1- La cellule Flashcards
(185 cards)
1
Q
Nommez 2 caractéristiques de la cellule
A
1- Isolée de l’environnement par une membrane plasmique
2- Capable de croissance et de reproduction autonome par l’expression de gènes encodés dans une ou plusieurs molécules d’ADN
2
Q
Nommez 5 caractéristiques de la membrane plasmique
A
1- Barrière sélective
2- Transporteurs
3- Concentre nutriments
4- Conserve les produits de synthèse
5- Excrète des déchets
3
Q
Où est située l’information héréditaire ?
A
Dans l’ADN
4
Q
Quel est le dogme central? (4)
A
1- Il y a réplication de l’ADN.
2- L’ADN est transcrite en ARN.
3- L’ARN est exporté en dehors de la cellule.
4- L’ARN est traduite en protéine
5
Q
Combien de cellules fabriquons-nous par seconde?
A
3.8 millions de cellules par seconde, la majorité étant des cellules sanguines (globules rouges et lymphocytes)
6
Q
Qu’est ce que les procaryotes?
A
Cellules vivantes dépourvues de noyau et possédant une paroi cellulaire
7
Q
Nommez les 2 catégories de procaryotes
A
1- Bactéries (ou eubactéries)
2- Archéobactéries
8
Q
Quelle est la catégorie des procaryotes se rapprochant le plus des eucaryotes?
A
Archéobactéries
9
Q
Nommez 2 caractéristiques des archéobactéries
A
1- Certaines bactéries sont méthanogènes ou thermophiles
2- Sans noyau mais avec certaines caractéristiques biochimiques propres aux eucaryotes (réplication, transcription, traduction, histones, introns …)
10
Q
Nommez les 2 catégories des eucaryotes
A
1- Unicellulaires
2- Multicellulaires
11
Q
Nomme 2 organismes unicellulaire
A
1- Amibe
2- Saccharomyces cerevisiae (levure)
12
Q
Comment sont appelés les virus chez les bactéries?
A
Phages
13
Q
Expliquez pourquoi les virus occupent une position unique entre le vivant et le non-vivant (4)
A
1- Composés de la même matière que les cellules
2- Incapables de vivre indépendamment de cellules hôtes pour se reproduire
3- Ils ont évolué parallèlement aux cellules
4- Leur matériel génétique peut-être de l’ADN ou de l’ARN
14
Q
Vrai ou faux: les virus peuvent se reproduire n’importe quand.
A
faux, ils doivent infecter des cellules hôtes pour utiliser leur matériel génétique
15
Q
Nommez le schéma général de la cellule eucaryote (4)
A
1- Les cellules eucaryotes animales possèdent une organisation microscopique générale commune
2- Délimitées par une membrane plasmique définissant un espace interne appelé cytoplasme
3- Contient un noyau, délimité par une membrane nucléaire double
4- À l’intérieur du cytoplasme se trouvent des organites cytoplasmiques
16
Q
Que contient le cytoplasme des cellules eucaryotes?
A
Cytosol et organites
17
Q
Combien de fois est la cellule eucaryote plus grande (linéaire) et large en volume que la cellule procaryote?
A
10 fois plus grande linéaire et 1000 fois plus large en volume
18
Q
La cellule eucaryote possède un cytosquelette, expliquez ce que c’est.
A
Système de filaments qui constitue un système de poutres, cordes et moteur qui donne à la cellule sa force mécanique qui va guider ses mouvements.
19
Q
Vrai ou Faux. Les eucaryotes proviendraient de l’association de plusieurs cellules procaryotes.
A
Vrai
20
Q
Que vont délimiter les membranes internes de la cellule eucaryote?
A
Délimitent différentes sortes de compartiments impliqués dans la digestion et la sécrétion
21
Q
Vrai ou faux : les cellules eucaryotes ne possèdent pas de paroi cellulaire et peuvent modifier leur forme
A
vrai
22
Q
Vrai ou Faux.La théorie endosymbiotique est l’hypothèse selon laquelle les plastes et mitochondries des cellules eucaryotes proviennent de l’incorporation (endocytose) par certaines archées, des bactéries avec lesquelles elles auraient entretenu une relation endosymbiotique.
A
vrai
23
Q
Comment appelons-nous l’action d’une cellule eucaryote de modifier sa forme?
A
Phagocytose (action de manger)
24
Q
Expliquez l’évolution de la cellule eucaryote
A
Probablement une cellule procaryote primordiale prédatrice qui capturait d’autres cellules
25
Expliquez pourquoi dit-on que les humains sont semblables (3)
- Les êtres vivants bien qu'infiniment variés vus de l'extérieur sont fondamentalement semblables à l'intérieur
- Ils partagent tous les mêmes mécanismes de fonctionnement
- Étudier le fonctionnement de la mouche, grenouille ou de la souris nous aide donc à comprendre l'humain
26
Vrai ou faux : la levure sert de modèle cellulaire eucaryote ? Expliquez
Vrai, car ce sont des cellules eucaryotes sans les problèmes du développement multicellulaire
27
Décrire les Saccharomyces cerevisiae + caractéristiques
Champignon utilisé pour fabriquer la bière ou le pain
- Robuste
- Se cultive facilement
- Se divise très rapidement
- Se reproduit par voie végétative (division simple - forme diploïde) ou par voie sexuée (méiose - forme haploïde)
- Génome très petit (12 Mb)
28
vrai ou faux : les saccharomyces cerevisiae sont particulièrement utilisés pour l'étude du cycle cellulaire ?
vrai
29
Quelles sont les 4 espèces qui ont émergés comme modèles d'organismes pour les études en biologie ?
1- Le ver nématode Caenorhabditis elegans 1000 cellules
2- La mouche Drosophila melanogaster
3- La souris Mus musculus
4- L'Homo sapiens (séquençage du génome) 10^14 cellules, 20 000 gènes et 3x10^9 pb
30
Quelles sont les 2 autres espèces qui ont émergés comme modèles d'organismes pour les études en biologie en embryologie ?
