שיטות מחקר בביוכימיה

Question 1

EU

יחידת פעילות אנזימטית היא מדד ל…

Answer 1

EU- מדד הפעילות של האנזים הוא מדד לכמה אנזים יש לי בתמיסה

מס’ יחידות סובסטראט ההופכות לתוצר ביחידה זמן.

אין לקקה הזה נוסחא- בפועל מה שעושים זה ששמים אנזים בתמיסה ומודדים את הOD

בזמנים קצובים, ככה ככל שעכירות התמיסה משתנה יודעים מהו הEU לדוגמא:

Question 2

פעילות ספציפית

SA

היא מדד ל..

Answer 2

פעילו ספציפית היא מדד לדרגת הניקיון של האנזים

מחושב:

Question 3

ניצולת היא מדד ל…

Answer 3

ניצולת היא מדד לכמה אינזים איבדנו בתהליך באחוזים

Question 4

דרגת הניקיון מחושבת כ..

Answer 4

הבסיס לחישוב דרגת הניקוי בכל מקטע יהיה הפעילות הספציפית בתמיסת המוצא. כך נוכל להמחיש פי כמה ניקינו את האנזים יחסית לתמיסת המוצא.

Question 5

על פי חוק בר למברט

ככל שהתמיסה עכורה יותר (מרוכזת) כך היא…

בנוסף ציין מתי חוק זה מתקיים

Answer 5

תבלע יותר אור.

ככל שהתמיסה יותר עכורה (יותר חיידקים) ככה ערך הבליעה גבוהה יותר

*כאשר הבליעה גבוהה מ1.4 חייב למהול- רק בתווך הזה החוק מתקיים

Question 6

ציין מהוא כל משתנה במשוואה המתמטית של חוק בר למברט

Answer 6

Question 7

ציין את שלושת הדרכים להפקת לזיאט תאים וציין מה קורה לאברונים בכל שיטה

Answer 7

א. הומוגנציה – פירוק התאים על ידי בוכנה המפרקת אותם על ידי כוח פיסי. שיטה זו משמרת את האיברונים-שיטה דיי סלקטיבית (פשוט שמים בבלנדר)

ב. סוניקציה – שיטה המפרקת את ממברנות התאים על ידי גלי קול. אינו משמר את כל האיברונים- שיטה לא סלקטיבית

ג. שימוש בדטרגנט – חומר כימי הממיס את הממברנות של התא והאיברונים. אינו** **משמר את האיברונים כלל-שיטה הכי פחות סלקטיבית

אפשר גם לעשות ליזיס של תאים עם תמיסה היפוטונית - זה פשוט מפוצץ את התא

Question 8

אחרי שהכנו לזיאט תאים, אנחנו רוצים להתחיל להפריד את החומרים שיש בתמיסה בצנטריפוגה.

במה תלוייה רזולוצית ההפרדה?

Answer 8

ככל שנסרכז יותר זמן וב

RPM

יותר גבוהה, כך הפלט שיתקבל יהיה ברזולוציה יותר גבוהה

כלומר כדי להשקיע את החלבונים הממש קטנים אלו שבטיפולזמה לדוגמא צריך לרוץ הרבה זמן ובכוח ג’י גדול

Question 9

צינטריפוגה איזופיקנית מפרידה חומרים לפי ___ וזאת בניגוד לצינטריפוגה קלאסית (דפרינציאלית) שמפרידה לפי______

Answer 9

צינטריפוגה איזופיקנית מפרידה חומרים לפי צפיפות וזאת בניגוד לצינטריפוגה קלאסית (דפרינציאלית) שמפרידה לפי מסה מולארית

בצנטריפוגה איזופיקנית יש מפל ריכוזים (גרדיאנט) של סוכרוז, והיא מאפשרת הפרדה בעיקר על פי היחס בין החלבון לליפיד הקיים באברון

לכן זה גם פחות מתאים לחלבונים.. יותר לאברונים

Question 10

בסוף שלב 4 - פי כמה נקי האנזים בסוף ביחס להתחלה?

Answer 10

מהטבלה נעדר נתון קריטי שרק איתו אפשר לחשב את הניקיון

פעילות ספיציפיתSA

למעשה שואלים פה פי כמה גדל הSA

בסוף לעומת ההתחלה:

בהתחלה יש 170 יחידות אנזים על 42 מג חלבון

initial: EU/Tot protein=170/42=4.5~
final: EU/Tot protein=90/0.5=45

מכאן שהחלבון נקי פי 40

Question 11

מהי הניצולת בסוף התהליך?

