Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

Molekularna genetika > Replikacija DNA > Flashcards

Replikacija DNA Flashcards

1
Q

Što osigurava replikacija DNA?

A

udvostručenje, brzo i precizno kopiranje genetičkog materijala što omogućava njegovo nasljeđivanje u stanice kćeri

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Kakva je replikacija DNA i eksperimentalni dokazi za to?

A

Herbert Taylor (1957)
• replikacija eukariotskog genoma
• autoradiografija kromosoma boba (Vicia faba)

⚫ Matthew Meselson i Franklin Stahl (1958.)
• replikacija genoma bakterije E.coli
• teški izotop dušika i centrifugiranje u gradijentu CsCl

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Objasni pokus H.Taylora

A

autoradiografija metafaznih kromosoma u stanicama korijena boba
⚫ jedna replikacija u prisustvu radioaktivnog timidina (3H-dTTP)
⚫ ostale replikacije DNA bez prisutnosti radioaktiviteta

bakterija E. coli uzgojena na podlozi s teškim izotopm dušika (jedini izvor dušika u podlozi bio je 15NH4Cl) – “teška DNA”
 uzgoj bakterije koja sadrži “tešku DNA” nastavljen u podlozi s uobičajenim izotopom dušika (14N)
 izolacija DNA u vremenskim razmacima
 centrifugiranje DNA u gradijentu gustoće 6M CsCl
⚫ 24 do 72 sata pri 450.000 g
⚫ nastaje gradijent gustoće CsCl (1,66 do 1,76 g/mL)
⚫ molekule DNA pozicioniraju se u području gdje je gustoća CsCl jednaka “gustoći plutanja” DNA
⚫ položaj DNA u kiveti se detektira mjerenjem apsorbancije pri 260 nm

centrifugiranje u gradijentu CsCl
Moguće razdvajanje
⚫ lake DNA i teške DNA
⚫ DNA i RNA
⚫ ssDNA i dsDNA
⚫ DNA različitog GC/AT-sastava

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Objasni pokus M. Meselson i F. Stahl

A

uzgoj bakterija u podlozi s 15N-teška DNA
 prva generacija u podlozi s 14N-teška/laka DNA(lanac normalan drugi teški)
 druga generacija u podlozi s 14N-2mol.sa lakom DNA(oba lanca laka),2 teška/laka DNA(1 L teški, drugi laki)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Što je napravio A. Kornberg ?

A

otkrio DNA - polimerazu

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Tko je odgovoran za otkriće DNA-polimeraze?

A

A. Kornberg

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

što su radili i zaključili A. Kornberg i suradnici?

A

izolirana prva DNA-polimeraza iz bakterije E. coli
 A. Kornberg i suradnici:
⚫ na temelju prethodnih istraživanja zaključili da su preteče (prekursori) za sintezu DNA deoksiribonukleozid-5’-trifosfati
⚫ koristili radioaktivne nukleotide (dTTP) i činjenicu da se DNA može dobiti u talogu, dok slobodni nukleotidi ostaju u (otopini) supernatantu
 inkubacija ekstrakta stanica E. coli i dNTP (32P- ili 14C-dTTP)
⚫ radioaktivni talog
⚫ pročišćavanje enzima
⚫ DNA-polimeraza (DNA-polimeraza I)
• za pripremu 500 mg čistog enzima bilo je potrebno ~100 kg stanica
⚫ detaljna biokemijska analiza

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Objasni građu, ulogu i kako radi DNA- polimeraza I )

A

sadrži jedan polpeptidni lanac molekulske mase 103 kDa
 za sintezu DNA zahtjeva
⚫ sva četiri deoksiribinukleozid-5’-trifosfata – dATP, dTTP, dCTP, dGTP (dNTP)
⚫ Mg2+
⚫ „kalup” (jednolančana DNA) i klicu sa slobodnom 3’-OH skupinom
ili
⚫ dvolančanu DNA koja sadrži jednolančane lomove (slobodnu 3’-OH skupinu)
 sintetizira DNA u smjeru 5’-3’
⚫ produljuje 3’-kraj
⚫ nukleofilni napad 3’-OH skupine (na 3’-kraju klice) na α-atom fosfora deoksiribonukleozid trifosfata
 brzina sinteze – 10 nt/s

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Navedi i pojasni enzimske aktivnosti DNA-polimeraze I .

