Purificación de proteínas

Question 1

Purificación de una nueva proteína

Answer 1

• Se emplean diferentes métodos secuenciales de forma empírica hasta encontrar la mejor forma
• Con cada paso, la cantidad de muestra se hace más pequeña pero la actividad específica va siendo mayor
• ## Los métodos caros se reservan para el final

Question 2

Tipos de cromatografía

Answer 2

• En papel
• En capa fina
• En columna
• De intercambio iónico
• De exclusión molecular
• De afinidad
• Líquida de alto rendimiento

Question 3

¿Qué es la cromatografía?

Answer 3

• Técnica para fraccionar mezclas orgánicas al desplazarlas a través de una matriz
• Método de separación en el que se aprovechan las diferencias en el coeficiente de partición entre una fase móvil y una estacionaria para separar componentes de una mezcla

Question 4

¿Qué es el coeficiente de partición?

Answer 4

Cociente entre las concentraciones de una sustancia en las 2 fases formadas por 2 disolventes inmiscibles en equilibrio, que mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos 2 disolventes

Question 5

Fases de la cromatografía

Answer 5

• Un soporte mantienen sostenida la fase estacionaria
• En la fase estacionaria, los componentes de la muestra que interaccionan con ella, tendrán un tiempo de retención mayor
• La fase móvil acarrea la muestra

Question 6

¿Qué es la retención?

Answer 6

Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser sólido o un líquido anclado a un soporte sólido

Question 7

¿Qué es el desplazamiento?

Answer 7

Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil que puede ser un líquido o gas

Question 8

¿Qué es la elución?

Answer 8

Migración (pero también separación) de los componentes de una mezcla retenidos en la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase móvil

Question 9

Cromatografía sólido-líquido

Answer 9

Fase estacionaria: sólido
Fase móvil: líquido

Question 9

Cromatografía líquido-líquido

Answer 9

Fase estacionaria: líquido anclado a un soporte sólido
Fase móvil: líquido

Question 10

Cromatografía líquido-gas

Answer 10

Fase estacionaria: líquido no volátil impregnado en un sólido
Fase móvil: gas

Question 11

Cromatografía sólido-gas

Answer 11

Fase estacionaria: sólido
Fase móvil: gas

Question 12

Cromatografía en papel

Answer 12

• Fase estacionaria: papel filtro
• Para aminoácidos individuales o dipéptidos
• Empleada por Sanger en la secuenciación de insulina

Question 13

Cromatografía en capa fina

Answer 13

• Fase estacionaria: placa adsorbente (sílica gel y alumina), adherida a un soporte de plástico, vidrio o aluminio
• Se pone en una solución alcóholica

Question 14

Cromatografía en columna

Answer 14

• Fase estacionaria: se empaqueta en una columna, evitando que el aire quede atrapado interrumpiendo la continuidad de las fases
• La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se eluye con una mezcla de solventes de diferentes polaridades, provocando que los componentes que se eluyen a diferentes velocidades podrán ser separados

Question 15

Solventes de diferentes polaridades en la cromatografía en columna

Answer 15

Eluyente polar desplaza las moléculas más polares rápidamente, aunque no debe ser muy polar ya que habrá poca separación

Question 16

Cromatografía de intercambio iónico

Answer 16

Aprovecha las diferencias en signo y magnitud de las cargas que tienen las moléculas como las proteínas a distintos pH

Question 17

Mecanismo básico de la cromatografía de intercambio iónico

Answer 17

Intercambio reversible de iones en solución con los grupos funcionales cargados y unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina

Question 18

Intercambio catiónico de la cromatografía de intercambio iónico

Answer 18

Resina carga negativa
- Fuerte: ácido sulfónico
- Débil: ácido carboxílico

Question 19

Intercambio aniónico de la cromatografía de intercambio iónico

Answer 19

Resina carga positiva
- Fuerte: aminas cuarternarias
- Débil: aminas secundarias o terciarias

Question 20

Cromatografía de intercambio aniónico

Answer 20

Una molécula de carga negativa se une a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al incrementar la concentración de sales

Question 21

Intercambio iónico de péptidos

Answer 21

• La separación se optimiza cambiando gradualmente el pH o la concentración de sales de la fase móvil para crear una gradiente
• Las moléculas con carga opuesta a la de la matriz migrarán mas lento que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria

Question 22

Cromatografía de exclusión molecular (filtración de gel)

Answer 22

• Fase estacionaria: material poroso inerte
• Separación del soluto según su tamaño y peso molecular
• Las moléculas pequeñas entran en los espacios dentro de la matriz y son retrasadas, mientras que las moléculas grandes pasan por fuera de la perla y atraviesan más libremente y rápidamente

Question 23

Característica falsa sobre la cromatografía de exlcusión molecular
a) Su mecanismo se basa en el tamaño en disolución
b) Las moléculas de mayor peso molecular eluyen antes
c) Una proteína cilíndrica pasaría más rápido porque su tamaño es mayor
d) Las fases estacionarias pueden afectar al orden de elución debido a los cambios de tamaño en disolución
e) Todas son correctas

