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bich study > Techniques Biochimiques FINAL > Flashcards

Techniques Biochimiques FINAL Flashcards

Dosage protéique, WB et ELISA

1
Q

4 méthodes sont couramment utilisées pour la dosage protéique

A

– Absorption UV de chaînes latérales (280 nm)

– Réactions chromogéniques sous conditions alcalines (test Biuret) ou (BCA)

– Liaison d’un chromophore à la protéine (test Bradford) ou (Coomassie)

– Dot-blotting (immobilisation protéine sur membrane suivie d’une coloration de la membrane)

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Q

Quelles sont les substances interférentes pour le dosage à l’absorbance UV?

A
  • Acides nucléiques
  • Acides,
  • Détergents
  • Sels
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Q

Quelles sont les substances interférentes pour le dosage BCA?

A
  • Agents réducteurs
  • Agents chéalteurs
  • Lipides
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4
Q

Quelles sont les substances interférentes pour le dosage Coomassie?

A

Détergents

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Q

Quelles sont les substances interférentes pour le dosage Dot-blot?

A

Aucune substance interférente.

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6
Q

dans quelle milieu est-ce que le test de bradford se passe?

-Acide
-Alcalin

A

Acide

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7
Q

Quelle colorant va se lier aux protéines lors de la teste bradford?

A

Un colorant Coomassie

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8
Q

Quelle couleur se produit lors de la liaison d’une colorant coomassie à une protéine lors de la teste Bradford?

A

une coloration bleue (595 nm)

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9
Q

Quelles résidus de la protéine est-ce que le colorant coomassie va se lier lors de la teste Bradford?

A

Les résidus basiques (Arg) et aromatiques.

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10
Q

Quelles sont les deux standards qu’on utilise usually lors d’une test Bradford?

Quelle sont leur gamme de concentration?

A

BSA (125 - 1000ug/mL)
ou
IgG (125 - 1500ug/mL)

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11
Q

Définit : Protéine totale (mg)

A

quantité de protéine présente dans la fraction

(obtenue en déterminant la concentration de protéine dans chaque fraction et en multipliant par le volume total des fractions)

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12
Q

Définit : Activité totale

A

activité enzymatique pour chaque fraction
(obtenue en mesurant l’activité enzymatique dans le volume de fraction utilisé puis multiplié par le volume total des fractions)

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13
Q

Activité spécifique :

A

activité totale / protéine totale

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14
Q

Définit :Rendement

A

mesure de l’activité « retenue » après chaque étape de purification en % de l’activité de l’extrait brut
(quantité totale d’activité dans l’extrait initial est admise comme étant 100%)

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15
Q

Taux de purification :

A

mesure de l’augmentation de la pureté
(activité spécifique à chaque étape / activité spécifique de l’extrait brut)

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16
Q

Quelles sont les 5 mesures de purification d’une protéine?

A
  1. Protéine totale
  2. Activité totale
  3. Activité spécifique
  4. Rendement
  5. Niveau de purification (taux de purification)
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17
Q

Au cours de les différentes étapes de purification, est-ce qu’on s’attend à une augmentation ou une diminution des mesures suivantes?

  1. Protéine totale
  2. Activité totale
  3. Activité spécifique
  4. Rendement
  5. Niveau de purification
A
  1. Protéine totale ↓ (dim)
  2. Activité totale ↓ (dim)
  3. Activité spécifique ↑ (aug)
  4. Rendement ↓ (dim)
  5. Niveau de purification ↑ (aug)
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18
Q

C’est quoi un électrophorèse?

A

Déplacement de molécules chargées dans un champ électrique.

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19
Q

Vitesse de migration dépendante de 6 facteurs :

A
  • Intensité en Volts
  • Forme/Poids moléculaire
  • Charge de la molécule au pH du milieu
  • Température
  • Durée de migration
  • Concentration en acrylamide (pore size)
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20
Q

Pour le SDS-PAGE, quelle caractèristique va être exploité afin de séparer les protéines?

A

Taille / poids moléculaire

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21
Q

Pour le PAGE non-dénaturant, quelle caractèristique va être exploité afin de séparer les protéines?

A

Densité de charge de la molécule

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22
Q

Pour le focalisation isoélectrique, quelle caractèristique va être exploité afin de séparer les protéines?

A

Charge de la protéine au pH du milieu

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23
Q

Pour l’électrophorèse 2D, quelles caractèristiques va être exploité afin de séparer les protéines? (2)

A

charge au pH du milieu ET poids moléculaire

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24
Q

Est-ce que les électrophorèses sont toujours sur gel?