A

5’-3’ polimerazna aktivnost (kalup, klica, dNTP, Mg2+)

3’-5’ egzonukleazna aktivnost
lektorirajuća (proofreading) aktivnost
⚫ stimulirana krivo sparenim
nukleotidom na 3’-kraju

5’-3’ egzonukleazna aktivnost
⚫ na jednolančanim lomovima u dvolančanoj DNA
⚫ stimulirana 5’-3’ polimeraznom aktivnošću

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

što su napravili Paulo de Lucia i ]. Cairns

A

izolirali mutanta E. coli čiji je ekstrakt stanica pokazivao samo 0,5 do 1% polimerazne aktivnosti DNA-polimeraze I
• nazvan polA 1
• ima isto generacijsko vrijeme kao i divlji tip (!?) ali puno osjetljiviji na djelovanje mutagena
• DNA-polimeraza I odgovorna je za popravak DNA, a za replikaciju DNA odgovoran je neki drugi enzim
• DNA-polimeraza I nije “replikaza”

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Objasni DNA pol. II. i III.

A

kao i DNA-polimerazi I, potrebna im je klica s 3’-OH te imaju 5’-3’ polimeraznu i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost
• nemaju 5’-3’ egzonukleaznu aktivnost

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Tko je izolirao mutanta E. coli čiji je ekstrakt stanica pokazivao samo 0,5 do 1% polimerazne aktivnosti DNA-polimeraze I

A

Paula De Lucia i J. Cairns

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Tko je otkrio da DNA- polimeraza nije odgovorna za replikaciju DNA?

A

Paula De Lucia i J.Cairns

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

što su napravili R. i T.Okazaki, K. Sakabe i T. Ogawa

A

iz bakterije E.coli izolirali kratke jednolančane fragmente DNA (Okazakijevi fragmenti)

do 1960-ih godina smatralo se da se DNA polimerizira kontinuirano u oba smjera (5’-3’ i 3’-5’)
⚫ DNA se ne sintetizira u smjeru 3’-5’
⚫ inaktivacija DNA-ligaze rezultira većom količinom Okazakijevih fragmenata

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Tko je otkrio da se DNA sintetizira u smjeru 3’-5’?

A

R. i T. Okazaki, K. Sakabe i T. Ogawa

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Kako teče sinteza lanaca DNA?

A

DNA-polimeraza sintetizira DNA u smjeru 5’-3’ (produljuje 3’-kraj)
 komplementarni lanci DNA su antiparalelni
 sinteza jednog lanca je kontinuirana (vodeći lanac), a drugog diskontinuirana (kasneći, tromi lanac) – Okazaki fragmenti
 vodeći lanac – potrebna je sinteza samo jedne klice
 kasneći lanac – klica je potrebna za sintezu
svakog Okazaki fragmenta

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Kada su potrebne kIice pri replikaciji DNA?

A

vodeći lanac – potrebna je sinteza samo jedne klice

 kasneći lanac – klica je potrebna za sintezu svakog Okazaki fragmenta

18
Q

koji enzimi sudjeluju u sintezi kasnećeg lanca DNA i što rade ?

A

u sintezi kasnećeg lanca sudjeluju:
⚫ primaza (RNA-polimeraza)
⚫ DNA-polimeraza I
⚫ DNA polimeraza III
⚫ DNA-ligaza

1 – primaza sintetizira RNA-klicu
(10-12 nt)
2 – DNA-pol III sintetizira Okazaki
fragmente (E. coli: 1000-2000 nt;
eukarioti: ~200 nt)
3 – DNA-pol I degradira RNA i
sintetizira DNA (RNA se
zamjenjuje s DNA)
4 – DNA-ligaza povezuje (ligira)
Okazaki fragmente

19
Q

Što radi RNA - polimeraza?

A

primaza sintetizira RNA-klicu
(10-12 nt)

20
Q

što radi DNA-polimeraza I

A

DNA-pol I degradira RNA i sintetizira DNA (RNA se
zamjenjuje s DNA)

21
Q

Što radi DNA polimeraza III

A

DNA-pol III sintetizira Okazaki fragmente (E. coli: 1000-2000 nt; eukarioti: ~200 nt)

22
Q

Što radi DNA-ligaza?