Answer 11

חישוב ניצולת:

we need to divide

EU final/EU initial=90/170=0.52=52%

52%

ניצולת

Question 12

מה זה דיאליזה?

מתי נרצה להשתמש בשיטה זו?

מה חסרונות השיטה?

Answer 12

דיאליזה:

דיאליזה היא שיטה פרפרטיבית לבידוד חומרים באמצעות דיפוזיה פשוטה המבוססת על שקית עם חרירים קטנים שדרכם עוברים החוצה החלקיקים הקטנים והחלקיקים הגדולים נשארים בשקית

מתי נרצה להשתמש:

א. אם אנחנו מעבדה ענייה ממש

ב. אם אנחנו רוצים להפריד דברים ממש גדולים מדברים ממש קטנים

ג. טוב להחלפת בופר

מתי לא:

א. בגדול כבר לא כזה משתמשים כי זה שיטה עתיקה ויש דרכים טובות יותר. החיסרון העיקרי של השיטה הוא שהיא מאוד איטית מכיוון שהיא נסמכת נטו על דיפוזיה של חלקיקים שהולכת ומאטה את עצמה ככל שהריכוזים משתווים בשני צדי הממברנה.

Question 13

ג’ל פילטרציה size exclusion

כיצד עובדת השיטה?

איזה חלבונים יצאו ראשונים?

האם החלבונים עוברים דה נטורציה או לא?

ציין חסרונות (1) ויתרונות של השיטה (2)

Answer 13

ג’ל פילטריציה- היא שיטה שבה מבוצעת כרומטוגרפית גודל. ובעברית- לוקחים קולונה בה יש שתי פאזות: פאזה מוצקה ופאזה נוזלית.

הפאזה המוצקה- היא פולימר מסועף עם נקבוביות בגודל הרצוי -ספודקס

הפאזה הנוזלית- זה תמיסת החלבונים שלנו שמכילה חלקיקים שונים בגודלם

מזרימים את הפאזה הנוזלית דרך המדיום המוצק והחלבונים הגדולים יוצאים ראשונים כי הם לא מסתבכים בחרירים הקטנים של הפולימר.

.זה דומה למעבר ביער סבוך-קל יותר למשהו גדול לעבור ממשהו קטן

חסרונות השיטה: זה אידאלי רק לחלבונים גלובולרים

יתרונות:

א. נותנת גם נתונים אניליטים וגם פרפרטיבים- מבחינה אנליטית יש מידע חדש על החלבון כי אפשר להעריך את גודלו לפי נפח האילוציה הדרוש ליציאתו בהשוואה לחלבון ידוע

ב. שומרת על המבנה הנטיבי של החלבון- אין דה נטורציה!

Question 14

מהו מחליף אניונים?

מהו מחליף קטיונים?

Answer 14

בשני המקרים מדובר על קולונה טעונה במטען חשמלי שמהווה את הפאזה המוצקה ודרכה מעבירים את הפאזה הנוזלית שמכילה חלבונים.

מחליף אניונים- יקשור אניונים (כלומר הוא טעון חיובית)

מחליף קטיונים-יקשור קטיונים (כלומר הוא טעון שלילית)

Question 15

כאשר

PH < pI

המטעון הכולל החלבון יהיה?

Answer 15

חיובי

Question 16

כאשר

PH>pI

המטעון הכולל החלבון יהיה?

Answer 16

שלילי

Question 17

כאשר

ph=pI

המטען הכולל של החלבון יהיה?

Answer 17

צווטריון

Question 18

מהו המטען הכולל על הפפטיד הבא

Lys-Arg-Gln-Asp-Cys

PH=1

?

באיזה מחליף יונים תשמש כדי לקשור אותו לקולונה אם ידוע שתמיסת הבופר היא ב PH=1

Answer 18

בPH=1

המטען הכולל על הפפטיד הוא

+3

לכן נשתמש במחליף קטיונים- הוא יקשור קטיון כי הוא טעון שלילית

Question 19

במה שונה הג’ל המשמש לפוקוס איזואלקטרי מהג’ל הקלאסי המשמש לאלקטרופורזה?

