PCR

Question 1

Qué hace la PCR?

Answer 1

Sintetiza varias secuencias complementarias de DNA a partir de una secuencia molde

Question 2

Qué se necesita para realizar una PCR?

Answer 2

• secuencia de DNA
• primers
• DNA polimerasa
• dNTPs
• cofactores (MgCl2)
• amortiguador (pH 8.4)

Question 3

Qué DNA polimerasa se utiliza para la PCR y por qué?

Answer 3

(Thermophilus aquaticus) Taq polimerasa
resiste hasta 95 °C

Question 4

Cómo son los primers de una PCR?

Answer 4

se diseñan especialmente para la secuencia deseada
alto contenido de C y G

Question 5

Cuáles son las 3 etapas de un ciclo de PCR y a que temperatura operan?

Answer 5

• desnaturalización: separa hebras de DNA. 95 °C
• hibridación: se alinean los primers. temperatura de alineamiento (50 °C - 60 °C)
• extensión: Taq polimerasa añade los dNTPs. 72 °C

Question 6

Cómo se analiza el resultado de una PCR?

Answer 6

electroforesis

Question 7

Cómo funciona una electroforesis?

Answer 7

genera campo eléctrico al rededor de un gel y separa moléculas de DNA por su tamaño.
Entre mas pequeñas viajan más lejos

Question 8

De qué es el gel para la electroforesis?

Answer 8

agarosa

Question 9

De qué depende la preparación del gel de agarosa?

Answer 9

Entre más concentrado, más pequeños los poros –> fragmentos de DNA más cortos

Question 10

Qué se necesita para observar el resultado de una electroforesis?

Answer 10

teñir las muestras para verlas con un transiluminador ultravioleta

Question 11

Cómo se puede saber el tamaño de las muestras obtenidas por electroforesis

Answer 11

comparando con marcador de peso molecular
DNA/proteínas de tamaño conocido

Question 12

Qué tipos de PCR existen?

Answer 12

• punto final: versión estándar
• múltiple: tiene primers para varias secuencias
• PCR-RFLP: digenstión con enzimas de restricción antes de la PCR. Para secuencias cortas como STRs
• PCR TR: transcriptasa reversa. De RNA a DNA
• PCR tiempo real: observa el resultado de cada ciclo en una computadora. Cuantifica

Question 13

Cómo funcionan los colorantes para la PCR tiempo real?

Answer 13

• no específicos: tienen afinidad por dsDNA y dan señal fluorescente
• específicos: sondas (secuencias específicas para complementar la secuencia buscada) con fluoróforo y un inhibidor. Cuando llega Taq polimerasa quita al inhibidor –> señal fluorescente

Question 14

Cómo se calcula la temperatura de alineamiento?

Answer 14

(4 x C+G) + (2 x A+T)