Answer 23

d) Las fases estacionarias pueden afectar al orden de elución debido a los cambios de tamaño en disolución

R =
Las fases móviles pueden afectar al orden de elución debido a los cambios de tamaño en disolución

Question 24

Cromatografía de mayor especificidad y selectividad para la purificación de biomoléculas

Answer 24

Cromatografía de afinidad

Question 25

Cromatografía de afinidad

Answer 25

Se basa en la interacción específica de 2 moléculas - Antígeno/anticuerpo - Enzima/sustrato - Receptor/ligando - Una de ellas se une covalentemente a la fase estacionaria

Question 26

Condiciones que provocarían que un cambio del medio eluyente liberara a las moléculas retenidas en la fase estacionaria en una cromatografía de afinidad

Answer 26

- pH (afecta al estado de ionización de las biomoléculas) - Fuerza iónica (concentración de sales) - Polaridad (solubilidad) - Solución de las moléculas inmovilizadas

Question 27

Etiquetas terminales (purificación por afinidad)

Answer 27

- Se expresa una proteína recombinante de fusión con un péptido (etiqueta) que une con alta afinidad y especificidad a un ligando - La etiqueta se remueve con una proteasa que corta cerca de la unión entre la proteína de interés y la etiqueta

Question 28

Cromatografía líquida de alto rendimiento

Answer 28

- Líquido-líquido - Uso de bombas de alta presión para mover moléculas a través de la columna - Ideal para componentes no volátiles, azúcares, vitaminas, drogas, etc... - Se pueden realizar curvas de calibración con estándares de composición y concentración

Question 28

Cromatografía líquida de alto rendimiento

Answer 28

- Líquido-líquido - Uso de bombas de alta presión para mover moléculas a través de la columna - Ideal para componentes no volátiles, azúcares, vitaminas, drogas, etc... - Se pueden realizar curvas de calibración con estándares de composición y concentración

Question 29

Tipos de electroforesis en gel

Answer 29

- 1 dimensión (PAGE) - 2 dimensiones (2D)

Question 30

¿Qué es electroforesis?

Answer 30

Herramienta usada para aislar y purificar macromoléculas en base a su movilidad dentro de un soporte sólido en un campo eléctrico

Question 31

Geles de poliacrilamida

Answer 31

Análisis de proteínas y ácidos nucleicos

Question 32

Geles de agarosa

Answer 32

Análisis de ácidos nucleicos

Question 33

¿A partir de qué número de pares de bases ya no es posible diferenciar los elementos en una electroforesis con gel de agarosa?

Answer 33

Menos de 20 pb

Question 34

Movilidad electroforética

Answer 34

- La movilidad de la molécula depende de su peso molecular y su carga eléctrica - Las diferentes movilidades exhiben las diferentes macromoléculas las que permiten su separación

Question 35

Electrodo al que se mueven los cationes en una electroforesis a) Cátodo b) Ánodo

Answer 35

a) Cátodo

Question 36

Electrodo al que se mueven los cationes en una electroforesis a) Cátodo b) Ánodo

Answer 36

b) Ánodo

Question 37

Factores intrínsecos de la molécula en una electroforesis

Answer 37

- Carga eléctrica (grupos funcionales) - Peso molecular (átomos que lo conforman)

Question 38

Factores intrínsecos de la molécula en una electroforesis

Answer 38

- Concentración del gel - Voltaje aplicado - Tiempo de corrida - Temperatura

Question 38

Factores extrínsecos de la molécula en una electroforesis

Answer 38

- Concentración del gel - Voltaje aplicado - Tiempo de corrida - Temperatura

Question 39

Características falsas sobre la movilidad electroforética a) Los factores intrínsecos en una electroforesis NO se pueden modificar b) La carga eléctrica en los ácidos nucleicos están en las bases nitrogenadas c) Si aumenta el peso molecular, disminuye la carga eléctrica en una electroforesis d) La relación carga eléctrica/peso molecular de las proteínas es constante e) La relación carga eléctrica/peso molecular de los ácidos nucleicos no es constante f) A mayor relación carga eléctrica/peso molecular, mayor movilidad g) Si la relación carga eléctrica/peso molecular es constante, la movilidad queda en función de la carga eléctrica

Answer 39

b) La carga eléctrica en los ácidos nucleicos están en las bases nitrogenadas c) Si aumenta el peso molecular, disminuye la carga eléctrica en una electroforesis d) La relación carga eléctrica/peso molecular de las proteínas es constante e) La relación carga eléctrica/peso molecular de los ácidos nucleicos no es constante g) Si la relación carga eléctrica/peso molecular es constante, la movilidad queda en función de la carga eléctrica R = La carga eléctrica en los ácidos nucleicos están en los grupos fosfato Si aumenta el peso molecular, aumenta la carga eléctrica en una electroforesis La relación carga eléctrica/peso molecular de las proteínas NO es constante La relación carga eléctrica/peso molecular de los ácidos nucleicos es constante Si la relación carga eléctrica/peso molecular es constante, la movilidad queda en función del peso molecular