א. בפוקוס איזואלקטרי משתמשים בג’ל עם חרירים גדולים בהרבה כדי לאפשר את הנדידה של החלבון השלם

ב.בפוקוס איזואלקטרי משתמשים ב’ג’ל עם אס.די.אס כדי ליצור מטען שלילי אחיד

ג.בפוקוס איזואלקטרי משתמשים בג’ל עם גרדיאנט פי.אייצ’ כדי לעודד ספקטרום רחב של מטעינים

Answer 19

תשובה ג

הג’ל בפוקוס איזואלקטרי מכיל גרדיאנט

PH

כאשר

PH>pI

והחלבון טעון שלילית הוא ינוע לעבר האנודה הטעונה חיובית.

Question 20

איך נחשב

PI

של חומצת אמינו חסרות שייר אר מתיינן

Answer 20

כאשר לחומצת האמינו אין שייר מתיינן

pI= Pka₁+Pka₂/2

Question 21

איך נחשב את ה

pI

עבור חומצות אמינו עם שייר R

קרבוקסילי?

Answer 21

pI= Pka₁+PkCOOH​/2

Question 22

איך נחשב את ה

pI

עבור חומצות אמינו עם שייר R

אמיני

Answer 22

pI= Pka₂+Pk_NH3​/2

Question 23

איך נחשב את ה

pI

עבור חומצות אמינו ששיר הR

המתיינן שלהם הוא לא אמיני ולא קרבוקסילי?

Answer 23

pI= Pka₁+Pk_COOH​/2

תקף עבור טירוזין -OH

ציסטאין-SH

להתייחס אליהם כמו חומצה קרבוקסילית כי הוא נהיה שלילי

Question 24

מהי כרומטוגרפית זיקה?

מתי אי אפשר להשתמש בה?

איך משחררים את החלבון שנקשר אליה?

Answer 24

כרומטוגרפיית זיקה מבוססת על קולונה שמכילה מדיון מוצק שיודע לקשור ספציפית את החלבון שאנו רוצים לבודד. זה יכול להיות באמצעות סובסטרט או נוגדן

כדי להפריד את החלבון הקשור אפשר לשים את הסובסטרט האמיתי - אם יש לו אפיניות יותר גובהה זה עדיף אבל בכללי זה פשוט יצור תחרות

אפשר לשנות PH

להוסיף מלח- זה מנתק את הקשרים

השיטה זאת טובה רק כשמכירים את החלבון,ורק רוצים לבודד אותו

Question 25

מהי שיטת

His Tag?

מה החסרונות וההיתרונות שלה?

Answer 25

היס טאג זה שיפור של הכרמוטוגרפית זיקה- בשיטות של הנדסה גנטית מנכיסים לפלסמיד המקודד לחלבון רצף של חמישה היסטדינים לאחר מכן מגדלים תרבית ואז לאחר הכנת הליזאט מעבירים את התמיסה דרך קולונת ניקל שאיתם יוצרים ההיסטדינים קשרים קואורדינטיבים והם ישארו קשורות לקולונה.

על מנת להעיף את החתיכה עם ההיסטידינים – אפשר להשתמש באנטרוקינאז ספציפי לרצפי היסטדינים החותך את התוספת שהוספנו בהנדסה גנטית.

יתרון: זה נוח, וגם זה מאוד מבדיל את החלבון הרצוי משאר החלבונים כלומר קל לדוג אותו

חיסרון: זה דורש הנדסה גנטית, צריך להכניס את הטאג לפסלמיד טרם סינטזת החלבון .

Question 26

מה זה

HPLC?

Answer 26

High-performance liquid chromatography

זוהי לא שיטה עצמאית אלא רק שיפור של הכרומטוגרפיה הישנה והטובה.

מיעל את כל שיטות הכרומטגורפיה ע”י הוספה של משאבה היוצרת לחץ ש_מאיצה את התהליך_ ומעלה את איכות הכרומטוגרפיה

מאחר והיא מאיצה את התהליך, היא מנטרלת את הנטייה של החלבונים לעבור דיפוזיה ובעצם מגבירה את הרזולוציה של הכרומטוגרפיה

Question 27

מה זה

Salting In/out

?

מה קורה קורה למסיסות בתהליך הזה?

Answer 27

היא שיטה להפרדת לבונים המתבססת על העיקרון שלכל חלבון, בהתאם למבנה המרחבי שלו ולרצף החומצות האמיניות, יש ריכוז מלח אידיאלי עבור מסיסות.

