Ingénierie des enzymes

Question 1

Quelles sont les deux grandes approches pour l’ingénierie des enzymes?

Answer 1

Évolution dirigée
- générer de la diversité de séquences
-cribler
- répéter
Design rationnel et assisté par ordinateur
- Design rationnel
- desgn assisté par ordinateur
-design d’enzyme de novo
- Résurrection de formes ancestrales

Question 2

Que nécessite le design rationnel?

Answer 2

Connaitre les structures 3D
une bonne connaissance du mécanisme (relation entre la structure d’une enzyme et sa fonction)

Question 3

Sur quoi repose le design rationnel?

Answer 3

• Des mutations ponctuelles (au site actif)
• l’addition, la délétion ou la modificaiton d’éléments de structure secondaire
• l’échange de domaines complets ou de s-u

Question 4

Quelles sont les approches possibles pour contourner le problème de la diversité des séquences aléatoire?

Answer 4

• Mutagénèse ciblée
• Évolution dirigée en ciblant certaines régions
• Évolution dirigée en introduisant de nouvelles technologies de criblage
• Sélection basée sur la complémentation de fonction
• Design assisté avec des outils de bio-informatique

Question 5

Quelle est la première étape de l’ingénierie d’une enzyme par évolution dirigée?

Answer 5

introduction de mutations dans le gène codant d’une enzyme pour générer une librairie de mutants

Question 6

Quelle est la base de l’approche de l’évolution dirigée?

Answer 6

La diversification des séquences et la génération de banques de mutants

Question 7

Quelles sont les différentes approches de mutagénèse utilisées pour générer des mutants?

Answer 7

• Mutagénèse aléatoire
• Recombinaison des séquences homologues
• La permutation circulaire
• Insertition ou délétion de séquences

Question 8

Comment peut-on effectuer la mutagénèse aléatoire?

Answer 8

• Créer des conditions pour augmenter le taux d’erreur de la polymérase lors de l’amplification de l’ADN ([Mg2+] ou [Mn2+] élevé, [nucléotides] débalancé)
• Souches bactériennes déficientes pour la réparation de l’ADN
• Mutagénèse par saturation de séquence
• agent chimiques

Question 9

Qu’est ce que l’approche par recombinaison de séquences homologues?

Answer 9

on coupe des ADN codant diverse versions d’un même gène. De nouvelles versions du gène sont obtenues en ré-assemblant les morceaux d’ADN.

Question 10

Qu’est ce que la permutation circulaire?

Answer 10

les séquences au début et la fin de la protéine sont modifiées. Cela estréalisé en déplaçant la séquence codant les codons d’initiation et de terminaison et en joignant, sousforme de séquence continue, le codon de l’acide aminé carboxy-terminal et celui de l’acide aminéamino-terminal de la protéine native. Il n’y a donc pas de substitutions d’acides aminés en tant quetel mais l’ordre des acides aminés a été modifié. Les changements structuraux les plus importantssont alors aux nouvelles extrémités N- et C-terminales et dans la région qui lie maintenant les acidesaminés qui formaient les extrémité N- et C- terminales naturelles.

Question 11

Lors de la méthode de l’évolution dirigée, comment les meilleurs clones sont-ils séléctionnés?

Answer 11

Par criblage à haut débit de l’activité enzymatique

Question 12

Quelle est la différence dans la technique de criblage si :
Si le substrat pénètre à l’intérieur des cellules et que le produit génère un signal détectable par fluorescence
Si les cellules doivent être lysées

Answer 12

• Technologie FACS peut être utilisée pour trier des cellules exprimant la banque d’enzymes mutées
• faut être en mesure de confiner la solution contenant l’extrait d’enzyme, ou la cellule exprimant l’enzyme en surface, et le substrat. On peut le faire par exemple en encapsulant des extraits ou des cellules de façon individuelle dans des microcompartiments qui sont de très petites gouttelettes de liquide en suspension dans l’huile