A

non, il en existe sur papier aussi
- Papier flitre
- Acétate de cellulose

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25
Q

Nomme les trois gels qu’on utilise pour un électrophorèse

A
  • Amidon
  • Agarose (acides nucléiques)
  • Polyacrylamide (protéines)
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26
Q

La réaction de _____ avec _____ va initier la polymérisation de l’acrylamide avec le bisacrylamide.

A

TEMED avec persulfate d’ammonium

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27
Q

Le degré de réticulation du gelpeut être régulé par le % de _____________ utilisé

A

bisacrylamide (On l’appelle l’agent réticulant)

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28
Q

%T vs %C

A

%T : pourcentage total de la concentration (en g) des monomères par 100mL (usually inverse à la taille des pores.)

%C : pourcentage en poids de l’agent réticulant bisacrylamide par rapport à la quantité totale de monomères

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29
Q

quelle est l’équation du %T

A

%T = [ ( g acrylamide + g bisacrylamide) / 100 mL ] x 100

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30
Q

quelle est l’équation du %C

A

%C = [ ( g bisacrylamide / g acrylamide + g bisacrylamide ) ] x 100

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31
Q

SDS-PAGE vs PAGE native

A

SDS-PAGE
- séparation selon le poids moléculaire
- dénaturant
- utilisé pour vérifier la pureté des protéines

Native PAGE
- Séparation selon la densité de charge et la forme
- non-dénaturant
- on peut réutiliser les protéines

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32
Q

Que fait SDS?

A

uniformise la densité de charge portée par les protéines

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33
Q

Que fait le Mercaptoéthanol?

A

réduction des ponts disulfures

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34
Q

Gel continus vs Gel discontinus

A

Gels continus
* Tampon unique
* Concentration en acrylamide constante dans le gel
Gels discontinus
* Tampons différents
* Présence d’un gradient de concentration d’acrylamide dans le gel

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35
Q

Avantages du système PAGE discontinu

A

permet d’utiliser…

Des volumes larges (dizaines de uL)
et
Des protéines diluées

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36
Q

Quelles sont les deux composantes qui ne sont pas présentes dans une PAGE native comparé à une SDS-PAGE?

A

pas de SDS
pas de mercaptoéthanol

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37
Q

Que fait le Glycérol dans un PAGE?

A
  • Glycérol : visqueux et très dense facilite la sédimentation au fond du puits
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38
Q

Que fait le Mercaptoéthanol dans un PAGE?

A
  • Mercaptoéthanol : dénaturation protéique par réduction des ponts disulfures
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39
Q

Que fait le Bleu de bromophénol dans un PAGE?

A
  • Bleu de bromophénol : petite molécule colorée permet de suivre la progression de la migration
40
Q

Combien de bandes est-ce qu’on devrait voir dans le gel de tassement?
a. 1
b. >1

A

1

41
Q

Combien de bandes est-ce qu’on devrait voir dans le gel de séparation?
a. 1
b. >1

A

> 1 (unless notre protéine était like hella pur)

42
Q

Les protéines à faibles poids moléculaires vont migrer plus loin dans un SDS-PAGE

Vrai ou faux?

A

Vrai!

43
Q

quelle est la pH du gel de tassement?

A

pH : 6.8

44
Q

Quelles deux ions sont importantes dans la migration protéique?

A

Les ions Glycine

Les ions Chlorures

45
Q

avant l’application du champ électrique, les ions glycine et chlorure sont chargés ____.

A

négativement

46
Q

Quelle ion va prendre du retard dans le gel de tassement? Pourquoi?

A
47
Q

On appelle aussi le gelde séparation le gel de ________

A

Résolution

48
Q

Pourquoi les protéines ne se séparent pas dans le gel de tassement?

A
  • Concentration en acrylamide est trop faible (3%)
  • Phénomène d’isotachophorèse dû aux mobilités différentes des 3 espèces chargées (chlorure, protéines, glycine) qui se dirigent vers l’anode.
49
Q

Que veut dire isotachophorèse?

A

Phénomène où les espèces de différentes mobilités électrophorétiques migrent à la même vitesse (formation d’un sandwich concentré).

  • Ions Cl- se déplacent en avant
  • Ions glycinate sont à la traîne
  • Protéines se déplacent en sandwich entre les 2 autres ions

Tout ça à la même vitesse

50
Q

Quand on applique un courant, les ions glycines (qui se trouvent dans le tampon électrode) vont passer d’un pH de ___ à un pH de ___ quand ils entrent dans le gel de tassement

A

Ils vont passer d’un pH de 8.3 à un pH de 6.8

51
Q

La glycine passe d’une charge nette négative à une forme

A

zwitterion

52
Q

c’est quoi la forme zwitterion?

A

la forme la plus abondante dans les organismes vivants

53
Q

Les protéines traitées au SDS qui sont chargées
négativement se déplacent moins vite que le chlorure, car _______, mais plus vite que la glycine, car _____. (Sandwich!)