Salting in – מציין את המעבר של החלבון ממצב לא מסיס למצב מסיס (מוקף בעיקר במים ולא במלח)

Salting out – מתאר את המעבר של חלבון ממצב מסיס לאגרטים בלתי מסיסים. (מוקף בעיקר במלח ולא במים)

בשפת העם: החלבונים מצויים בכיוף שלהם בתמיסה מימית. בהתחלה כשמוסיפים מלח בריכוז נמוך המסיסות שלהם עולה- כי המלח שומר אותם פרודים זה מזה והקבוצות ההידרופוביות עדיין מצויות עמוק בתוך החלבון כי יש הרבה מים בסביבה

כשמעלים את ריכוז המלח המלח יתחיל להתחרות עם המים על קשרים האלקטרוסטטים, החלבונים ידחקו ולזה לזה ותחילו ליצור אגרגטים, יתחולל שינוי מרחבי קל שישחוף אזורים הידרופובים בחלבון כדי השיירים ההידרופילים שלהם לא ידחו זה את זה חשמלית ולכן מעבר לנקודה מסויימת; המסיסות יורדת. הנקודה הזאת היא אינדוודואלית לכל חלבון

בריכוזי מלח נמוכים החלבון מסיס

בריכוז מלח אידאלים החלבון הכי מסיס

בריכוז מלח גבוה מאוד החלבון לא מסיס

Question 28

באיזה מלח נהוג להשתמש ב

Salting In/out

Answer 28

אמוניום סולפט (NH4)so4

Question 29

איך מפרידים חלבונים בשיטת

Salting In/out

Answer 29

כמו שלכל חלבון יש את ריכוז המלח האידאלי שלו בו הוא הכי מסיס יש לו גם את ריכוז המלח בו הוא יוצר אגרגטים ללא הנתון הסיפרותי הזה אין אפשר לממש את השיטה

בקיצור בודקים מה הריכוז האידאלי בו החלבון יוצר אגרגטים ואז יותר קל להפריד אותו

Question 30

פוקוס איזואלקטרי היא שיטת להפרדת חלבונים על פי ___.

הג’ל בשיטה זו מכיל ____

בצד של האלקטרודה החיובית ה___ הוא___

בצד של האלקטרודה השלילית ה___ הוא___

Answer 30

פוקוס איזואלקטרי היא שיטת להפרדת חלבונים על פי pI

הג’ל בשיטה זו מכיל גרדיאנט PH

בצד של האלקטרודה החיובית הפי אייצ’** הוא__נמוך_**

בצד של האלקטרודה השלילית ה__פי אייצ’_ הוא_גבוה

Question 31

בג’ל אלקטרופורזה מולקולות ___יותר ינדדו מהר יותר

Answer 31

בג’ל אלקטרופורזה מולקולות קלות יותר ינדדו מהר יותר

הנדידה באלקטרופורזה הקלאסית מבוססת על מסה

Question 32

בתמיסת חלבונים יש לי חלבון גלובולרי ששוקל 80 קיי דיי עם מטען שלילי של

-6

וחלבון סיבי ששוקל 30 קיי די עם מטען חיובי של

+2

מי מהם ינדוד מהר יותר באלקטרופורזה בג’ל המכיל SDS?

Answer 32

ברגע ששמנו SDS

אין שום משמעות למטענים שהחלבונים באים איתם “מהבית”. כי אס די אס טוען שלילית את החלבון כל חומצה אמינית שנייה כלומר אם לחלבון יש 100 חומצות אמינו 50 יהיו קשורות לאס די אס וטעונות שלילית.

אס די אס גם מנטרל השפעות מרחבית לכן מה אכפת לנו שהחלבו הראשון גלובולרי- הם עוברים דה נטורציה מלאה כי החומר הזה מפרק את כל הקשרים הלא קוולנטים ובעצם אין יותר מבנה שלישוני

לכן באלקטרופורזה הדבר היחיד שמשנה הוא מסה- ולכן החלבון הקל יותר זה ששוקל 30 קיי דיי ירוץ מהר יותר בג’ל

Question 33

מדוע אלקטרופורזה היא לא כלי מתאים לבידוד חלבון?

איך מקבלים ממנה מידע על החלבון הנחקר?