1- La grenouille Xenopus laevis
2- Zebrafish (poisson zèbre)
31
Expliquez les étapes de l’isolement de cellules dans les cas de protéines abondantes
1- isoler directement d'un tissu (d'un type majoritaire) : actine (muscle) et tubuline (cerveau)
2- Après amplification en culture primaire (sans autre purification)
32
Nommez les étapes pour isoler des cellules
1- Défaire la matrice extracellulaire et les jonctions intercellulaires en utilisant :
- Enzymes protéolytiques: trypsine, collagénase
- EDTA: calcium requis pour l'adhésion cellulaire
- Séparation par agitation douce (~1jr)
33
Vrai ou faux: dans l'isolement des cellules, nous n'avons pas besoin de séparer quand on veut isoler des globules rouges
vrai
34
Que devons nous faire de plus lors de l'isolement des cellules pour une manipulation génétique ou si la protéine étudiée est rare ?
Faire un enrichissement supplémentaire d'un type cellulaire comme une purification
35
Comment se fait l'isolement de cellules d'une population complexe ?
Les cellules d'intérêts sont séparées avec un FACS (cytométrie/spectromètre de flux). On peut, par exemple, avoir un anticorps qui reconnaît un antigène situé à la surface d'un type cellulaire spécifique, couplé à une molécule fluorescente.
36
Qu'est-ce que l'acronyme FACS ?
Fluorescence-activated cell sorter
37
Expliquez l'isolement de cellules au FACS (4)
1- De fines gouttes contenant une cellule passent à travers le faisceau d'un rayon laser
2- Les gouttes contenant des cellules fluorescentes sont détectées (CD34) et ensuite chargées négativement
3- Elles sont déviées par un champs électrique dans un contenant
4- Le FACS détecte 1 cellule fluorescente sur un pool de 1000 et peut traiter des milliers de cellules à la secondes
38
Vrai ou faux : un plus grand nombre de cellules peuvent être purifié plus rapidement avec la purification à l'aide d'un aimant et de billes magnétiques que par la méthode FACS
Vrai, méthode beaucoup plus rapide
39
Expliquez les 2 étapes de la purification à l'aide d'un aimant et de billes magnétiques (pour une sélection négative et positive)
Sélection négative :
1- L'anticorps biotinylé et les billes magnétiques conjuguées à la streptavidine se lient fortement ensembles
2- L'aimant attire les cellules non désirées et négatives (CD34)
Sélection positive :
1- L'anticorps biotinylé et les billes magnétiques conjuguées à la streptavidine se lient fortement ensembles
2- L'aimant attire les cellules désirées
40
Que doit contenir le milieu de culture?
- 10% de sérum (veau, veau foetal...)
- Facteurs de croissance
41
Quelles sont les manipulations d'une culture cellulaire ?
- Les manipuler de façon stérile
- Les conserver dans un incubateur à 37˚C et 5% de CO2
- Les congeler en présence de DMSO (cryo-préservateur) et on les conserve dans l'azote liquide (-196˚C)
42
Que veulent dire in vivo et in vitro dans :
1- la culture cellulaire
2- en biochimie
Culture cellulaire:
in vitro = en dehors de l'organisme
in vivo = dans l'organisme intact
Biochimie:
in vitro = dans du verre ou dans des tubes en absence de cellules vivantes
in vivo = fait dans des cellules en culture
43
Vrai ou faux : en culture cellulaire, les cellules poussent généralement en suspension
Faux, sauf les cellules sanguine. En effet, les cellules requièrent une surface solide qui sont des boîtes de culture en plastique traité spécialement )polystyrène hydrophobe -> après traitement chargé +)
44
Qu'est ce que les cultures primaires ?
cellules isolées directement des tissus
45
Que faisons-nous lors que les cellules d'une culture primaire arrivent à confluence ?
On les décolle avec de la trypsine, puis on va les diluer (1/4 à 1/10) et les re-cultiver à confluence (passages)
46
Combien de temps durent les cultures secondaires ?
De des semaines à des mois, mais pas indéfiniment
47
vrai ou faux : les cultures primaires conservent beaucoup les propriétés du tissu d'origine ?
Vrai, par exemple: un fibroblaste aura la propriété du collagène, les cellules nerveuses formeront des axones et les lymphocytes seront stimulés par des antigènes
48
Pourquoi est ce que les fibroblastes vont être cultivés 25-40 passages seulement ? (2)
En raison d'une sénescence réplicative provoquée par:
1- le raccourcissement des télomères dû à l'absence de télomérase dans les cellules somatiques humaines
2- Choc de culture activant un mécanisme de contrôle du cycle cellulaire
49
Vrai ou faux : on peut immortaliser des cellules et générer des lignées cellulaires. Expliquez
Vrai, l'immortalisation des cellules se fait en :
1- réintroduisant la télomérase
2- en inactivant les contrôle du cycle cellulaire par l'introduction d'oncogènes
3- avec des produits chimiques
4- le choc de culture peut-être évité suite à une mutation durant la culture (fibroblastes de souris NIH-3T3)
50
Nommez 2 oncogènes
1- T du virus SV40
2- E6/E7 du virus du papillome humain
51
Que sont les cellules transformées et nommez 4 propriétés
Ce sont des cellules dérivées de tumeurs, produites en introduisant des oncogènes ou infectées par des virus oncogéniques
Propriétés:
- immortelles
- prolifèrent à haute densité
- pas besoin d'être attachées pour pousser
- produisent des tumeurs lorsqu'injectées dans des souris
52
Quelle est la première lignée cellulaire isolée ?
HeLa en 1951 isolée d'une patiente (Henrietta Lack) atteinte d'un cancer de l'utérus. On estime que 10 à 20% des lignées cellulaires des laboratoires sont contaminées par des HeLa.
53
Vrai ou faux: les 2 types de lignées cellulaires (immortelles et transformées) sont identiques aux cellules normales des tissus dont ils proviennent.
