genklonering: genomisch materiaal & banken Flashcards

1
Q

genklonering

A

chromosomaal (genomisch) DNA & kopie mRNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

gene library vs cbank

A

g: prok + gist
c: euk

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

genomsiche bank

A

collectie recombinante vectors die samen hele genoom van bron org voorstellen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

cDNA

A

geen introns (insertiecap verhoogt)
seq die genexpressie regelen, niet vervat in mRNA
transcriptie afhankelijk (promotor actief)
geen promoter
vergelijken expressie bij omstandigheden (selectieve exp)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

gDNA

A

lage abundantie (1 gen/cel)
intronen
promoter & flankerende regio’s

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

probleem hele genoom verknippen in verschillende vectoren

A

digest variabele groottes, vooral ligatie kleinere
geen volledige representatie
na digest terugpuzzelen onmogelijk

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

oplossing onvolledige representatie

A

partieel digest, -> overlappingen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

grote genomen

A

BAC & YAC
RE 6nt

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

kleine genomen

A

lambda & cosmiden
RE 4nt, knippen vaker

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

nu volledige representatie maar… + oplossing

A

RE niet gelijk verspreid -> fragmenten niet geschikt klonering
aanliggende seq RE kunnen knip bevorderen of verhinderen
sec structuur ook invloed
=> verschillende RE

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

andere methoden dan RE + nadeel

A
  • mechanische shearing via naald/sonificatie
    N: hoe kleiner hoe minder vatbaar -> blunt/onregelmatige einden
  • andere enzymen: micrococcal nuclease tss histonen
    N: blunt ends
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

factoren invloed vectorkeuze

A

grootte insert
grootte library voor voldoende representatie genoom
(hoe groter insert hoe kleiner library)
grootte genoom

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q
A
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

opslag DNA fragmenten DNA banken

A

pooling getransformeerde kolonies (plaques)
-> vloeibaar medium, diepvries
-> repooling: heruitplaten, amplificatie

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

isolatie RNA

A

olige(dT) gecoate kolom/beads

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

cDNA synthese 1e streng

A

1) poly-a-staart -> olige(dT) molecule als primer
=> overwicht 3’ + kans 5’ mRNA niet haalt (sec. structuur)
1) random primers (overlappende fragmenten)

17
Q

methoden 2e streng

A

S1 nuclease
de land
de gubler & hoffman

18
Q

S1 nuclease tekening

A

p32

19
Q

S1 nuclease methode

A

Nadeel: veel seq 5’ gaan verloren

20
Q

de land methode

A

dC nucleotiden aan 3’ (TdT)
dC zone als template oligo dG molecule (primer)
alkalische degradatie -> verw. mRNA
probleem:
sterke cG -> sequenering issue
weinig controle # c’s

21
Q

de gubler & hoffman methode

A

oligo(dT)
RNase H -> nicks
DNA polymerase -> nick translatie (seq overschrijven)
DNA ligase
probleem:
klein stuk in begin niet overgeschreven (blijft RNA)

22
Q

de land tekening

A

p33

23
Q

de gubler & hoffman methode tekening

A

p33

24
Q

oplossingen sequenering issue:

A

haarspelden uitsmelten
random primers op mRNA
adapter -> in plasmide -> sequenering

25
Q

bacterieël cDNA

A

geen intronen
beperkte genoomgrootte
geen poly-A staart
-> genomische bank
bac mRNA = korte levensduur
polycistronisch

26
Q

wanneer wel cDNA bank voor bacterien

A

onderzoek wanneer welke genen tot expressie

27
Q
A