A

a. ils sont plus lourdes que les ions chlorures

b. ils sont plus chargées négativement que les ions glycines

54
Q

quelle est la pH du gel de séparation?

A

pH : 8.8

55
Q

quoisse qui arrive à la glycine quand il rentre dans le gel de séparation?

A

dû au pH de 8.8, la glycine redevient négative et acquiert une mobilité plus élevée pour rejoindre les chlorures laissant les protéines à l’arrière

Sandwich is no more.

56
Q

Quelle est la facteur qui va séparer les protéines dans le gel de séparation?

A

le concentration élévé en acrylamide (7%)

57
Q

Trois stratégies de détéction des bandes protéiques après l’électrophorèse (3)

A
  1. Détection avec des colorants organiques
    • ex: Coomassie blue
    • proportionnelle aux AA basiques des protéines
  2. Détection avec des sondes fluorescentes
    • ex: sonde SPYRO
    • sonde fluorescente
      -compatible avec Mass Spec.
  3. Détection par liaison d’un métal
    • ex: Coloration à l’argent
    • la plus sensible
58
Q

Comment on sait la poids moléculaire d’une bande?

A

On lui compare à une bande sur notre échelle.

La masse moléculaire des bandes de l’échelle sont connues.

59
Q

5 étapes d’un western blot :
(ou 6)

A
  • Électrophorèse
  • Transfert des protéines du gel vers une membrane appropriée
  • Blocage
  • Adsorption d’anticorps (primaire, secondaire) et lavages
  • Détection
60
Q

Donne les couches du sandwich dans l’ordre (top to bottom) du transfert pour un western blot (6)

A

Cathode (-)
- Papier filtre
- Gel
- Membrane
- Papier filtre
Anode (+)

61
Q

Quelle facteur va faire en sorte que les protéines du gel vont transférer à la membrane?

A

Un champ éléctrique est passé perpendiculairement au gel.

Cathode
(-)
_____________ gel
______↓______membrane

	Anode
	(+)
62
Q

Quelle est le rôle du papier filtre lors du transfert?

A

Protéger le membrane et le gel

63
Q

Deux facteurs essentielles à une transfert efficace.

A
  • Bonne contact entre le gel et le membrane (éviter bulles)
  • Placer la membrane entre le gel et l’anode (+) pour faciliter le transfert des protéines chargées (-)
64
Q

2 types de membranes:

A

Nitrocellulose et PVDF

65
Q

Avantage (1)
et
Désavantage (1)

de la membrane de NITROCELLULOSE

A

Av.
- Haute affinité/rétention protéique

Dés.
- Fragile (Pas idéale pour l’immunobuvardage répété.)

66
Q

Avantage (1)
et
Désavantage (1)

de la membrane de PVDF

A

Av.
- Résistant (Meilleur pour l’utilisation répétée)

Dés.
- Bruit de fond (background) plus élévée

67
Q

PVDF acronyme : (prob not important but whatevs)

A

Poly-Vinylidene Di-Fluorure

68
Q

Quelle est le tampon de transfert pour un SDS-PAGE?

A

Tampon Towbin
(25 mM Tris pH 8.3, 192 mM glycine, 20% v/v méthanol)

69
Q

Pourquoi est-ce qu’on colore la membrane après un transfert? Nommer deux colorants.

A

pour s’assurer que le transfert s’est bien effectué

Rouge de Ponceau et Amido black

70
Q

Quelle est le rôle du bloquage et quelles substances est-ce qu’on va utiliser?

A

Rôle: La membrane va se lier à n’importe quelle protéine. De ce fait, afin d’éviter une adsorption non spécifique des anticorps sur la membrane on va occuper toutes les sites disponibles avec des protéines qui proviennent de ces composés.

Lait 5% dans du TBS-T (Caséine)
ou du BSA 5% (Albumine)
ou du Gélatine de poisson (Not sure quelle protéine)

71
Q

Comment savoir la dilution d’anticorps nécessaire?

A

voir les directives du fournisseur ou déterminer expérimentalement.

72
Q

Pourquoi c’est important d’avoir la bonne concentration d’anticorps?

A

TROP : liaison non-spécifique et background↑

PAS ASSEZ : très spécifique mais signal faible

73
Q

Quand est-ce qu’on fait les lavages de la membrane? Quelle est le tampon de lavage?

