Western blot FISH mikroarray Flashcards
hvilke Teknikker bruker man for å analysere DNA, RNA og proteier?
• PCR • Southern og Northern blot analyse – Gamle teknikker – Erstattet av PCR og sekvensering (eks.mutasjonsdeteksjon, virusdeteksjon, genuttrykk) • Western blot analyse – Proteindeteksjon • In situ hybridisering/FISH – Utbredt til analyser på hele celler eks. kromosomanalyer, kreftdiagnostikk • Vevsmikroarray (protein, mRNA) – Kan analysere mange prøver/pasienter samtidig • Sekvensering
hvorfor bruker man Western blot analyse?
For å Identifisere og kvantifisere proteiner
Hvordan kan man påvise ett bestemt
protein?
Man bruker et antistoff slik at den kan binde seg til sin helt spesifikke antigen på proteine
hva er blotting?
i western blotting bruker man gel elektroforese. vanligvis bruker man PAGE som gel. PAGE er veldig kjøre så man overfører prøve fra dem til en annen membran, det er denne overføringen som kalles blotting.
hvordan fungerer protein gelektroforese og hvorfor bruker vi det?
ønsker å skille proteiner fra hverandre ved å se på deres lengde. Men alle protiener har forskjellige ladninger som kan påvirke på resultatene så for å bli kvitt dette probleme tilsetter man sds. Denne er negativt ladet og vil binde seg rundt proteinene. Dette vil føre til at alle proteiner blir negativt ladet slik at den eneste variabelen er lengden til proteinene. Proteinene er vanligvis kveilet så for å rette dem ut brukes eks DTT som retter opp molekylene slik at de kan bli klare for analysering. DTT vil også bryte eventuelle disulfid bindinger som kan oppstå mellom proteiner
hvordan foregår elektroblotting?
Har flere lag med filter papir, og et lag med blotting membran og gel. alle lagene settes oppå hverandre som en sandwich sammen med en buffer. Blotting Membranen oppe på bufferen. Så tilsetter vi strøm. Gelen er orientert på den negative polen og motsatt med membranen. Membranen vil da bli positivt ladet og de negative proteinene vil da flytte seg til membranen. Proteinene kan ikke flytte seg ned siden det området er negativt og proteinene er selv negative. Blotting membranen vil da få et print som er eksakt lik gelen.
forklar kort hele prosessen som skal til får å analysere proteiner
Har en skål med celler og tilsetter en buffer som bryter ned cellen slik at vi får tak i proteiner inne i cellen. Samler dette i et rør og sentrifugerer dette. Da får vi en supernantant som inneholder alle proteiner i cellen, dette kalles for et proteinlysat.
Deretter tilsetter vi sds som gjør proteinene negative og et annet stoff (DTT) som strekker ut proteinet eller bryter di sulfid bindingene mellom forskjellige proteiner (denaturerer). Plasserer prøven i brønner på gele og setter på strøm slik at de kan skilles basert på størrelse. deretter blottes gele. Etter dette tilsettes antistoffer (primær antistoffer og sekundære antistoffer) primære antistoffer binder seg til antigen og sekundær til primær antistoff. Sekundær antistoff er merket med fluoriserende materiale eller et enzym og de er polykromale. deretter blir prøven analysert digitalt og svaret blir gitt ut
hvorfor har man både et primært og et sekundært antistoff for
Man har dem fordi det vil forsterke og gjøre det lettere å detektere proteinet, hadde man primær antistoff alene så er ikke de nødvendigvis nok til å gi et signal som vi kan detektere. Spesielt når vi har lite av et protein
hvordan blir informasjon fra gel overført til blotting membranen?
Sekundært antistoff med enzym bundet til primær antistoff blir bundet til et protein. så tilsetter vi et substrat med h202 som reagerer med enzymet og sender ut et lys som kan ses som en svart strek på blotting membranen
hva står FISH for?
fluorescens in situ hybridisering
forklar hvordan FISH metoden fungerer
Her bruke man ofte vevsapparater. Vi tilseter en probe som er helt spesifik for det vi leter etter. Proben er merka med eks biotin. Proben finner den riktige sekvensen og binder seg til den. Så tilsettes fluoriserende materiale som binder seg og farger deler eller hele kromosome. de fargede delene ses under et fluorescensmikroskop
gi eksempler på noen anvendelser av FISH
• Deteksjon av kromosomabnormaliteter
– Trisomi 21 (downs syndrom)
• Amplifisering av gener (mengde av et gen)
– Her2
• Translokasjoner
– t(9;22) (kombinering/flytting av gener mellom kromosomer)
