Microscopie Électronique et Confocale

Question 1

Types de microscopes

Answer 1

• Électronique: à balayage et à transmission
• Optique: à base de source de lumière blanche
• Confocale: à fluoroscence avec une source de laser
• À force atomique: par l’aspect de forces électrostatiques

Question 2

Résolution de chaque microscope

Answer 2

• À l’oeil: 0,2 mm
• Optique: 0,5 µm
• Électronique à balayage: 0,04 - 0,08 nm
• Électronique à transmission: 0,2 nm

Question 3

Microscopie CONFOCALE, objectif

Answer 3

microscope optique et l’image est formée par des coupes transversales SANS être perturbé par la lumière hors du plan focal
(Marvin MINSKY, 1953)

Question 4

Source du rayon et principe de fonctionnement

Answer 4

Des filtres sélectionnés et une couleur (bleu) qui va excité les fluorochromes de l’échantillon et l’illumine, puis ces fluorophores émettent une lumière différente (vert).
Le miroir dichroïque sélectionne seulement la lumière émise par l’échantillon.
L’intensité du faisceau de laser est mesuré par des diaphragmes.
L’image est détectée grace aux miroirs galvanométriques qui permet le balayage rapide sur l’échantillon fluorescent à une hauteur fixe, détecté par un tube photomultiplicateur

Question 5

Avantage du microscope confocal

Answer 5

• détecter des molecules fluorescents avec une bonne résolution spatiale en 3D
• Permet l’examen d’objet épais (0,5 µm)
• Utilisation d’une source laser qui dure plus longtemps
• Diminution de la photoattenuation

Question 6

Inconvénients du microscope confocal

Answer 6

X - Photo dommage cellulaire dans toute l’épaisseur après la fluorescence et le balayage
X - Pénetration du faisceau réduite à une épaisseur > 0,5µm
X - Excitation avec une source de longueur d’onde > 450 nm

Question 7

Microscopie électronique à transmission - objectif

Answer 7

faisceau d’électrons qui traverse l’échantillon très mince et limitée par des aberrations de lentilles magnétiques
- par l’effet Fourier ou Rayonnement X
1931 , Knoll et Ruska

Question 8

Microscopie électronique à transmission - principe de fonctionnement

Answer 8

• électrons sont accélérés par une génération de champ électrique (source +ve à l’anode -ve)
• dans le vid
• lentilles magnétiques pour projeter l’image électronique de l’échantillon (métallique/biologique/sémi-conducteur) sur un écran fluorescent

Question 9

Réservoir d’azote liquide objectif - MET

Answer 9

refroidir une zone près de l’échantillon pour pas avoir de contamination

Question 10

Réservoir deuxième - MET

Answer 10

pour refroidir le détecteur de rayons X

Question 11

Canon d’électrons - MET

Answer 11

Stabilité et brillance - important dans les qualités des mesures qui améliore la résolution des images par la cohérence d’électrons

Question 12

Source d’électrons - (MET)

Answer 12

Par

• Émission thermoïonique (tungstène et héxaborure qui augmente la cohérence)
• Émission d’effet de champ
• Source Schottky à émission de champ

Question 13

Émission thermoïonique - MET

Answer 13

électrons chauffés à haute température par circulation de courant (20 - 300 kV) et accélérés par l’anode

Question 14

Émission de champ (Field Emission Gun) - MET

Answer 14

cold FEG à des cristallins (l’éxtraction des e- par un champ électrique INTENSE et un vide - bonne cohérence
- il réduit le travail de sortie (énergie minimum pour arracher un e- d’un noyau)

Question 15

Pompe de vide - classification (MET)

Answer 15

• Primaire - palette
• Secondaire - diffusion d’huile (mais, peut contaminer l’échantillon et le microscopes - hydrocarbures)
• Ionique - FEG et LaB6 (mais, chère en maintenance et doit être refroidi par un circuit d’eau)

Question 16

Préparation des échantillons - contraintes (MET)

Answer 16

1. Impact du faisceau d’e-
2. Observation dans une chambre vide
3. échantillon mince
4. doit être conducteur pour pas produire de charge électrique locale

Question 17

Échantillons biologiques (MET)

Answer 17

• Minceur de l’échantillon, par un microtome - plusieurs couches à être observées
• Colorants pour rehausser le contraste des détails
• Métaux lourds ajouté: Osmium, Plomb et Uranium

Question 18

La coloration -ve (MET)

Answer 18

par l’acide phosphotungstique

- l’échantillon apparaît blanc sur un fond sombre sur les photographies

Question 19

l’ombrage (MET)

Answer 19

par le tétroxyde d’osmium ou acétate d’uranyle (fibre de collagène)

Question 20

Ombrage rotatif (MET)

Answer 20

étudie le relief des structures

Question 21

Échantillons inorganiques (MET)

Answer 21

• coupés par une scie à fil diamanté pour conserver les zones minces
• épaisseur très mince de 10-100 nm

Question 22

fixation permet de (MET)

Answer 22

faire le pontage des protéines

et conserver la trame structurale après l’elimination de l’eau

Question 23

Exemple de fixateurs (MET)

Answer 23

• Éthanol
• méthanol
• alcool 96%
• Liquide de Cornoy: alcool éthylique + Chloroform + Acide acétique
• les aldéhydes, glutaraldéhyde
• Oxydants puissants (tétroxyde d’osmium)

Question 24

Déshydratation (MET)

Answer 24

Remplacement progressif de l’eau par un solvant

- par l’alcool / acétone

Question 25

Imprégnation (MET)

Answer 25

Remplacement d’une phase liquide ou gazeuse par un polymère liquide qui sera durci pour produire un échantillon de dureté homogène

Question 26

Coloration des coupes semi fines (MET)

Answer 26

bleu de toluidine

Question 27

Différence entre MET et MEB

Answer 27

MEB
- permet de visualiser la surface et la forme d’un échantillon
- détection des électrons qui rebondissent sur le spécimen (électrons Auger)
- très haute résolution de l’organisation interne des cellules. (O,15- 0,3 nm)
- profondeur de champ
MET
* visualise les électrons qui parviennent à traverser l’échantillon
* résolution de 10 - 50 nm
* échantillon extrêmement fin (10 nm)
* Les composants de l’échantillon apparaissent en formant une ombre sur l’image

Question 28

Similarités entre des MET et MEB

Answer 28

• source: faisceau d’électrons
• ne peuvent pas faire des images 3D
• Même compartiment et même structures (Canon, colonne, chambre d’observation, lentilles électromagnétiques)