TOPO/TA klonering

Question 1

topo-isomerase

Answer 1

veroorzaakt nicks & verbind -> graad supercoiling controleren

Question 2

procedure

Answer 2

• DNA topo-isomerase
• enzym covalent gebonden met fosfaat groep waar nick is, om efficient te verbinden
• PCR
• amplicon (insert met A overhang + vector met T overhang) ligatie
  -> sneller & efficienter dan T4 DNA ligase -> enzym verbonden met vector voor reactie

Question 3

vector TA-klonering

Answer 3

• blunt end op gewenste plaats + overhangende T aangehecht via terminaal transferase ddTTP
• Amp/Kan
• ori E. coli
• Plac promoter
• TOPO site (insert)
• LacZ -> bleu/white screening

Question 4

voordelen

Answer 4

simpel & snel
geen nood RE (primer additie)

Question 5

nadeel

Answer 5

geen orientatiecontrole