Answer 33

זהו לא כלי מתאים לבידוד חלבון מכיוון שאלקטרופורזה הורסת את המבנה שלו באופן בלתי הפיך, אבל זהו כלי מאוד יעיל לאנליזה שמשאפשר לדעת כמה חלבונים שונים נמצאים בדגימה.

איך מסיקים מידע על החלבון הנחקר? השוואת מרחק הריצה של החלבון הנחקר אל מחרק הריצה של חלבון ידוע מאפשרת גילוי מסה מולארית של החלבון הנחקר.

Question 34

מה ההבדל בין ג’ל אגרוז לג’ל פוליאקרילאמיד? באיזה ג’ל תבחר להרצת

DNA?

Answer 34

ההבדל הוא בצפיפות

1. ג’ל אגרוז – הסטנדרטי – מאפשר הרצה של מולקולות גדולות- הפרדה של עשרות נוקלאוטידים
2. ג’ל פוליאקרילאמיד – המאפשר רזולציה גבוהה יותר- אפשר לראות הפרדה של נוקלאוטידים בודדים.

בכללי אפשר להעלות את הריכוז של האגרוז ואז יש לו רזולוציה יותר טובה

פוליאקרילאמיד-** מתאים מאוד **לחלבונים

אגרוז**-מתאים יותר **ל

DNA.

Question 36

איך אפשר להסיק את מסת החלבון לפי מרחק הנדידה שלו בג’ל אלקטרופורזה?<

Answer 36

LOG

מסה מולארית ביחס למרחק נדידה נותן את הגודל של חלבון נעלם

Question 37

הדוקטורנט ג’סטין ביבר הריץ שני פלטות של ג’ל אלקטרופורזה; באחת חלבונים ובאחת

DNA

הוא קיבל באנד מאוד עבה בכל אחת מהפלטות

מה המשמעות שלו?

Answer 37

בפלטת החלבונים: חלבונים שרצים בג’ל אלקטרופורזה נצבעים בקומסי בלו ככל שהבנד יותר גדול ככה אנחנו יודעים שהצטבר שם יותר חלבון

בפלטת הדנ”א: דנ:”א לא נצבע בקומסי בלו מכיוון שהחומר הזה נקשר לשיירים ארומטים של חומצות אמינו. בדנ”א משתמשים בצביעה פלורסנטית ולכן יצירה של באנד גדול לא אומרת כלום על הצטברות דנ”א באותו גודל בפס מכיוון שפלורסנציה נוטה מטבעה להתפזר

בקיצור: בחלבונים זה אומר שיש לי יאמבה חלבון ובדנא זה לא

Question 38

בטא מרקפתואתנול מחזר קשרי מסוג?

SDS מחזר קשרים מסוג?

Answer 38

BME- בטא מרקפתואתנול מחזר קשרים דיסולפידים (קיימים בעיקר במבנים שלישוניים ורביעוניים)

SDS מחזר רק קשרים לא קוולנטים

Question 39

להלן הנתונים הבאים

משקל החלבון הנטיבי 80

עם SDS-שני באנדים אחד 20 אחד 60

עם BME+SDS- שני באנדים 30 ו 10

מה המבנה של החלבון ומאיזה יחידות הוא מורכב? מה גודל תת היחידות?

Answer 39

ניתן להניח כי לחלבון יש 4 תת יחידות: 30 ו 30 שמקושרות בינהן בקשר SS,

ועוד שתי תת יחידות קטנות יותר בגודל של 10KD

המוחזקות בינהן בקשר SS

לכן החלבון הוא הטרוטטרמר- בנוי מ4 תת יחידות לא זהות (הומוטטרמר בנוי מ4 תת יחידות זהות)

Question 40

חלבון שיש לו 3

תת יחידות לא זהות נקרא?

Answer 40

הטרו טטרמר

אילו הן היו זהות זה היה

הומוטטרמר

Question 41

באלקטרופורזה דו מימדית מה סדר פעולת ההפרדה?

איזה שני פרמטרים מתקבלים על החלבון?