Faux, elles présentent toujours des différences importantes, mais restent valides et pratiques d'utilisation
54
Définir transfection + donnez un exemple de la vie courante
Procédé par lequel on introduit un acide nucléique (ADN ou ARN) dans des cellules animales en utilisant des méthodes chimiques, physiques ou biologiques (virus). La transfection est utilisée pour étudier la fonction et la régulation des gènes et pour produire des organismes transgéniques in vivo ou in vitro.
Exemple: les vaccins
55
Expliquez les méthodes physiques de transfection
- La microinjection (cellules ES) où on injecte de l'ADN dans le noyau de la cellule
- L'électroporation (un champs électrique permet la création de pores dans la membrane plasmique pour permettre à l'ADN de rentrer)
56
Quelle est l'efficacité de la transfection ?
Elle varie en fonction des types cellulaires (les cellules primaires sont en général plus difficiles à transfecter) et de la méthode de transfection
57
Expliquez les méthodes chimiques de transfection
Faire rentrer des molécules chargées négativement dans une cellule qui possède une membrane cellulaire chargée négativement. Neutraliser ou charger positivement l'ADN en le complexant avec du calcium phosphate (chargé +) ou des polycations (rentrant par endocytose) ou des lipides pour former des liposomes (rentre par endocytose ou fusion avec la membrane plasmique)
58
Nommez les 5 méthodes de transfection
1- Méthodes chimiques
2- Méthodes physiques
3- Transfection transitoire par plasmide
4- transfection stable par plasmide
5- Méthodes biologiques
59
Expliquez la transfection transitoire par plasmide
Le plasmide va rentrer dans le noyau où le gène étudié sera transcrit puis traduit. L'expression est élevée pour une période de temps limitée, car le plasmide se dégrade, les cellules injectées se divisent et l'ADN est dilué. L'expression maximum sera atteinte 48-72h post transfection et peut être détecté 1 à 8 jours après transfection.
60
Vrai ou faux : l'ADN super enroulé rentre plus facilement dans les cellules.
Vrai, car sont plus compactes.
61
Dans la transfection stable par plasmide, comment s'exprimera le gène de résistance?
Va s'exprimer de façon transitoire et il y aura donc une résistance à la drogue transitoire. Les cellules résistantes à long-terme auront intégré le plasmide qui sera transmis aux cellules filles après division cellulaire
62
Que nécessite la transfection stable par plasmide?
Nécessite l'intégration d'ADN dans le génome de la cellule, mais c'est un évènement rare (l'ADN du plasmide devra se briser pour s'intégrer). Il va falloir utiliser un gène de sélection qui permettra la sélection des cellules en présence d'une drogue.
63
Par quoi sera porté le gène de résistance dans la transfection stable par plasmide?
Il pourra être porté par le même plasmide ou par un plasmide différent (co=transfection). Dans le cas de la co-transfection, le plasmide qui codera pour la protéine étudiée sera en excès pour augmenter la probabilité que les cellules sélectionnées contiennent les 2 plasmides. (donne + de chances, mais jamais 100%, car le plasmide peut se briser)
64
Dans une transfection stable par plasmide, qu'est ce qui sera nécessaire si on veut que 100% des cellules expriment le gène étudié ?
Le clonage. Si la protéine est exprimée à la surface on pourra utiliser le FACS pour trier les cellules.
65
Expliquez les méthodes biologiques de transfection
virus recombinants dérivés de l'adénovirus (ADV), du virus adéno-associé (AAV), du y-rétrovirus (RV) et du lentivirus (LV). Méthodes plus efficaces que les méthodes chimiques et physiques.
66
Quelle est la puissance d'intégration des méthodes biologiques de transfection?
10^7
67
Pouvons-nous utiliser une méthode biologique de transfection dans une expérience in vitro ?
Non, car aucune intégration
68
Expliquez la transformation
introduction de manière non viral d'ADN dans des bactéries, des cellules eukaryotes non-animales et des cellules de plantes. Désigne aussi le mécanisme par lequel une cellule animale devient tumorale
69
Expliquez la transduction
Une transfection en utilisant un vecteur viral
70
Qu'est-ce qu'un épitope ou déterminant antigénique?
C'est une partie spécifique sur l'antigène qui va être reconnue par l'anticorps.
71
Dans le cas d'une protéine, un épitope correspond à combien d'acides aminés?
À environ 5-6 acides aminés
72
Il existe combien d'épitope, d'anticorps et de lymphocytes B pour une protéine de 150 aa?
Il existe au moins 30 épitopes différents potentiels, autant de populations d'anticorps et de populations différentes de lymphocytes B.
73
Vrai ou Faux. Chaque population d'épitope est générée par une population distincte homogène de lymphocytes B.
Faux. Chaque population d’anticorps est générée par une population distincte homogène de lymphocytes B.
74
Vrai ou Faux. Un type de lymphocyte B peut fabriquer plusieurs types d'anticorps.
Faux. Il peut fabriquer seulement un seul type d'anticorps.
75
Quelle est la différence entre l'épitope et l'antigène?
Un épitope est reconnu par le lymphocyte B. Celui-ci va ensuite produire un anticorps pour inactiver, marquer et détruire l'antigène.
76
Comment se produit la reconnaissance des antigènes et la production d'anticorps?
1. Les lymphocytes B naïfs sont activés par un antigène et par les lymphocytes T helper.
2. Prolifération et différenciation des lymphocytes B au repos en lymphocytes B effecteurs.
3. Lymph. B eff. produisent et sécrètent des anticorps qui ont un site spécifique de liaison à l'antigène, identique à celui de l'anticorps lié à la membrane d'origine et qui a servi de récepteur à l'antigène.
77
Définissez les concepts d'anticorps polyclonaux et monoclonaux.
Anticorps polyclonaux:
- Mélange d'anticorps reconnaissant plusieurs épitopes d'un même Antigène
- Chaque population est en quantité limité
Anticorps monoclonaux
- Reconnaissent un seul épitope
- Hautement spécifique
78
Quel type d'anticorps est hautement spécifique?
