Genkloning (bakterier), restriktionsenzym, plasmider, DNA-elektrofores

Question 1

Definiera “kloning”

Answer 1

Kloning innebär skapandet av genetiska kopior av en individ/cell/gen.

Question 2

Vilka sorters artificiell kloning finns det? (3st)

Answer 2

• Reproduktiv kloning (kloning i äggcell)
• Terapeutisk kloning (stamceller)
• Molekylär kloning (genkloning)

Question 3

Nämn de 4 övergripande stegen för molekylär kloning av humana gener i bakterier

Answer 3

1: Klyv det humana DNA:t samt bakterieplasmiden med restriktionsenzym
2: Ligera det humana DNA:t med plasmiden
3: Transformera in den rekombinanta plasmiden i bakterier
4: selektera de bakterier som producerar det humana proteinet (de som har rekombinanta plasmider)

Question 4

Vad är syftet med restriktionsenzymer/nukleaser?

Answer 4

De klipper ut den DNA-sekvens man vill ha genom att hydrolysera fosfodiesterasbindningar

Question 5

Vad är syftet med plasmiden?

Answer 5

De är vektorer och fungerar som en värd för DNA-fragmentet man vill klona

Question 6

Vad används Elektrofores av DNA till vid kloning?

Answer 6

Analys av DNA-fragmenten

Question 7

Vad sker vid ligering?

Answer 7

DNA-fragmenten klistras ihop

Question 8

Vad är en rekombinant plasmid?

Answer 8

En plasmid med insatt humant DNA

Question 9

Vilka två sorters nukleaser/restriktionsenzym finns?

Answer 9

Endonukleaser, exonukleaser

Question 10

Var klipper endonukleaser DNA:t?

Answer 10

I mitten/inne i DNA:t. De klyver sekvensen i två

Question 11

Var klipper exonukleaser DNA:t?

Answer 11

De klipper i ändarna av sekvensen. De gör sekvensen kortare.

Question 12

Det finns tre typer av endonukleaser, typ 1, 2 och 3. Vilken används för kloning?

Answer 12

Typ 2

Question 13

Beskriv hur typ 2 endonukleaset vet var det ska klyva DNA:t

Answer 13

Det har en specifik igenkänningssekvens där det klyver DNA:t. Sekvensen är ett palindrom, dvs det är symmetriskt fram- och baklänges - exempel:

5’ G A A T T C 3’
3’ C T T A A G 5’

Question 14

Ge exempel på några restriktionsenzymer (förkortningarna)

Answer 14

Hae III
Taq I
Hha I
EcoRI
EcoRV
Pst I

Question 15

Vilka två sorters plasmider kan bildas vid ligeringen?

Answer 15

Rekombinanta plasmider (human+bakterie) och vanliga plasmider (endast bakterie)

Question 16

Vad är en kloningsvektor?

Answer 16

En DNA-molekyl som kan användas för att föra in främmande DNA i en cell

Question 17

Vilka två DNA-molekyler uppfyller kraven för att kunna användas som kloningsvektorer?

Answer 17

Plasmider och viruskromosomer

Question 18

Vilka krav finns för kloningsvektorer? 4st

Answer 18

• Måste kunna komma in i värdcellen
• Måste kunna replikeras inne i cellen för att producera flera kopior av sig själv
• Polylinker (MCS)
• Selektionsmarkörer (reportergener)

Question 19

Vilka två sätt kan plasmiden finnas i bakterien efter transformeringen?

Answer 19

1: Replikering. Plasmiden finns löst i bakteriecytoplasman
2: Integreration: Plasmiden integreras i bakteriens kromosom. Fördelaktigt då det gör plasmiden mer stabil

Question 20

Hur används polylinker?

Answer 20

Den syntetiska polylinkern legeras ihop med en plasmid för att konstruera en användbar kloningsvektor

Question 21

Beskriv polylinker - vilka egenskaper har den?

Answer 21

• Många MCS är bra, men inte mer än ett igenkänningsställe

- 50-100 bp

Question 22

Vad innebär egenskapen multiple cloning sites (MCS)?

Answer 22

Att DNA-sekvensen har många sites för restriktionsenzym av olika typer att binda in till

Question 23

Vad för olika selektionsmarkörer finns? (2st)

Answer 23

Antibiotikaresistensgener och reportergener

Question 24

Vad är syftet med selektionsmarkörer?

Answer 24

Att hitta och isolera de kolonier/celler som tagit upp plasmiden

Question 25

Hur fungerar antibiotikaresistensgener som selektionsmarkörer?

Answer 25

Om man ger bakterien resistens mot antibiotika samtidigt med DNA-segmentet man vill klona kan man odla på antibiotikainnehållande medium och döda alla bakterier som inte tagit upp den rekombinanta plasmiden

Question 26

Vad är en reportergen?