Answer 41

בשיטה זו קודם עושים פוקוס איזואלקטרי, ואז אלקטרופורזה-בסדר הזה (אי אפשר הפוך כי האס די אס יהרוס את החלבון) זוהי שיטה שמאפשרת אנליזה של מגוון רחב של חלבונים לפי שני פרמטרים –

מסה ו pI

תחילה יופרדו החלבונים בפוקוס איזו-אלקטרי ולאחר מכן יצופו באס די אס ואז ויופרדו גם(!) על פי מסה

Question 42

באלקטרופורזה

הצד החיובי הוא ה___

והצד השלילי הוא___

Answer 42

• חארטה קטנה של ביולוגים שכדאי לשים אליה: בפיזיקה קתודה זה חיובי ואנודה זה שלילי*
• ביולוגים החליטו שבאלקטרופורזה הצד השלילי זה קתודה!! והצד החיובי זה אנודה.*
• מפגר אבל זה מה יש*

Question 43

לפניכם טבלת הטיהור הבאה:

הדוקטורנט ג’סטין החליט לבודד את החלבון ביבר.

מאחר והוא מאוד חרוץ הוא בנה את טבלת טיהור המצורפת

פי כמה נקי החלבון ביבר בסוף לעומת ההתחלה?

מהי הניצולת ?

Answer 43

הפעילות הספציפית היא המדד לדרגת הניקיון- כפי שניתן לראות בטבלה

בהתחלה הפעילות הספציפית הייתה 10 ובסוף היא 15,000 לכן החלבון נקי פי 1500

ניצולת: התחלנו עם 100,000 יחידות אנזים וסיימנו עם 45,000- כלומר הניצולת שלו היא 45%

הוא איבד 55% מהביברים שלו לאורך התהליך

Question 44

מהו המבנה הכללי של אימונוגלובינים?

איזה חלק אחראי לזיהוי האנטיגן?

Answer 44

אימונוגלובינים- בנויים משני מקטעים

מקטע ה- Fab2– מורכב מהשרשרות הקלות ומחצי מהשרשרת הכבדה, הוא בעל האפיניות הגבוהה לאנטיגן

מקטע ה-FC – מורכב רק ממחצית השרשרת הכבדה, אחראי לפעילות הביולוגיות וזיהוי האנטיגן על ידי מערכת החיסון

Question 45

מתי נשתמש ב

westren blot?

כיצד השיטה עובדת?

Answer 45

westren blotting

היא שיטה לאימות זהות חלבון ידוע. - אחרי שבודדנו אנחנו רוצים להיות בטוחים שזה מה שבודדנו.

בשיטה זו, תחילה מורצים חלבונים בג’ל פולי-אקריל אמיד, עם או ללא אס די אס, כך הם מופרדים לפי גודלם.

לאחר מכן יש להדגיר את הג’ל עם נוגדן הקשור למולקולת צבע ויודע לזהות את החלבון באופן ספציפי.

כאשר לא קיים נוגדן הקשור למולקולת צבע שיודע לזהות את החלבון, ניתן להשתמש בשיטת ה-סנדוויץ. נשתמש בנוגדן ספציפי לחלבון ובנוגדן נוסף (נוגדן שניוני) הקשור למולקולת צבע, המתבייט על מקטעי ה- FC של הנוגדן הראשון.

Question 46

מה זה נוגדן ראשוני?

למה צריך נוגדן שניוני?

Answer 46

מה זה נוגדן ראשוני? הנוגדן הראשוני תפקידו להיקשר באופן ספציפי ויעודי לחלבון שלי

הנוגדן השניוני מסומן באיזה שהיא מולקולת צבע

למה לא לקשור לנוגדן הראשוני גם מולקולת צבע ולחסוך את הנוגדן הראשוני? כסף! הנוגדן הראשוני הוא מאוד יקר כי הוא סופר ספציפי והתהליך של הצמדת מולקולת הצבע לנוגדן הורס 99% מהנוגדנים לכן משתמשים בנוגדן שניוני גנרי שיודע להיקשר לכל אתר FC של כל הנוגדנים.

Question 47

מהי שיטת

ELISA

?

Answer 47

אלייזה זה בדיוק כמו westren blot

ההבדל זה שזה אקסקלוסיבי לנוגדנים לשאין דף ניטרוצלולוז והרצה בג’ל אלא תמיסה ששופכים לפלטת באריות ספוחות בנוגדן

אופן בסיסי הבדיקה מתבצעת על מצע קשיח, בדרך-כלל פלסטיק, אליו נספחים אנטיגנים (בדרך-כלל חלבונים). לאחר מכן נעשה שימוש בשני נוגדנים לפחות: נוגדן ראשון, הספציפי לאנטיגן מסוים ונוגדן שני, הנקשר לנוגדן הראשון ומוצמד לאנזים

נוגדן המחובר לאנזים המזרז ריאקציה שאחד מתוצריה הוא בעל צבע, מיצר אינטרקציה עם אנטיגן חסר צבע.

