klon. pAbs binder ofta till olika epitoper, mAbs till en. pAbs ej helt förnybar, det är mAbs. pAbs är ofta mer tolerant map förändringar hos antigen, det är inte mAbs.

Question 33

Vad är den största fördelen med mAbs?

Answer 33

Att det är en förnybar källa tack vare hybridomas.

Question 34

Hur skapas rekombinanta antikroppar?

Answer 34

De skapas in vitro via riktad evolution, immunisering behövs ej. Kan använda ex. fag-displat och ha liknande immunsystem i provrör, får fram bindare (ex. affibodies).

Question 35

Vad är riktad evolution?

Answer 35

Man har B-celler i kroppen som vardera producerar en typ av antikropp. Om vi får ex. ett virus finns det stor sannolikhet att någon B-cell har antikropp mot detta virus. Denna B-cell börjar proliferera och skicka ut sådana antikroppar. Man har ett DNA-bibliotek av olika varianter, samling med gener som kodar för ex. affibodies. De är muterade så att varje gen har lite annorlunda sekvens, annars har de samma struktur. Man brukar göra miljarder olika varianter. När man sedan producerar proteinvarianter och sätter ned en insulinmolekyl i röret så fiskar man ut de varianter som binder in. Det finns en sannolikhet att någon kommer kunna binda då storleken på biblioteket är så stort. Bindaren tas ut, produceras, analyseras, nya mutationer sker och processen körs igen. Till slut har man en molekyl som kan användas för ex. in vivo studier.

Question 36

Vad kan man göra åt det faktum att IgG är så stor och komplex?

Answer 36

Man kan ta mindre fragment av antikroppen om vi endast vill åt antigenbindande funktionen. Fc-delen kan skalas bort ex.

Question 37

Vad är reportergrupper? Varför används de?

Answer 37

Antikroppar kan märkas med olika reportergrupper/molekyler för att ge detekterbar signal. Reportrar kan vara enzym där man sedan tillsätter substrat och låter enzymet omvandla substratet till en kromogen produkt som kan detekteras ex. med absorbans. Det kan även vara en fluorofor där man får fluorescens vid inbindning.

Question 38

Vad är direktinmärkning?

Answer 38

Direktinmärkning innebär att reportergruppen konjugeras kovalent till vissa aminosyror på proteinet. Oftast till lysiner med amin-reaktiv kemi eller till cysteiner med tiol-reaktiv kemi. Man tar reportergruppen som är kopplad till kemin och låter den reagera kovalent.

Question 39

Nackdelar med direktinmärkning?

Answer 39

• Vet ej hur många som binder in.
• Har man märkt in med ex. fluorofor kan molekylen ej användas i radioaktiv kemi.
• Om ex. lysin sitter i CDR ger det dålig inbindning.
• Cysteiner bildar disulfidbryggor och reduceringsmedel kan behöva tillsättas, molekylen kan destabiliseras.

Question 40

Vad är indirekt inmärkning?

Answer 40

Indirekt inmärkning innebär att reportergrupperna binder icke-kovalent till antikroppen via sekundär-reagens. Ex. species-specifika antikroppar eller biotin/streptavidin. Ofta tar man fram en annan antikropp som binder till antikroppen man använder. Denna märks med fluorofor. Man behandlar först provet med den primära antikroppen, sedan med den sekundära, då kan man mäta fluorescensen.

Question 41

Vilka nackdelar/fördelar finns med indirekt inmärkning?

Answer 41

• Fler steg som kan gå fel.
• Sekundär antikropp kan kladda ospecifikt på målmolekylen, ge signal.
• Tar längre tid.
• Inte lika stark bindning.
  Fördel:
  + kan ha många olika antikroppar med samma fc-region så man kan använda samma detektionsreagens mot alla.

Question 42

Vad är genetiska fusioner?

Answer 42

Genetiska fusioner kan ske med fluorescenta proteiner som mCherry eller GFP. Ex. sätter man genen för fluorescenta proteinet efter heavy chain. Sedan uttrycks fusionsproteinet, alltså heavy chain med GFP. Två tunga kedjor ger två GFP.

Question 43

Hur märker man in med radionuklider?

Answer 43

Det är oftast makrocykliska kelatorer som används. Kelatorn med sin ringstruktur fäster kovalent till antikroppen. Märker in på ex. cystein eller lysin. Sedan märker man in med radionukliden vilken binder binder (icke-kovalent) till kelatorn.