Grupp 5 - CRISPR/Cas9

Question 1

CRISPR/Cas upptäcktes först hos bakterier. Vad var dess syfte hos dem?

Answer 1

Antiviral försvarsmekanism. Fragment av virusets genom integrerades i CRISPR som ett bibliotek så att bakterien kunde skydda sig när den träffade på samma virus andra gången.

Question 2

Vad står CRISPR för?

Answer 2

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Question 3

Vad är Cas9? Vad står det för?

Answer 3

CRISPR Asociated System 9.

Ett endonukleas som används för specifik DNA-klyvning från inkräktande virus

Question 4

Vilka två delar består Guide-RNA av? Vad gör de individuellt samt vad för gRNA som helhet?

Answer 4

CRISPR RNA (crRNA) - 20bp nukleotidsekvens som är komplementär till målsekvensen

TracrRNA - länkar ihop cRNA och cas9

gRNA agerar vägvisare för cas

Question 5

Vilka tre steg ingår i CRISPR/Cas9-processen?

Answer 5

1. Spacer acquisition
2. crRNA processing
3. Interference

2&3 händer endast andra gången man stöter på viruset

Question 6

Beskriv spacer acquisition

Answer 6

Cas-komplexet känner igen PAM-sekvenser i virusgenomet vilka visar var den ska klyva. Virusgenomet klyvs och ett fragment, sk. spacer, förs in i biblioteket CRISPR-array

Question 7

Beskriv crRNA processing

Answer 7

Uttryck av CRISPR-locus som leder till bearbetning av de CRISPR-komponenter som skapar de delar som behövs för gensaxen.

Mha TracrRNA, Cas9, RNase 3 kan Pre-cRNA:t som fås genom transkription av CRISPR-arrayen bearbetas tills man får fram just den crRNA-biten man behöver

Question 8

Beskriv interference

Answer 8

1. cas9 bildar komplex med gRNA
2. matchar med PAM-sekvens+protospacer
3. cas9 genomför dubbelsträngsbrott

Question 9

Vad kan CRISPR-systemet användas för inom forskning - dvs hur kan det påverka gener?

Answer 9

Det kan tysta, laga eller lägga till gener

Question 10

Vilka tre delar måste genomföras för att kunna använda CRISPR-systemet för genredigering?

Answer 10

1. Design av syntetisk gRNA - riktar cas9 mot den sekvens man vill åt
2. Föra in gRNA och cas9 i målcellen (+ ev. mall för ny gen)
3. Manipulering av cellens DNA-reparationsmekanismer

Question 11

Hur designas syntetiskt gRNA (sgRNA)? vad behöver man veta om sin sekvens?

Answer 11

Om sekvensen:

• Var genen är
• Vad den innehåller
• Vad slutprodukten är

Om sgRNA:

• tracrRNA är mestadels konstant, endast cRNA ska utformas
• Nukleassätet ska helst vara i den translaterade delen av genen
• Hitta PAM för sin typ av cas9 i DNA:t
• crRNAs måltavla ska vara 20bp lång

Question 12

Hur förs gRNA och cas9 in i målcellen?

Answer 12

Plasmid vektor, viral vektor, gRNA+mRNA, cas9/gRNA komplex

Question 13

Hur manipuleras cellens DNA-reparationsmekanismer?

Answer 13

Den modifierade cas9/sgRNA-komplexet hittar den eftersökta genen och orsakar ett dubbelsträngsbrott. Cellen försöker sedan fixa skadan med nonhomologous end joining (NHEJ) eller homology directed repair (HDR).

Det är i detta stadie man kan inaktivera, laga, eller sätta in sekvenser!

Question 14

Hur går NHEJ till?

Answer 14

Nukleaser + polymeraser klipper av/bygger på, sedan ligeras strängarna ihop. Detta inducerar med hög risk insert/deletionsmutationer vilket ger frameshift och därmed tidiga stoppkodon, vilket stänger av gener.

Question 15

Hur går HDR till?

Answer 15

Under reparationen används en homolog sekvens som mall. Här kan en syntetisk sekvens med homologa regioner + önskad gen användas för att sätta in en ny gen/rätta till en muterad gen

Question 16

Vilka terapeutiska tillämpningar finns för CRISPR/Cas9?

Answer 16

Genterapi - möjligt botande av monogeniska recessiva sjukdomar

Cancerterapi - CAR-T-celler är modifierade T-celler som är experter på att identifiera tumörceller.

Onkolytiska virus - virus som modifierats för att bli mer specifika och selektivt infektera och avdöda tumörceller

Stamceller - kan “gömma” stamceller från mottagarens immunsystem genom att ta bort MHC1 och därmed förhindra avstötning

Diagnostiskt verktyg

Question 17

Vilka användningsområden finns utöver terapeutiska tillämpningar?

Answer 17

Inom livsmedel och jordbruk - skapa fördelaktiga, tåliga grödor

Modifiera djur - tex göra dem immuna mot vissa sjukdomar

Question 18

Nämn tre etiska implikationer med CRISPR/cas9

Answer 18

1) kunskapsluckor - vi vet ännu inte de långsiktiga effekterna på individ och generationsnivå
2) Slippery slope - genom att tillåta användning av genredigering av något etiskt moraliskt öppnas dörren för en dominoeffekt som kommer leda till etiskt omoraliska användningsområden
3) global rättvisa - vem är tekniken för? vem har åtkomst?