מס’ אנזימים נמצאים בשימוש מסחרי באליזה והם:

alkaline phosphatase

horseradish peroxidase

Beta-galactosidase.

Question 48

ברמה הקונספטואלית בלבד

מה זה אלייזה סנדוויץ?

מה זה אלייזה עקיפה?

Answer 48

אלייזה סנדוויץ- כשאין מרקר צבע קשור לנוגדן הראשוני שמים תחילה נוגדל ראשוני, קושרים אליו ואז שמים נוגדן שניוני גנרי שמכיל מולקולת צבע ויודע להיקשר לנוגדן הראשוני באתר המתאים

אלייזה עקיפה-בדיקה מכמתת חלבונים כגון בדיקת נוגדנים בסרום, בדיקות מסוג זה משמשות בין השאר לאבחון חשיפה לפתוגן כמו איידס

בשיטה זו הפאזה הנייחת מכילה אנטיגנים שקושרים חלבונים אופיינים לפתוגן.

מוסיפים את סרום הדם של אדם החשוד כנגוע ואם יש לו חלבונים פתוגנים נגיד חלבוני מעטפת של נגיף האיידס אז הם יקשרו לפלטה . מוסיפים נוגדן שניוני שנותן תגובת צבע- בין לבין יש שטיפה כמובן

Question 49

מהי שיטת ה I-CAT?

Answer 49

Isotope-coded affinity tag שיטה שמאוד דומה ל micro-arrey.

שיטה זו משתמש לזיהוי הבדל בביטוי של חלבון בשני סוגי טיפולים

נניח- לוקחים תאי אפיתל המעי מחלקים אותם לצלחת עם כימותרפיה ובלי.

ה ICAT

הוא למעשה סמן גנרי בנוי מחלק שנקשר לחלבון ומחלק “מדווח”:

1. קבוצת סולפט שנקשרת לשיירי ציסטאין בחלבון (אפשר לשתול אוליגוציסטאין מראש)
2. ריאגנט אפיניות כמו ביוטין שנקשר לאבידין

בין שני הסמנים יהיה אזור לינקר שמכיל איזטופ כבד או איזטופ קל- החלק המדווח

בשלב הבא שימים את תמיסת החלבונים במצע עם שתי תנאים שונים ואז נוכל לבדוק את מידת הביטוי של החלבון ולהשוואות את קבוצת החלבונים המסומנת באיזטופ קל לעומת הכבד.

Question 50

האינטראקציה בין אבידין לביוטין היא האינטראקציה הכי חזקה בטבע

נכון או לא נכון?

Answer 50

לא נכון

האינטראקציה בין אבידין לביוטין היא האינטראקציה הלא קוולנטית הכי חזקה בטבע

Question 51

:קביעת רצף חומצות אמינו בחלבון

איך יודעים לזהות את הקצה האמיני של החלבון באמצעות ריאגנט כימי?

Answer 51

יש 2 אופציות

א. ריאגנט סאנגר

נקשר לקצה האמיני ומסמן אותו- DNSC או FDNB

ב. ריאגנט אדמן

PITC

שינהם יודעים להיקשר לקצה האמיני ולסמן אותו

Question 52

כיצד דגרדציה על של אדמן משמשת לקביעת רצף חומצות האמינו בחלבון?

מה המגבלה העיקרית של השיטה?

Answer 52

א. בשלב הראשון שמים את ריאגנט אדמן שנקרא

PITC- הקצה האמיני מסומן

ב. בשלב הבא שמים חומצה הידרוכלורית (פי איצ’ נמוך) שגורמת להידרוליזה חומצית.

ריאגנט אדמן נחתך ונוצר PTH

בריאקציה הזאת כל פעם נחתכת חומצה אמינית אחת מהפפטיד והחוצה אמינית קשורה לנגזרת הריאגנט שנוצרה

ג. בכל מחזור מזוהה החומצה האמינית שקשורה לריאגנט באמצעות

HPLC

זה יכול להתמשך עד מקסימום 40 חומצות אמינו!