Answer 26

En DNA-sekvens som kodar för ett protein som lätt kan påvisas

Question 27

Vilka egenskaper bör en reportergen ha

Answer 27

- Koda för protein som lätt kan påvisas - Bör ej förekomma naturligt i den organism man ska föra in reportergenen i - Kan fungera för sig själv eller kopplas till en annan gen (den man vill studera) så att de uttrycks tillsammans

Question 28

Ge exempel på användningsområden för reportergener

Answer 28

- Man kan kontrollera hur framgångsrikt ett kloningsförsök är - Man kan sätta in sekvenser framför reportergenen och undersöka om de fungerar som promotorer (och isf hur starka de är) - Man kan undersöka hur effektivt genen translateras eller följa vart genprodukten tar vägen i cellen

Question 29

Ge exempel på proteiner som kodas av reportergener och hur man kan påvisa dem

Answer 29

GAL/lacZ (beta-galaktosidas): hydrolyserar färglösa galaktosider till färgade produkter LUC (Lucideras): oxiderar luciferin varvid fotoner emitteras GFP (green fluorescent protein): fluorescerar vid UV-bestrålning CAT (kloramfenikolacetyltransferas): överför acetylgrupper till kloramfenikol - kan ge antibiotikaresistens mot kloramfenikol

Question 30

Hur kan man ligera in främmande DNA i en plasmid och sedan välja ut de plasmider som fått insert?

Answer 30

1: plasmid innehållande ampicillin- + tetracillinresistens klyvs vid ampicillin-res-genen (tar bort ampicillinresistensen) 2: Främmande DNA ligeras till plasmiden med DNA-ligas 3: Plasmiden förs in i E. coli som sedan odlas på tetracyklininnehållande agar - selekterar fram de som tagit upp plasmid 4: Överför kolonier till matchande platser på plattor med a) tetracyklin och b) tetracyklin + ampicillin 5: Se vilka kolonier som INTE växt på platta b) - dessa har tagit upp rekombinanta plasmider.

Question 31

Vad är skillnaden mellan transformering och transfektion?

Answer 31

Transformering: När en bakterie tar upp DNA från omgivningen (naturlig process). Bakterien måste vara kompetent eller göras kompetent Transfektion: När man överför DNA till en human/däggdjurscell

Question 32

Hur används lacZ/betagalaktosidas som reportergen? Vilken skillnad kan observeras hos de bakterier som fått insert och inte?

Answer 32

Efter transformation odlas bakterierna på agar innehållande X-gal och IPTG. Insert: växer med vita kolonier Ingen insert: växer med blå kolonier

Question 33

Hur påverkar pUC-plasmiderna med lacZ-genen E. colis beta-galaktosidasmolekyler? Hur ser de ut i vanliga E. coli? +++++++

Answer 33

Vanliga E. coli har ofullständiga lacZ-gener och producerar därmed ofullständiga betagalaktosidasmolekyler utan normal N-terminal --> ofunktionellt enzym pUC-plasmider med lacZ-genen kodar för en liten del av betagalaktosidasets N-terminal, och ger därför upphov till små betagalaktosidasfragment (alfa-peptider) som gör betagalaktosidasmolekylerna hela --> ger funktionellt enzym

Question 34

Vad är X-gal och hur fungerar det? +++++

Answer 34

Det är en galaktosanalog som kan användas som substrat av betagalaktosidasenzymet.

Question 35

Hur bestäms bassekvensen av E. coli efter kloning?

Answer 35

Lambda-DNA klyvs i många fragment av olika storlek och ligeras i plasmider. Efter transformation renas plasmid fram ur en av kolonierna och klyvs med restriktionsenzym för att separera lambda-DNA:t från plasmiden och det undersöks med gelelektrofores för att se om det fanns ett insert och isf hur stort det var. Sekvensering visar vilken del av lambda-DNA:t som satt i plasmiden

Question 36

Vilka steg ingår i klyvning av DNA med restriktionsenzym? (5 steg)

Answer 36

1. Börja med 1 mikrogram (ug) DNA i 23ug vatten 2. Tillsätt vatten och RE till en totalvolym av 50ul 3. Inkubera i 37 grader 1-2h 4. Upphetta till 65 (alt 80) grader i 10-15 min 5. Ta ut ett prov för att kontrollera att klyvningen fungerat

Question 37

Hur går gelelektrofores till?

Answer 37

Ett DNA-prov laddas i brunnar på gel (vid minuspolen) ofta innehållande etidiumbrotid, ström appliceras och fragmenten börjar färdas mot pluspolen

Question 38

Vad separerar DNA-elektrofores fragmenten baserat på?

Answer 38

Storlek eller konformation (cirkulär/linjär)

Question 39

Hur påverkar geltätheten separationen av DNA-fragmenten?

Answer 39

Tätare gel separerar mindre fragment då större fragment har svårt att ta sig igenom gelen och fastnar vid brunnen.

Question 40

Vad används etidiumbrotid till?

Answer 40

Visualisering av DNA:t. Det binder i DNA:t mellan basparen (intercalering). Vid belysning med UV-ljus lyser DNA:t med gul färg. OBS: cancerframkallande

Question 41

Vilket ämne kan användas istället för etidiumbrotid och hur farligt är det?

Answer 41

GelStar, ofarligt

Question 42

Hur påverkas mängden fragment av tillsatsen av olika RE?

Answer 42

Det blir olika mängd fragment beroende på antal igenkänningsställen som RE har.

Question 43

Hur vandrar de olika konformationerna av plasmid-DNA i gelen?

Answer 43

Mer relaxerade former av DNA:t (cirkulärt) vandrar långsammare än de supercoilade formerna.