splaats specifieke mutagenese

Question 1

oplossing codon bias

Answer 1

site-directed mutagenese (plaatspecifieke)

Question 2

plaats specifieke mutagenese

Answer 2

= seq op spec plaats veranderen > codon toepasbaar in gastheer, finale EW blijft
= oligonucleotide-gedirigeerde mutagenese
> controle via sequenering

Question 3

RE herkenningsplaats

Answer 3

verknipping (te muteren site) > exonuclease
> deletie / insertie (synthetische oligonucleotide)
> ssDNA verwijderd (S1 nuclease)
> ligatie
> AGEF (selectie gemut
> transformeren > unieke kolonies, unieke mutatie

Question 4

primer-gebaseerde plaats specifieke mutagenese met 2 PCR rondes + tekening

Answer 4

mismatch annealing
> lineaire fragmenten
> 4 primers (2 mismatch AB, 2 match DC)
> PCR reactie AD & BC
p65

Question 5

primer-gebaseerde plaats specifieke mutagenese met selectie methoden

Answer 5

> circulair DNA
PCR 2 primers (match & mismatch)
vormt lineair dsDNA + nicks > ligase
scheiden moeilijker (DpnI of dut-ung selectie)
transformatie kolonie > sequenering

Question 6

Dpni endonuclease selectie

Answer 6

parentale plasmide in E.coli (dam+/dcm+) > methyleren
> 2 mismatch primers
- hemi-gemethyleerd DNA gevoelig afbraak Dpni endonucl.
- recombinant DNA niet gemethyleerd, intact
> transformatie E. coli, nick hersteld

Question 7

selectie verwijdering RE + tekening

Answer 7

mutagene primer + selectieprimer (RE herk. verwijderen)
> beide op ssDNA zelfde richting & anealen zelfde ssDNA parentale
> DNA polymerase, dNTPs, ligase
» hybride
- pDNA isolatie (RE > parentaal verknipt)
- transformeren
p66

Question 8

de kunkel in vivo selectiemethode + tekening

Answer 8

> template in dut-/ung- E.coli
- dut-mut inactiveert dUTPase > U ipv T
- ung-mut inactiveert U-N-glycosidase > U niet verwijdert
te muteren insert in fasmide > ss replicatie (f1/M13 ori)
plasmide met U isoleren, ss variant maken
- mismatch primer, klenow, dNTPs, ligase, ATP
> hybride
transformeren in E.coli (dut+/ung+)
- U -> A
p66-67