Monoclonal
79
Comment on peut fabriquer des anticorps polyclonaux?
Souvent, on inocule une protéine d'intérêt de bovin ou de souris par exemple à un lapin. La protéine doit être étrangère à celle du lapin pour qu'il y ait développement d'anticorps. Puis, il faut récolter le sérum et isoler les anticorps. On arrive à un mélange d'anticorps hétérogène reconnaissant toute une variété des différents sites antigéniques de la macromolécule, qui varient d'un animal à l'autre.
80
Comment fait-on pour choisir l'espèce animale pour la production d'anticorps?
La souris donne plus de sérum et la chèvre n'est pas pratique (grosseur), donc le lapin est mieux.
81
Comment on peut fabriquer des anticorps monoclonaux?
- Utilise la technologie des cellules hybrides
- Implique la propagation d'un clône cellulaire à partir de lymphocytes B sécrétant des anticorps pour obtenir des préparation homogènes d'anticorps en grande quantité.
82
Qu'est-ce qu'une cellule hybride ou hybridome (dans le cas d'un Ac mono)?
C'est une fusion cellulaire (entre un lymphocyte B producteur d'anticorps individuels provenant d'une souris ou d'un rat immunisé avec une cellule tumorale de lymphocytes B) qui entraîne la formation d'un hétérocaryon (cellule multinuclée dont les noyaux sont génétiquement différents)
83
Vrai ou Faux. En ce qui concerne la fabrication d'Ac mono, avant la fabrication d'hétérocaryons, les lymphocytes B meurent après quelques jours en culture tandis que les cellules tumorales poussent indéfiniment en milieu normal, mais meurent dans le milieu sélectif.
Vrai
84
Quels sont les avantages d'un Ac monoclonal sur un Ac polyclonal?
- Hautement spécifique
- Peut se lier à des molécules qui constituent une composante mineure seulement, dans un mélange complexe
- Permettent maintenant de diagnostiquer et traiter plusieurs maladies. ex: VIH (Test ELISA), cancer, arthrite rhumatoïde.
85
Quelle est la première étape à l'étude de la structure microscopique ou moléculaire des organites?
Le fractionnement cellulaire
86
À quoi sert le fractionnement cellulaire?
Permet de séparer les différents organites de la cellule
87
Décrivez les étapes du fractionnement cellulaire. (3)
1. Briser les cellules soit par choc osmotique, vibration ultrasonique ou autre pour extraire le lysat cellulaire.
2. Centrifugation différencielle : c'est une séparation selon les dimensions et la densité des composants cellulaires.. Le culot d'une centri à basse vitesse est composé de cellules, noyaux, cytosquelette. Moyenne : mitochondries, lysosomes et péroxysomes. Grande : microsomes et petites vésicules. Très grande : ribosomes, virus, grosses macromolécules.
3. Fractionnement cellulaire : meilleure séparation parce que le lysat est sur une solution de sel qui remplie le tube et un gradient de concentration de solutions de sucrose.
88
Quelles sont les deux sortes de fractionnement cellulaire?
1. Sédimentation de vitesse : Composants sédimentent à différentes vitesses en fonction de leur taille et de leur forme (coefficient de sédimentation). Après centrifugation, les différentes composantes qui ont été séparées sont recueillies, dans des tubes différents, après avoir percé le fond du tube de centrifugation.
2. Sédimentation à l'équilibre : Composants séparés selon leur densité de flottaison, indépendamment de leur taille et de leur forme.
Les composants subcellulaires se déplacent vers le bas ou vers le haut jusqu'à ce qu'ils aient trouvé la position où leur densité est égale à celle du milieu environnant.
89
Expliquez l'utilisation de l'anticorps bevacuzimad (avastin) dans le cancer
Il cible le VEGF-A et bloque la formation des vaisseaux sanguins
90
Expliquez l'utilisation des l'anticorps nivolumab et pembrolizumab (Opdivo et Keytruda) dans le cancer
ils ciblent PD-1 à la surface des lymphocytes pour les rendre plus efficace
91
Expliquez l'utilisation de l'anticorps adalimumab (Humira) dans les maladies autoimmunes
cible le TNFalpha pour le traitement de maladies autoimmunes
92
Entre les techniques suivantes, lesquelles utilisent les anticorps? 1. PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide) 2. Western (immunobuvardage) 3. IP et Co-IP (immunoprécipitation)
Western, IP et Co-IP
93
Définissez le PAGE.
- Séparation des protéines
- Vitesse de migration dépend de leur charge nette, de leur taille et de leur forme
- Autre forme couramment utilisée SDS-PAGE : détergent qui rend les protéines libres et en solution dans le détergent. Aussi présence de pores pour contrôler la vitesse de migration.
94
Définissez le western.
Identification d'une protéine avec des anticorps couplés avec un isotope radioactif.
95
Définissez l'IP et la Co-IP.
Permet d'isoler des protéines.
- Ajout d'un anticorps dans un échantillon et incubation pour qu'il ait le temps de se lier à la protéine d'intérêt.
- Ensuite, ajout d'une protéine A ou G qui se liera à l'anticorps
La co-IP permet d'isoler des complexes protéiques, mais l'anticorps ne reconnaît pas le complexe en tant que tel, mais une des protéines qui forme ce complexe.
96
Qu'est-ce qu'une cellule Totipotente ?
Cellule qui peut se différencier en tous les types cellulaires, embryonnaires et extra-embryonnaire.
97
Qu'est-ce qu'une cellule Pluripotente ?
Cellules qui ont un potentiel de différenciation plus faible que les cellules totipotentes, mais peut redonner tous les types cellulaires et un organisme en entier.
98
Qu'est-ce qu'une cellule multipotente ?
Cellules qui ont un potentiel de se différencier en différents types cellulaires à l'intérieur d'une lignée spécifique. Les cellules souches hématopoïétique (leucocytes et érythrocytes)
99
Qu'est-ce que la transdifférenciation?