TLDR: שמים את ריאגנט אדמן בתמיסה עם החלבון המבודד הוא נצמד לחומצה האמינית הראשונה ואז עובר הידרוליזה חומצית שגורמת להיווצרות נגזרת של הריגאנט שנקרא PTH. לוקחים את הדגימה שמים בHPLC שיודע לפענח איכשהו איזה חומר זה, ככה עושים שוב ושוב עד למקסימום של 40 חומצות אמינו

הבעיה:

שזה מחייב לחתוך את הפפטיד לצ’אנקים של 40

*HPLC- כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה היא שיטה כרומטוגרפית להפרדת תערובות נוזליות, כלומר שיטה המאפשרת זיהוי וכימות תרכובות נוזליות בתערובת, באמצעות הפרדתן בזרימה במהירויות שונות בצינור אנכי (קולונה).

HPLC נחשבת לשיטה מדויקת שיכולה לאתר מרכיבים רבים (גם מאות מרכיבים) בבת-אחת, בריכוזים נמוכים מאוד- משתמשים בזה במעבדות מז”פ

Question 53

בגלל מגבלותיה של שיטת אדמן, בחלבונים גדולים משתמשים בפרוטאזות שחותכות חלבונים גדולים מ40 חומצות אמינו לפפטידים קצרים

איפה חותכים כל אחד מהפרוטאזות/חומרים הבאים:

טריפסין

כימוטריפסין

פפסין

צינוגן ברומיד

Answer 53

טריפסין- חותך חומצות אמינו חיוביות חוץ מהיסטידין

כימטוטריפסין- חותך אחרי חומצות אמינו ארומטיות

פספסין- חותך לפני (קצה אמיני) של לאוצין, פניל אלנין,וטריפטופן -חותך פט”ל

ציאנוגן ברומיד- איננו פרוטאז אלא ריאגנט כימי שחותך אחרי מתיונין

חותך אחרי= C

חותך לפני=N

Question 54

דברים שצריך להכיר קונספטואלית:

ספקטרוסקופיית מסה

MALDI-TOF

ספקטרוסקופיית דיכוריזם מעגלי

NMR

דפרקצייתX-Ray

Answer 54

ספקטרוסקופיית מסה- שיטה לבדיקה את רצף חומצות האמינו ואת המסה שלהם ע”י פירוק של פפטיד והרצה בוואקום זה מה שחפרו לי עליו את החיים בכימיה אורגנית. מקבלים את ה NMR של הפפטיד כל גבעה מסמנת קבוצה כימית זה נסמך על הפרעה של השדה המגנטי של כל אטום ומיסוך שהוא מקבל מאטומים שכנים (פיקים לפי שכנים וכל החרא הזה)

• זו שיטה נוספת המתבססת על ספקטרוסקופית מסה. בשיטה זו, המבוססת על מטרקיס מיוחד, מכניסים את הפטיד את למטריקס מה שגורם לו לעבור התגבשות לקריסטאלים. לאחר מכן אנחנו נשבור את הפפטיד בעזרת לייזר – זה יטען אותם חשמלית, כך שכל חלקיקי טעון במטען חשמלי אחד וכמעט כל החלקיקים טעונים. בשלב הבא נירה את החלקיקים, כך שהאנליזה תתבצע על מסת החלקיקים לפי הזמן שלוקח להם להגיע לגלאי.

ספקטרוסקופיית דיכוריזם מעגלי- זוהי שיטה לזיהוי מבנים שניוניים בחלבון, אודות לבליעת אור שונה באור מקוטב בהתאם למישורים ימנים או שמאליים circular dichroism-

בשיטה זו ניתן לקבוע:

• מבנים שניוניים בחלבון
• קיפול ראוי ונכון של חלבון
• האם קיימת דינאמיות במעבר בין מצב מקופל ללא מקופל

NMR- זוהי שיטה לקביעת המבנה התלת מידי של חלבון

בשיטה זו מסיתים את הספין של אטומים מימןH1 בחלבון. הקרינה שהפרוטון פולט כאשר השדה המגנטי מפסיק, בעודו חוזר לספין המקורי, תלוי רבות בסביבה בה נמצא אטום המימן והקבוצות הכימיות הצמודות לו

על טכניקה זו מבוססים עקרונות ה MRI הרפואי

דפרקצייתX-Ray- זוהי שיטה בה נבדק המבנה התלת מימדי של חלבון

השיטה מצריכה מיומנות גבוהה הן בעיבוד החומר – קריסטליזציה ואידוי, הן בהקרנה הדורשת מכשור מיוחד ומיגון ראוי והן