A

DNA-ligaza povezuje (ligira) Okazaki fragmente

23
Q

Kakva je replikacija DNA

A

bidirekcionalna

24
Q

zašto je bitno razdvajaje komplementarnih lanaca i što to omogućuje?

A

komplementarni lanci kalupa moraju se razdvojiti kako bi se mogli spariti s deoksiribonukleotid trifosfatima
 razdvajanje lanaca omogućuju:
⚫ DNA-helikaza
• kreće se u smjeru 5’-3’ po kasnećem lancu, heksamerni protein
• može odmotati 1000 pb/s, potrebna hidroliza ATP-a
⚫ protein SSB (“single-strand DNA-binding”) – tetramer, 74 kDa
• sprječavaju sparivanje baza i formiranje strukture ukosnice
⚫ topoizomeraze (giraza)

25
Q

građa i uloga primaze

A

primaza (protein DnaG)
⚫ kodirana genom dnaG
⚫ jedan polipeptidni lanac (60 kDa)
⚫ sintetizira RNA-klicu (10-12 nt)

26
Q

građa i uloga helikaze

A

helikaza (protein DnaB)
⚫ kodirana genom dnaB
⚫ razdvaja komplementarne lance dvolančane DNA
⚫ interakcijom s primazom osigurava inicijaciju sinteze Okazaki fragmenata

27
Q

građa DNA-polimeraze III holoenzima

A

sastoji se od 10 različitih proteina (900 kDa) – ukupno 17 polipeptidnih lanaca organiziranih u 4 različita kompleksa
⚫ dvije srži enzima sinteza DNA (polimeraza)
⚫ dva β-kompleksa (“clamp”)
• procesivnost polimeraze
⚫ γ-kompleks (“clamp loader”)
• postavlja “clamp” na DNA
⚫ τ-kompleks (dimerizacijski kompleks)
• povezuje dvije srži enzima

četiri različita kompleksa
⚫ katalitička srž (srž enzima)
• sastoji se od 3 podjedinice (polipeptida)
• α – polimerazna aktivnost (5’-3’)
• ε – lektorirajuća aktivnost (egzo-3’-5’)
• θ – stimulira egzonukleaznu aktivnost
⚫ dimerizacijski kompleks (τ-kompleks)
• sastoji se od dvije τ-podjedinice
• povezuje dvije katalitičke srži
⚫ β-kompleks (β-dimer) – “clamp” (obujmica, prsten)
• odgovoran za procesivnost katalitičke srži
• drži katalitičku srž na DNA-kalupu
• sastoji se od dvije β-podjedinice koje tvore prstenastu strukturu oko DNA
⚫ γ-kompleks – “clamp loader” – sastoji se od 5 polipeptidnih lanaca
• postavlja β-dimer (“clamp” na DNA-kalup)

jedna srž enzima sintetizira vodeći, a druga kasneći lanac
 γ-kompleks (“clamp loader”)
⚫ povezan je s srži koja sintetizira kasneći lanac
⚫ postavlja β-dimer (“clamp”) – omogućava asocijaciju srži enzima s DNA-kalupom (vodeći i kasneći lanac)
⚫ skida β-dimer – omogućava disocijaciju srži enzima sa DNA-kalupa pri završetku sinteze Okazaki fragmenta (kasneći lanac)
 za α-podjedinicu (130 kDa) kodira gen dnaE
 za ε-podjedinicu kodira gen dnaQ
⚫ mutacija u genu dnaQ
• smanjena preciznost replikacije za oko 1000
• stanica je mutator (ima mutator fenotip)

28
Q

objasni β-kompleks DNA-polimeraze III holoenzima

A

dva β-kompleksa (“clamp”)
• procesivnost polimeraze

“clamp” (obujmica, prsten)
• odgovoran za procesivnost katalitičke srži
• drži katalitičku srž na DNA-kalupu
• sastoji se od dvije β-podjedinice koje tvore prstenastu strukturu oko DNA