C'est une cellule qui se différencie à partir d'une autre cellule différenciée sans passer par l'étape de cellule souche.
100
Qu'est-ce qu'une cellule souche embryonnaire (ES)? (4)
- Proviennent du bouton embryonnaire ou masse cellulaire interne de l'embryon
- Se multiplient à l'infini en culture
- Pluripotentes : conservent leur potentiel de différenciation
- Lorsque réintroduites dans l'embryon, elles redonnent tous les types cellulaires et adaptent leur phénotype à celui des cellules du site d'intégration.
101
Qu'est-ce qu'une cellule souche pluripotente induite (iPS)?
- Générées en laboratoire à partir de cellules somatiques
- Pluripotentes
- Lorsque ré-introduites dans l'embryon, elles redonnent tous les types cellulaires
102
Vrai ou Faux. Les cellules souches unipotentes se retrouvent en petit nombre dans presque tous les tissus chez l'adulte.
Vrai
103
Qu'est-ce qu'une cellule souche unipotente?
Elles ne peuvent produire qu'un seul type cellulaire.
(Coeur et pancréas n'ont pas de cellules souches unipotentes)
104
Chaque cellule fille issue de la division d'une cellule souche peut soit ____ une cellule souche soit se ____.
rester
différencier
105
Pourquoi les cellules ES sont très prometteuses?
Elles permettent la thérapie de remplacement cellulaire.
- Remplacement et réparation de tissus malades : muscles, cellules nerveuses, cellules insulines...
106
Comment peut-on induire la différenciation des cellules ES? (2)
- Diverses hormones
- Facteurs de croissance
107
Quels sont les problèmes d'éthique liés à l'utilisation des cellules ES? Et les solutions?
- Proviennent d'embryons
- Pour obtenir ES, récolte ovules, les fertiliser puis les détruire au stade de blastocyte
- Moralement inaceptable
- Réaction immunitaire
Solutions :
- Récolter cellules souches adultes (peu abondantes)
- Reprogrammation nucléaire
108
Vrai ou Faux. Le matériel génétique est irréversiblement altéré dès que les cellules commencent à se différencier.
Faux. Une expérience a montré qu'en transferant les noyaux de cellules adultes différenciées dans des oeufs dont on a retiré le noyau, on obtient des grenouilles adultes clonés Ainsi, des cellules somatiques différenciées peuvent être reprogrammées vers un état embryonnaire pluripotent en transférant leur noyau dans des oocytes.
109
Qui a mis au point la reprogrammation nucléaire?
John Gurdon
110
Qu'est-ce que le clonage reproductif?
Un noyau d'une cellule différenciée chez une vache adulte et introduit dans un oeuf énucléé d'une autre vache produira un veau.
Ex. Dolly la brebis
111
Vrai ou Faux. Des gènes silencieux dans des cellules différenciées peuvent être réactivés.
vrai
112
Vrai ou Faux. L'introduction de gènes codant pour certains facteurs de transcription peut convertir des cellules somatiques différenciées d'un type à l'autre.
Vrai. Création des cellules iPS.
113
Quelle est l'expérience réalisée par Takahashi et Yamanaka en 2006?
Production des première cellules iPS, en introduisant dans des fibroblastes (MEF) les gènes codant pour les facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc.
114
Quels sont les gènes nécessaires à la production de cellules iPS?
- Oct4
- Sox2
- Klf4
- c-Myc
115
Comment peut-on introduire des gènes spécifiques dans les cellule pour la production d'iPS?
Par des vecteurs rétroviraux
116
L'utilisation des cellules iPS permet de guérir des maladies génétiques sans avoir recours aux ____, car les cellules corrigées ré-injectées provenaient de de l'organisme malade.
immunosuppresseurs
117
Chez l'humain, à quoi peut servir les cellules iPS? (2)
- Remplacer les gènes mutés pour ré-injecter dans le malade (technique de remplacement des gènes)
- Permet d'identifier de nouveaux médicaments en cultivant des cellules malades.
118
Décrivez la première mondiale de thérapie de remplacement cellulaire.
Contre dégénérescence masculaire.
1. Cellules iPS dérivées de cellules de la peau
2. Différenciation en épithélium rétinien, formation d'un feuillet pour implantation dans l'oeil.
119
Nommez des problèmes liés aux cellules iPS. (3)
1. Les vecteurs rétroviraux utilisés ont un potentiel oncogénique.
2. Les facteurs iPS ont aussi un potentiel oncogénique.
3. Il existe une variabilité intrinsèque dans le potentiel de différenciation des différentes lignées de cellules iPS.
120
Vrai ou Faux. Les cellules iPS sont appropriées pour la thérapie de remplacement cellulaire.
Faux. Parce que les vecteurs rétroviraux et les facteurs iPS ont un potentiel oncogénique. Elles sont appropriées pour l' étude des mécanismes des maladies et le criblage de médicaments.
121
Quelle est la différence entre la génétique classique et la génétique inverse?
La génétique classique permet l'identification de la mutation et du gène correspondant à partir d'un phénotype mutant.
La génétique inverse se sert de la technologie de l'ADN recombinant pour identifier le phénotype mutant associé à un gène dont on ignore la fonction. On doit générer des cellules dans lesquels des formes mutées du gène d'intérêt ont été introduites.
122
En génétique inverse, il est possible de faire une ____ du gène d"intérêt par ____ génétique (____ ____).
délétion
ciblage
gene targetting
123
Quels sont les différents types de mutants? (5)
1. KO total : KO des 2 allèles d'un même gène, si non létal.
2. KO spécifique : target des tissus spécifiques ou seulement à un moment particulier. - Promoteur spécifique à un tissu - Promoteur répressible
3. Le système Cre-Lox : permet un KO spécifique dans un tissu ou un type cellulaire particulier
4. Mutant ponctuel :sur certains acides aminés spécifiques ou certaines régions
5. Remplacement de gène : protéine de fusion fluorescente qui permet de suivre son expression in vivo
124
Comment se produit le ciblage génique chez la souris?
