10. Enzimek felhasználása analitikai célra. Enzimes elektródok és bioszenzorok felépítése.

Question 1

Enzimek analitikai célra való használata

Answer 1

Enzimanalitika más: ilyenkor az E aktivitását és mennyiségét mérjük

enzimet felhasználva mérhetjük:

1. S mennyiségét (ez az analitikum)
2. E markerként szerepel (immunanalitika) –> pl.: ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay
3. I mennyiségét
4. E elektród- vagy bioszenzor felépítésében vesz részt

Question 2

S mennyiség meghatározás a.

Answer 2

a. a reakciót végig kell futtatni

fogyó S vagy keletkező P mérhető változást okoz –> mérhetünk: szín, pH, spektrumváltozást

pl.: E: urát oxidáz
S: húgysav
P: allantoin

293 nm-en az allantoin nem nyel el, így az abszorbancia csökken –> A (abszorbancia) - t diagram

Question 3

S mennyiség meghatározás b.

Answer 3

b. nincs közvetlenül mérhető változás az enzimreakció során:
indikátorreakciót kapcsolunk rá
pl.: reakció: hexokináz glükózt glükóz6P-á alakítja
–> indikátorreakció: glükóz6Pot glükóz6P-dehidrogenázzal 6Pglükonáttá oxidáljuk

ezt a NADP koszubsztrát NADPHvá redukálódása teszi lehetővé
NADPH 340 nm-en nyel el

Question 4

E mint marker

Answer 4

ELISA módszer (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - szendvics módszer

1. rögzített antitest
2. antigén beköt (analitikum), mosás
3. detektáló antitest az antigénhez
4. enzim kötött másodlagos antitest az utóbbi antitesthez
5. S hozzáadás –> detektálható termékké alakul

Question 5

Kinetikai mérést mikor használhatunk S meghatározásra

Answer 5

1. Ha S&laquo_space;Km az M-M hiperbola kezdeti lineáris szakaszán vagyunk

–> reakciósebesség, v ismeretében megállapíthatjuk S-et

2. Ha S»Km csak inhibítor vagy aktivátor koncentrációját tudjuk megmérni
   ilyenkor az enzimes reakció 1/v reciprok sebessége arányos az inhibítor vagy aktivátor koncentrációjával

pl.: diagnosztikában: heparin –> trombin, növényvédőszerek: inszekticid –> acetilkolinészteráz meghatározása

Question 6

Bioszenzorok

Answer 6

rögzített enzimet vagy sejtet használ

felépítés:
E-ből (biokatalizátor, átalakítja S-t P-vé, sejt vagy enzim) jel a jelátalakítóba (elektromos jellé alakít) –> erősítő –> számítógéppel jelfeldolgozás (tárolás, konvertálás stb.)

Question 7

Enzimelektród

Answer 7

rögzített enzimet vagy sejtet használ

1. amperometriás vagy
2. potenciometriás

Question 8

amperometriás enzimelektród

Answer 8

glükózelektród: oldott oxigént méri
a membránfelületen gélben rögzített glükózoxidáz enzim és kataláz –> ezt is egy membrán határolja, ami a S-ra (glükóz) és a P-re (glükonsav) áteresztő

a gélben csökken az oxigén konc., ezt mérjük

KCl elektrolit
Pt-katód: O2 + 4H+ + 4e- –> 2 H2O
Ag-anód: 4Ag + 4Cl- –> 4AgCl + 4e-

Question 9

Potenciometriás enzimelektród

Answer 9

pH-üvegelektród –> az üveggömbön van a gélben rögzített enzim, kívül membrán
–> akkor használjuk, amikor H+ változás következik be az enzimes reakció hatására

kalomel referencia elektródot kötünk hozzá

pl.: penicillinG –> (E: penicillináz) penicilloinsav + H+
lipid + víz –> (E: lipáz) glicerin + zsírsav + H+
L-Aminosav + O2 + H2O –> (Laminosav oxidáz) ketosav + NH4 + H2O2
L-Asn + H2O –> (LAsn-áz) L-Asp + NH4+

Question 10

Fő pontok

Answer 10

1. Enzimek analitikai célra való alkalmazása (S, I mennyiség meghatározás, E mint marker - ELISA, bioszenzor, elektród)
2. S mérés két fajája: S és P változás jelet ad (pl.: húgysav, ureát-oxidáz, allantoin) és amikor nem ad jelet, indikátor reakció kell a segéd reakció mellé (glükóz –> glükóz6p–> 6pglükonát NADPH nyel el 340 nmen)
3. E mint marker ELISA
4. Kinetikai mérést mikor használhatunk S meghatározásra (pl.: S: heparin - E: trombin, S: inszekticid, E: acetilkolinészteráz)
5. Bioszenzorok
6. Amperometrikus elektród (glükózelektród - oldott oxigénfogyást mér)
7. Potenciometrikus elektród (H-üvegelektród)