A

Des lavages ont lieu après le
* Blocage
* Ajout anticorps primaire
* Ajout anticorps secondaire

Tampon : TBS-T (Tris Buffered Saline with Tween)

74
Q

5 méthodes de détéction de WB (Western Blot)

A
  • Radioactivité (désuète) : anticorps marqué radioactivement
  • Anticorps conjugués à une enzyme (phosphatase alcaline, peroxydase de raifort) catalysant la réaction de détection
  • Colorimétrique
  • Chemiluminescente
  • Chemifluorescente
75
Q

Alternatives de l’emploi d’un Ac secondaire (2)

A
  • Protéine A et protéine G (reconnait les immunoglobulines de plusieurs espèces)
  • Avidine/steptavidine (reconnait la biotine conjugué à l’Ac prim.)
76
Q

Pourquoi est-ce que le WB est dite Sémi-quantitative?

A
  • des variations lors du dépôt des échantillons (électrophorèse) et du transfert des protéines sur la membrane
  • absence de linéarité sur les échelles de concentrations utilisées
77
Q

comment quantifier les WB?

A

Par densitométrie (mesurer la taille et l’intensité des bandes or something)

78
Q

Comment résoudre le problème suivant?
* Bandes inattendues

A
  • Dégradation protéolytique
79
Q

Comment résoudre le problème suivant?
* Absence de bandes

A
  • Anticorps/antigène/tampon incompatible
80
Q

Comment résoudre le problème suivant?
* Bandes à peine visibles

A
  • Faible concentration anticorps ou antigène
81
Q

Comment résoudre le problème suivant?
* Bruit de fond élevé sur membrane

A
  • Concentration élevée anticorps, tampons pas frais
82
Q

Un même blot peut être utilisé pour tester plusieurs anticorps différents donc détecter
différentes protéines sur le même gel. Comment es-ce qu’on va faire ça?

A

Avec le stripping!

On décolle toutes les anticorps de la membrane et on garde spécifiquement les protéines

(Lavage en présence de SDS + dithiothreitol (DTT) + chauffage pour dissocier l’antigène et son anticorps)

83
Q

Comment vérifier si notre stripping à fonctionné?

A

L’efficacité du stripping est vérifiée en incubant avec l’anticorps secondaire et en faisant le test de détection (test de détection négatif : réussite stripping

84
Q

3 types d’ELISA

A

directe
indirecte
sandwich

85
Q

avantage de l’ÉLISA directe

A

Rapide

86
Q

avantage de l’ÉLISA indirecte

A

Grande variété d’anticorps secondaires liés à des enzymes disponible

87
Q

Désavantage de l’ELISA directe (2)

A

ça prend du temps à designer un Ac primaire qui est fluorescent qui est spécifique à ton protéine.

et

Le comblage à une fluorophore peut tuer la spécificité à ta protéine.

88
Q

Désavantage de l’ELISA indirecte (2)

A

Plus grand # d’étapes

et

Réaction croisée de l’anticorps secondaire génére un manque de spécificité

89
Q

Définition d’un Antigène, ELISA indirecte

A

protéine à doser (analyte)

90
Q

Définition d’un Anticorps primaire, ELISA indirecte

A

anticorps dirigé contre l’antigène donc contre l’antgène

91
Q

Définition d’un Anticorps secondaire, ELISA indirecte

A

anticorps dirigé contre l’anticorps primaire, souvent contre la partie Fc

Conjugué à une enzyme pour la détéction.

92
Q

Définition d’un substrat, ELISA indirecte

A

ajouté lors de l’étape de détection, le substrat en présence de l’enzyme donnera un produit détectable

93
Q

Avantages de l’ELISA monoclonaux (2)

A
  • Production indéfinie via les hybridomes et spécificité élevée
  • Spécificité élevée réduit bruit de fond (interactions non spécifiques) et élimine les possibilités de réactions croisées (moins de susceptibilité de réagir avec des protéines semblables à l’Ag)
94
Q

Avantages de l’ELISA polyclonaux (3)

A
  • Faciles et rapides à produire donc moins coûteux
  • Moins sensibles aux changements sur l’antigène à cause de leur capacité à reconnaître plusieurs épitopes
  • Utile lorsque la nature de l’Ag n’est pas connue
95
Q

3 méthodes détéction (ELISA)

A
  • Colorimétrique :peroxydase de raifort / système phosphatase alcaline
  • Chemiluminescence : système peroxydase de raifort
  • Chemifluorescente : système peroxydase de raifort
96
Q

7 étapse pour la détéction (système phosphatase alcaline) (ELISA indirecte)

A

1 * Ajout antigène et période d’incubation : adsorption antigène
2 * Phase de lavage
3 * Agent bloquant (albumine bovine)
4 * Ajout anticorps primaire
5 * Phase lavage
6 * Ajout anticorps secondaire
7 * Ajout substrat de l’enzyme
8 * Ajout NaOH : arrêt réaction et développement coloration jaune (milieu basique)

bich study (18 decks)

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