Par recombinaison homologue. - Transfection ADN dans des cellules ES qui remplace une copie du gène homologue.
125
Décrivez le processus pour l'obtention de souris ayant des gènes inactivées (ou KO). (5 étapes)
1. Transfection avec version modifiée du gène dans cellules ES.
2. Sélection des 1/1000 cellules portant le gène altéré.
3. Injection des cellules mutées dans des blastocytes.
4. On obtient une souris mosaïque (les cellules ES viennent d'une souris ayant un pelage différent alors présence de mosaïque)
5. Croisement avec une souris normale et obtention de souris portant une copie du gène dans toutes ses cellules
126
Vrai ou Faux. Pour produire une souris Cre-Lox, il faut produire deux souris transgéniques.
Vrai. Une qui contient la recombinase Cre sous le contrôle d'un promoteur spécifique à un tissu en particulier ou actif seulement durant une période spécifique du développement. Une autre qui contient le gène d'intérêt flanqué des sites de recombinaison LoxP.
Après on croise les souris pour produire un système Cre-Lox spécifique à un système particulier ou à un moment précis.
127
Comment les sites de reconnaissance de LoxP s'ajoutent de chaque côté du gène d'intérêt?
Par recombinaison homologue
128
À quoi sert la méthode de l'ARN interférent?
Sert à tester la fonction des gènes.
- Plus simple que l'invalidation d'un gène.
129
Qu'est-ce que la méthode de l'ARN interférent?
- Introduction, dans une cellule ou un organisme, d'une molécule d'ARN db, dont la séquence nucléotidique est similaire à celle d'une partie du gène à inactiver.
- ARN sb s'hybride alors avec l'ARNm produit par le gène ciblé et induit sa dégradation.
- Inactive ou réduit la transcription d'un gène.
130
Vrai ou Faux. Les ARN interférents sont produits à partir d'ADN db.
Faux. À partir d' ARN db.
131
Malgré le fait que la méthode de l'interférence par l'ARN facilite la génétique inverse, elle comporte des limitations (vs. KO total). Lesquelles? (4)
- N'inactivent pas efficacement tous les gènes.
- Les ARNi peuvent inactiver des gènes "hors cible" de la même famille.
- Certains tissus sont résistance (neurones chez nématodes)
- Pas une preuve indubitable du fonctionnement normal d'un gène.
132
Comment est-il possible d'augmenter l'efficacité de la recombinaison homologue?
- Utiliser des endonucléases à des sites spécifiques pour effectuer des cassures double brin dans un génome.
- Augmente de 1000x l'efficacité.
133
Décrivez les nucléases à doigts de zinc. (ZFN) (3)
- Protéine contenant une séquence protéique qui reconnait une séquence spécifique de l'ADN.
- Fusionnée au domaine nucléosique de FokI, qui coupe l'ADN.
- Produit une cassure double brin.
134
Décrivez TALEN. (3)
- Protéine contenant une séquence protéique qui reconnait une séquence spécifique de l'ADN.
- Fusionnée au domaine nucléosique de FokI, qui coupe l'ADN.
- Produit une cassure double brin.
135
Décrivez CRISPR-Cas9. (3)
- CRISPR : courtes répétitions en palindrome regroupées et régulièrement espacées.
- Assemblage nucléo-protéique contenant un ARN guide, reconnait le gène d'intérêt, et la nucléase Cas9, coupe l'ADN.
- Produit cassure double brin
136
Quels sont les deux types de réparation des cassures d'ADN db?
1. NHEJ (non homologous end joining)
2. HDR (homology-directed repair)
137
Nommez les caractéristiques du type de réparation des cassures d'ADN db appelé NHEJ (non homologous end joining) (4)
- Non conservatif : ne restaure pas la séquence initiale, produit un produit tronqué.
- Introduit des insertions ou délétions de nucléotides au hasard.
- Les 2 extrémités de la cassure sont rattachées ensemble.
- Utilisée pour inactiver des gènes
138
Nommez les caractéristiques du type de réparation des cassures d'ADN db appelé HDR (homology-directed repair) (3)
- Inclusion d'ADN homologue comme gabarit utilisé lors de la réparation
- Utilisée pour modifier le génome avec précision ou insérer de l"ADN exogène.
- Réparation précise
139
Vrai ou Faux. Les ZFN et TALEN sont fabriqués in vitro.
vrai
140
Décrivez la découverte de CRISPR.
- 1980, découverte séquence ADN chez E. coli : 5 répétitions partiellement palindromique et comprend un fragment d'ADN ressemblant à celui d'un bactériophage entre deux répétitions.
- 2005, CRISPR = système immunitaire de bactéries leur permettant de se défendre contre bactériophages.
- Suite à l'infection phagique, la bactérie excise un morceau d'ADNdb du phage à proximité d'une séquence PAM
- Assemblage d'une endonucléase bactérienne Cas9 avec des ARN non codants (guides) qui permettent le clivage spécifique à l'endroit désirée du génome.
141
Qu'est-ce que la séquence PAM? (5)
- Photospacer adjacent motif
- 3 nucléotides, NGG par exemple
- Requise pour la coupure par Cas9
- Permet à la bactérie de différencier son génome et celui du phage
- Réparation par jonction d'extrémités non homologues
142
Quels désavantages de TALEN a permis l'essor de CRISPR? (Selon article Médiagraphie)
Les domaines Fok1 (nucléase) fonctionnent sous forme de dimère, ce qui oblige à obtenir deux constructions avec des domaines de liaison à l’ADN dirigés contre des sites du génome présentant des orientations tête-bêche et un espacement correct. Hors, la fréquence de recombinaison est variable et la modification de l'ADN dépend du couple ADN-protéine. L'ingénierie des nucléases est coûteuse et difficile.
Avec CRISPR, le type de reconnaissance dépend d’un couple ADN-ARN : rien de plus facile à fabriquer!