Question 13

Illustre les différentes étapes de l’évolution dirigée de la HRP

Answer 13

Étapes A/B: La banque de clones est construite à partir d’un plasmide codant la HRP en fusion avecune autre protéine permettant de l’exporter et la fixer à la surface de la levure. Une collection de plasmides, portant chacun une ou des mutations dans le gène codant le HRP, est obtenue.
Étape C: Les plasmides sont introduits chez la levure et les cellules contenant chacune un plasmide sont cultivées.
Étape D: Les cellules sont mélangées avec les substrat, l’amplex-red et le peroxyde d’hydrogène, et elles sont mises individuellement dans des microgouttelettes de liquide en suspension dans l’huile.
Étape E: Lorsqu’un mutant est actif, l’activité peroxydase oxyde l’amplex-red ce qui génère un produit fluorescent.
Étape F: Dans chacune des gouttelettes, il y a une levure qui exprime une HRP plus ou moins active selon la ou les mutations qu’elle contient.
Étape G: Les gouttelettes sont triées selon l’intensité de fluorescence avec un appareil construit à cet effet (page suivante). Les levures de ces gouttelettes peuvent être récupérées et être utilisées pour cribler à nouveau et pour séquencer les ADNs plasmidiques. Les plasmides peuvent aussi être récupérés pour entreprendre une 2e
ronde de mutagénèse et une nouvelle ronde de criblage.

Question 14

Quelles méthodes combine la méthode PACE?

Answer 14

évolution dirigée et sélection (dans un système biologique)

Question 15

Quelle limite peut contourner la méthode PACE?

Answer 15

limite imposée par le criblage in vitro en permettant d’évaluer une plus grande quantité de mutants

Question 16

Quel organisme utilise la méthode PACE?
comment?

Answer 16

Phage
utilise des phages pour propager et sélectionner une séquence codant pour une enzyme que l’on désire muter. Dans la PACE, la sélection se fait par la complémentation d’une fonction qui permet la réplication du phage, c. à d. que le phage ne peut se répliquer et infecter de nouvelles cellules que si l’enzyme qui est mutée est active

Question 17

À partir de quoi est possible la résurrection de formes ancestrales des enzymes?

Answer 17

• Données massives issues du séquencage de génomes et de métagénomes
• Analyses phylogénétiques qui permettent de proposer des séquences plausibles ou probables pour les versions ancestrales des gènes
• Synthèse chimique plus facile de l’ADN à faible cout

Question 18

Par quoi peut être limité la résurrection de formes ancestrales d’enzymes?

Answer 18

par la diversité de séquences contemporaines qui peut ne pas refléter fidelement celle des séquences ancestrales

Question 19

Quelles sont les propriétés intéressantes des enzymes ancestraux?

Answer 19

-stabilité thermique
- Promiscuité de liaison de substrat et/ou de catalyse

Question 20

Qu’est ce que la promiscuité?

Answer 20

capacité à lier un substrat autre que le substrat principal et de catalyser une réaction

Question 21

Pourquoi la promiscuité serait plus répandue chez les enzymes ancestrales que chez les enzymes modernes?

Answer 21

1. Les enzymes anciennes étaient probablement des enzymes généralistes, qui avaient plusieurs activités puisque le nombre d’enzymes était limité. Les enzymes modernes au contraire seraient des enzymes spécialisées capables d’augmenter la vitesse de catalyse de plusieurs ordres de grandeur par rapport aux réactions non catalysées mais avec une gamme plus restreinte de substrat(s).
2. Les modèles découlant de l’étude de la duplication des gènes chez des organismes modèles montrent que la version ancestrale d’une enzyme, qui est issue d’un gène en copie unique, montre plus de promiscuité que les enzymes provenant de gènes dupliqués. Pour les gènes dupliqués, une copie du gène aurait conservé la fonction originale alors que la seconde copie aurait pu évoluer et acquérir une fonction plus spécialisée.