29
Q

Objasni γ-kompleks DNA-polimeraze III holoenzima

A

γ-kompleks – “clamp loader” – sastoji se od 5 polipeptidnih lanaca
• postavlja β-dimer (“clamp” na DNA-kalup)

povezan je s srži koja sintetizira kasneći lanac
⚫ postavlja β-dimer (“clamp”) – omogućava asocijaciju srži enzima s DNA-kalupom (vodeći i kasneći lanac)
⚫ skida β-dimer – omogućava disocijaciju srži enzima sa DNA-kalupa pri završetku sinteze Okazaki fragmenta (kasneći lanac)

30
Q

objasni τ-kompleks DNA-polimeraze III holoenzima

A

dimerizacijski kompleks (τ-kompleks)
• sastoji se od dvije τ-podjedinice
• povezuje dvije katalitičke srži

31
Q

Objasni srž enzima

A

kataliticka srž
sastoji se od 3 podjedinice (polipeptida)
• α – polimerazna aktivnost (5’-3’)
za α-podjedinicu (130 kDa) kodira gen dnaE
• ε – lektorirajuća aktivnost (egzo-3’-5’)
za ε-podjedinicu kodira gen dnaQ
mutacija u genu dnaQ
• smanjena preciznost replikacije za oko 1000
• stanica je mutator (ima mutator fenotip)
• θ – stimulira egzonukleaznu aktivnost

32
Q

koji gen kodira za α-podjedinicu

A

dnaE

33
Q

koji gen kodira za ε-podjedinicu

A

dnaQ

34
Q

Pojasni replikaciju DNA – bakterije E. coli , uvjeti pocetka i vrijeme

A

genom E. coli je kružna molekula DNA koja ima
jedno ishodište replikacije
 replikacija započinje na ishodištu replikacije oriC
 replikacijske vilice kreću se (500-1000 pb/s) u
suprotnim smjerovima
brzina replikacije: ~50 kb/min (eukarioti 2 do 3 kb/min)
 brzina transkripcije: ~2,4 kb/min
 za replikaciju cijelog genoma potrebno ~40 minuta, ali u idealnom uvjetima generacijsko vrijeme E. coli može biti i kraće od 20 min
 u idealnim uvjetima replikacija započinje svakih 20ak minuta, a to je regulirano metilacijom DNA u sekvenciji GATC (metilaza Dam)
⚫ ishodište repikacije oriC sadrži 11 GATC-sekvencija
⚫ metilacija kasni za replikacijom; replikacija može započeti samo ako je ishodište metilirano (na hemimetiliranom ishodištu vezan je protein koji onemogućava inicijaciju replikacije)

35
Q

Objasni inicijaciju replikacije DNA – E. coli

A

ishodište replikacije – sekvencija oriC
⚫ duljina - najmanje 254 pb
⚫ sadrži dvije AT-bogate regije (jedna je duga 9, a druga 13 pb)
• 9 pb (ponovljena 4 puta) – TTATNCANA
• 13 pb (ponovljena 3 puta – GATCTNTTNTTTT
13##13###13####9################9###9###9
 potrebno šest različitih proteina (prije vezanja primaze DnaG)
⚫ DnaA (20 do 40 molekula) – potreban samo za inicijaciju
⚫ helikaza DnaB, DnaC, HU, giraza i SSB
⚫ razdavjanje do 60 pb – vezanje primaze koja sintetizira RNA-klicu

molekule DnaA najprije se vežu na sekvencije duljine 9 pb, a zatim stupaju u interakciju i sa sekvencijama duljine 13 pb
⚫ DNA se savija u obliku omče (savijanje DNA
potpomaže protein HU)
 vezanje dva kompleksa helikaze DnaB i DnaC
⚫ po jedan za svaku replikacijsku vilicu
⚫ DnaC postavlja helikazu DnaB na jednolančanu
DNA (kalupi kasnećih lanaca)
 helikaza počinje razdvajati lance
 vezanje primaze DnaG koja sintetizira RNA-klicu
na vodećem i kasnećem lancu
 struktura promjera ~6 nm (480 kDa)