143
Quels sont les avantages du système CRISPR-Cas9? (3)
1. Plus simple, plus rapide et plus économique que les technologies existantes.
2. Adaptée aux approches de criblage de nombreuses cibles.
3. Utilisation de multiples séquences d'ARN de guidage pour modifier simultanément plusieurs locus différents dans un même génome.
144
Décrivez l'immunité des bactéries médiée par CRISPR. (2)
1. ADN viral intégrée au génome au niveau du loci CRISPR (plusieurs centaines de répétitions avec une grande collection de séquences provenant d'une exposition antérieure avec des virus.) en 5', donc sera transcrit en premier! Les cellules qui survivent à l'infection du phage vont intégrer les séquences de protection et les transmettre à leurs descendants.
2. Production d'un long ARNm qui formera plusieurs petits ARNcr qui formeront un complexe avec Cas. Cas avec ARNcr auront pour tâche de trouver un ADN virale complémentaire et faire une cassure double brin.
145
À quoi sert l'ARNcr associé à Cas9? (2)
- Une portion est requise pour l'association avec Cas9
- Une autre portion reconnaît des séquences dans le génome.
146
Vrai ou Faux. Il y a deux plasmides à transfecter dans les cellules pour obtenir CRISPR-Cas9.
Faux. On peut mettre la cassette exprimant l'ARN guide (incluant la séquence cible) et la cassette exprimant la protéine Cas9 sur le même plasmide.
147
Est-ce qu’une souris KO est une souris transgénique?
Oui, une souris KO est une souris transgénique, car on modifie le génome de la souris. Les souris transgéniques ont été développées avant les souris KO par l'introduction d'une construction génétique dans un oeuf fécondé de souris qui sera réimplanté dans une souris porteuse. Par exemple, un modèle de tumeur du foie a pu être développé en faisant une souris transgénique qui exprimera un oncogène sous le contrôle d'un promoteur foie spécifique. La souris KO passe par les cellules ES car il faut sélectionner les cellules qui auront le gène inactivé. Finalement, dans les 2 cas le génome de la souris aura été modifié: dans la première souris, communément appelé transgénique, il y aura addition de matériel génétique et dans la deuxième souris, la KO, il y aura inactivation d'un gène. Ces 2 souris sont donc des souris transgéniques! Si tu introduit la Cas9 dans une souris, elle sera également une transgénique.
148
Quelle est la résolution du microscope optique? Pourquoi?
- Le microscope optique permet de visualiser des détails espacés de 0,2 um.
- La limite de résolution du microscope optique est définie par la longueur d'onde de la lumière visible, qui varie de 0,4 um à 0,7 um
149
Peut-on détecter des microtubules en microscopie photonique ? Expliquez
En microscopie optique, la limite de résolution est de 0,2 µm. La taille d'un microtubules est de 0,025 µm ce qui est significativement inférieur à la limite de résolution. Cependant, il faut faire la différence entre la résolution et la détection. Comme il est écrit dans les notes « un petit objet en deçà de la limite de résolution peut être détecté s'il émet de la lumière », il sera donc possible de détecter des microtubules en microscopie photonique si on applique une coloration fluorescente à ceux-ci.
150
Quels produits utilise-t-on pour fixer les prélèvements de tissus avant microscopie?
Formaldéhyde et glutaraldéhyde, qui forment des liaisons covalents avec les groupements amines libres des protéines et stabilisent.
151
Quelle est la limite incontournable pour tout microscope?
Pour une radiation donnée, aucun détail structural plus petit que sa longueur d'onde ne peut être résolu.
152
Quels sont les plus petits objets pouvant être discernés en MO?
Les bactéries et les mitochondries (0,5 um)
153
Quelle est la limite de résolution d'un MO dans le meilleur des cas avec une lumière violette?
0,2 um
154
Expliquez la microscopie sur fond noir.
- Seule la lumière dévié par l'objet atteint la lentille.
- Objet brillant sur fond noir
155
Expliquez la microscopie à contraste de phase.
- La phase de la lumière est modifiée quand elle passe dans des parties plus ou moins épaisses
- Utilise l'effet des interférences : deux ondes en phase s'additionnent (+brillant) et deux ondes en décalage de phase se soustraient (+pâle)
156
Décrivez la microscopie sur fond clair.
- Transmission de la lumière à travers une cellule en culture
- Objet absorbe certaines longueurs d'onde et laisse passer les autres, donc on peut voir en couleur.
157
Décrivez la technique de l'hybridation in situ.
- Méthode de détection d'ADN ou d'ARN spécifique
- Permet étude de l'expression différentiel des gènes
- Il faut préalablement fixer les cellules pour en faire des coupes.
- Une sonde radio-marquée (nucléotides radioactifs), fluorescente ou couplé à la digoxigénine est composée d'ARN ou d'ADN complémentaire aux séquences d'intérêt. La sonde va s'hybrider sur les séquences d'intérêt.
- Peut être distinguée par radioautographie, immunocytochimie, ou FISH.
158
Une sonde marquée à la digoxigénine sera reconnue par un ____ ____.
anticorps fluorescent
159
Décrivez le FISH (Fluorescence in situ hybridization).
- Technique d'hybridation in situ utilisant des sondes fluorescente
- Localiser une séquence spécifique d'ADN sur des chromosomes ou d'ARN.
160
Vrai ou Faux. En ce qui concerne l'hybridation in situ, la technique de radioautographie est beaucoup plus utilisée que le FISH.
Faux. Parce que le FISH est beaucoup plus sécuritaire, plus stable et plus facile à détecter.
161
Vrai ou Faux. Pour que le FISH puisse avoir lieu, il faut que l'ADN se déshybrider préalablement.
Vrai. Parce que la sonde reconnaît l'ADN grâce à une séquence complémentaire. Une hybridation nécessite préalablement une déshybridation.
162
Vrai ou Faux. La microscopie optique conventionnelle et la microscopie électronique nécessitent que la cellule soit morte.
Vrai
163
Décrivez la microscopie à fluorescence.
- Molécules fluo absorbent la lumière à une longueur d'onde spécifique et en émettent à une longueur d'onde différente.
- Permet de visualiser des molécules fluorescentes endogènes et exogènes.
164
Vrai ou Faux. Pour voir les fluorophores en microscopie à fluorescence, ils doivent être couplés à des anticorps spécifiques à la protéine cible.
Vrai
165
Vrai ou Faux. Les ponts quantiques sont des fluorochromes qui perdent leur fluorescence rapidement.
Faux. Les ponts quantiques sont des nanoparticules fait de séléniure de cadmium qui sont plus stables que les fluorochromes organiques.
166
Quelle est la différence entre l'immunocytochimie et l'immunofluorescence?
Immunocytochimie
- Inclut l'immunofluorescence
- Implique des interactions antigène-anticorps
Immunofluorescence
- L'anticorps est lié à une molécule fluorescente permettant de visualiser l'antigène cible.
167
Vrai ou Faux. L'immunofluorescence indirecte correspond à l'utilisation d'un anitcorps secondaire fluorescent pour reconnaître un anticorps primaire.
Vrai
168
Donnez un exemple d'anticorps primaire et d'anticorps secondaire.
Ac primaire
- Anti-souris (espèce étudiée) dans le lapin - appliqué sur des coupes de tissus de souris
Ac secondaire
- Anti-lapin dans chèvre - dirigé contre l'anticorps primaire de lapin couplé à : une molécule fluorescente, radioactive, enzyme ou à une particule opaque aux électrons (or colloïdal).
169
Vrai ou Faux. L'utilisation d'anticorps secondaire permet d'amplifier un signal.
Vrai
170
Comment faire pour obtenir un image en trois dimension à partir d'une image provenant d'un microscope à fluorescence?
1. Par déconvolution d'image par ordinateur
2. Par microscope confocal: balaye le spécimen dans toute son épaisseur et concentre le faisceau lumineux en un point. Les données pour chaque point sont rassemblées séquentiellement et enregistrées sur ordinateur. Formation d'une image composite.
171
Quelle est la différence entre une image prise par un microscope à fluorescence et confocal?
Fluo: L'image est flou due à la présence de structures fluorescentes en dessous et au dessus du plan focal.
Confocal: L'image est débarassée de l'information en dehors du plan focal
172
Comment se fait-il que les images prises par microscopie confocale sont si bien définies?
Parce qu'elle détecte un plan très mince de la cellule, tandis qu'à fluorescence elle détecte la fluorescence de tout le spécimen.
173
Vrai ou Faux. Les protéines de fusion se comportent comme la protéine sauvage au contraire des anticorps fluorescents.
vrai
174
La GFP peut servir de protéine "____" pour déterminer le patron d'expression d'un gène.
La GFP peut servir de protéine "rapporteur" pour déterminer le patron d'expression d'un gène.
175
Décrivez la technique FRET (transfert d'énergie de résonnance de la fluorescence).
- Permet de suivre les interactions entre 2 protéines.
Protéine X : couplée à GFP exité en violet, émet en bleu
Protéine Y : couplée avec GFP excité en bleu, émet en vert.
Si les protéines sont suffisamment proches, une excitation en violet produira une émission en vert.
176
Décrivez la photoactivation.
- Fait intervenir une forme inactive d'une protéine fluorescente, puis une activation soudaine à un endroit spécifique par un rayon lumineux.
- Caractérisation du déplacement d'une protéine, de sa demi-vie et les sentiers impliqués dans sa dégradation
177
Décrivez le FRAP (récupération de fluorescence après photoblanchiment).
- Dans une région spécifique, photoblanchiment
- Analyse du déplacement des molécules fluorescentes restantes dans la région blanchie.
- Information sur la cinétique de la protéine
178
Décrivez les indicateurs sensibles aux ions.
Leur émission lumineuse réflète la concentration ionique locale.
Ex. l'aequorine émet un éclair de lumière lorsque du Ca++ est émis.
179
Quels sont les deux types de microscopie électronique?
1. À transmission
- Inversé comparativement au MO
- Cathode émet des électrons dans une colonne + anode.
- Sous vide
- Les lentilles sont des bobines magnétiques
- Électrons +/- diffractés par les structures cellulaires selon leur densité.
- Immunomarquage à l'or : Utilisation d'Ac! Ac 1aire et Ac secondaire fixé sur une particule d'or colloïdale opaque au électrons (point noir)
2. À balayage
- Spécimen vaporisé d'un métal lourd et balayé par un faisceau d'électron
- Spécimen émet des électrons secondaires. Produit une vue 3D de la surface.
- La résolution est plus faible que pour le ME à transmission (10 nm vs 1 nm)
180
Quel est le principe de la microscopie électronique?
Concentrer un faisceau d'électrons sur le spécimen biologique.
181
Résolution théorique du microscopie électronique : ____ nm En pratique (lentilles, préparation du spéciment,...) au mieux ____ nm
0,002 nm
1 nm
182
Vrai ou Faux. Dans la microscopie électronique à transmission, la zone claire correspond aux électrons non diffractés qui sont dirigés sur un écran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur, tandis que la zone sombre correspond aux électrons diffractés qui n'atteignent pas l'écran.
Vrai
183
Vrai ou Faux. Il est difficile de voir la disposition 3D en ME à transmission donc il faut faire des coupes sériées pour reconstruire l'image.
vrai
184
Vrai ou Faux. Les lignées cellulaires sont formées à partir de cellules saines tandis que les cellules transformées sont dérivées de tumeurs. Les deux types de lignées cellulaires (immortelles et transformées) sont immortelles.
vrai
185
À quoi sert le bévacizumab?
C'est un anticorps monoclonal dirigé vers VEGF-A, importante pour faire pousser les vaisseaux sanguins, en vue de neutraliser ses effets sur les différents récepteurs qu'il active. Vendu sous le nom de Avastin, c'est un antitumoral.