36
Q

koje su osnovne komponente neophodne za replikaciju genoma E. coli

A

 inicijacija na ishodištu oriC
⚫ primosom - DnaA, DnaB, DnaC, HU, giraza, SSB
 DNA-polimeraze
⚫ DNA-polimeraza III holoenzim
⚫ DNA-polimeraza I
 RNA-polimeraza
⚫ primaza DnaG
 protein SSB
 DNA-ligaza (+NAD)
 za replikaciju genoma E. coli potrebno je više od 20 različitih proteina

37
Q

objasni terminaciju replikacije genoma bakterije E. coli

A

na ter-sekvencije se veže protein Tus (antihelikazna
aktivnost)
 obzirom na orjentaciju ter-sekvencije, protein Tus
zaustavlja replikacijsku vilicu koja mu prilazi s jedne
ili s druge strane

38
Q

Objasni replikaciju kromosoma u eukariota

A

bidirekcionalna (kao i u prokariota)
 kromosomi eukariota su linearne molekule DNA
⚫ replikacija krajeva kromosoma (telomeraza i telomere)
 DNA eukariota je kromatinizirana (histoni)
 replikacija DNA događa se samo u jednoj fazi staničnog ciklusa
⚫ brzina replikacije: do 50 pb/s (više od 10 puta sporije nego u E. coli)
⚫ genomi eukariota su veći od genoma prokariota
 prosječni kromosom čovjeka
⚫ 150.000.000 pb (genom E. coli: 4.700.000)
⚫ replikacija ovog kromosoma s jednog ishodišta replikacije trajala bi 3∙106 s (~830 sati; ~35 dana)
⚫ u genomu eukariota ima više ishodišta replikacije (S. cerevisiae: ~400; H. Sapiens: ~10.000) koja su udaljena 30 do 250 kb

puno složenija regulacija inicijacije replikacije
 veći broj proteina
 još uvijek ima puno nepoznanica
 inicijacija
⚫ DNA-polimeraza α i primaza
 elongacija
⚫ vodeći lanac: DNA-polimeraza δ
⚫ kasneći lanac: DNA-polimeraza δ ili DNA-polimeraza ε
 mitohondrij
⚫ replikacija i popravak DNA: DNA-polimeraza γ

39
Q

Objasni metiIaciju DNA bakterije E. coli

A

 u “staroj” DNA sve GATC-sekvencije su metilirane (N6-metiladenin)
 nakon replikacije DNA je hemimetilirana jer novosintetizirani lanac nije metiliran
 hemimetilirana DNA je supstrat za protein Dam (metilaza kodirana genom dam) koja metilira adenin u nemetiliranom lancu
metilacija GATC-sekvencija kasni za replikacijom oko 13 minuta
 mutanti dam imaju fenotip mutatora (povećana učestalost mutacija)

40
Q

Pojasni MMR-sustav bakterije E. coli

A

 MMR (“mismatch repair”) - sustav za popravak nesparenih i krivo sparenih baza
 osnovni proteini MMR-sustava E. coli
⚫ MutS i MutL
• prepoznavanje nesparenih i krivo sparenih baza
⚫ MutH
• prepoznavanje i zasjecanje hemimetilirane GATC-sekvencije
⚫ UvrD, SSB, egzonukleaze, DNA-polimeraza III, DNA-ligaza
 metilacija usmjerava popravak čak i ako je sekvencija GATC udaljena i više od 1 kb – popravak prema metiliranom (“starom”) lancu

protein MutS se veže na krivo spareni par baza
 na protein MutS veže se protein MutL
 kompleks MutS-MutL translocira se do sekvencije GATC i veže se
protein MutH – nastaje omča
 protein MutH cijepa nemetilirani lanac u sekvenciji GATC
⚫ nastaje jednolančani lom
 nemetilirani lanac se degradira u smjeru od jednolančanog loma do
krivo sparenog para baza (uključujući i krivo sparenu bazu)
⚫ helikaza UvrD (ATP) i protein SSB
• 5’-3’ – Exo VII ili RecJ
• 3’-5’ – Exo I, Exo VII ili Exo X
 resinteza nemetiliranog lanca – DNA-polimeraza III
 stvaranje fosfodiesterske veze – DNA-ligaza (NAD+
)

Molekularna genetika (8 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions