Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos

Question 1

¿Cuál es primer paso en la tecnología del ADN recombinante?

Answer 1

El aislamiento del ADN

Question 2

¿Cuáles serían las aplicaciones o usos del aislamiento del ADN?

Answer 2

• Amplificación (mediante PCR)
• Secuenciación
• Determinación de polimorfismos
• Diagnóstico de enfermedades
• Transferencia génica (para OMG, agricultura y farmaceútica)
• Obtención de proteínas recombinantes
• Terapia génica

Question 3

¿Qué significa OMG?

Answer 3

Organismos Modificados Genéticamente

Question 4

Características del ADN de células eucariotas

Answer 4

• El ADN genómico está en el núcleo
• Asociado a proteínas
• ADN mitocondrial
• Protegido por compartimientos delimitados y rodeados por membranas

Question 5

Tipo de ADN presente en procariotas principalmente, aunque también puede exisitir en las mitocondrias y cloroplastas de levaduras eucariotas

Answer 5

ADN plasmídico

Question 6

Pasos de la extracción de ADN genómico

Answer 6

1- Muestra de células
2. Añadir buffer de lisis para mantener el pH, romper las membranas, desnaturalizar y degradar proteínas
3. Precipitación de proteínas
4. Precipitación del ADN con alcohol frío y alta concentración de sal
5. Lavados
6. Resuspensión en agua libre de nucleasas
7. Cuantificación y determinación de la pureza

Question 7

¿Qué es la centrifugación de gradiente de densidad o Ficoll-Paque?

Answer 7

Es el método más común para separar los PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de los glóbulos rojos (RBC y células polimorfonucleares)

Question 8

¿Qué leucocitos son conocido en conjunto como granulocitos (polimorfonucleares)?

Answer 8

• Neutrófilos
• Eosinófilos
• Basófilos

Question 9

¿Qué leucocitos son conocido en conjunto como agranulocitos (mononucleares)?

Answer 9

• Monocitos
• Linfocitos

Question 10

¿Cuál es el orden, del menos denso al más denso, de los componentes de la sangre y del ficol, si se coloca sangre periférica en un frasco con ficol?

Answer 10

• Plasma
• Células mononucleares
• Ficoll
• Granulocitos
• Eritrocitos o RBCs

Question 11

3 componentes del buffer de lisis

Answer 11

• 50 mM de Tris-HCl (clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano)
• 1% de SDS (dodecil sulfato de sodio)
• 2 mg/ml de alguna proteasa (proteinasa K)

Question 12

¿Cuál es el pH de Tris-HCl (clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano)?

Answer 12

8

Question 13

¿Qué es el Tris-HCl (clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano)?

Answer 13

Buffer para mantener el pH en el cual del ADN se mantiene estable y con carga negativa

Question 14

¿Qué es el SDS (dodecil sulfato de sodio)?

Answer 14

Detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación de ADN; desnaturaliza las proteínas dejándolas accesibles para las proteasas

Question 15

Características verdaderas de la proteinasa K
a) Es altamente activa sobre proteínas nativas y desnaturalizantes
b) Es una glicina proteasa
c) Activa e inactiva ARNasas y ADNasas
d) Destruye proteínas que crean un enlace con el ADN
e) Incrementa la pureza del ADN al reducir la contaminación por parte de las proteínas
f) Disminuye la calidad y cantidad de ADN no degradado

Answer 15

a) Es altamente activa sobre proteínas nativas y desnaturalizantes
d) Destruye proteínas que crean un enlace con el ADN
e) Incrementa la pureza del ADN al reducir la contaminación por parte de las proteínas

R =
Es una serina proteasa
Únicamente inactiva ARNasas y ADNasas
Aumenta la calidad y cantidad de ADN no degradado

Question 16

Precipitación de proteínas

Answer 16

• Las proteínas se insolubilizan y precipitan
• Se pueden centrifugar, quedando con el precipitado, junto con los restos celulares
• En el sobrenadante se encuentra el ácido nucleico
• Usualmente se emplean las soluciones de acetona

Question 17

Precipitación del ADN

Answer 17

• Se requiere una alta concentración de sales (NaCl)
• Los iones Na+ neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
• Las moléculas de ADN se juntan en lugar de repelerse una a la otra
• Se disminuye la solubilidad del ADN en el ambiente acuoso, facilitando su precipitación al añadir el alcohol

Question 18

¿Qué es el etanol?

Answer 18

• Molécula menos polar que el agua, que justamente es miscible con ella
• El ADN no es soluble en el, por lo que al agregarse la solución de ácidos nucleicos provoca que el ADN precipita

Question 19

Características verdaderas sobre la precipitación del ADN
a) El ADN es más polar que el ARN
b) Al disminuir la temperatura, el ADN se insolubiliza aun más
c) Si se le agrega etanol al ARN, el ARN precipitaría
d) Las moléculas de ADN insolubilizado semejan a hilos blancos de una telaraña
e) Al final se obtiene una pastilla blanca y compacta en el fondo del tubo
f) Todas son correctas

Answer 19

b) Al disminuir la temperatura, el ADN se insolubiliza aun más
d) Las moléculas de ADN insolubilizado semejan a hilos blancos de una telaraña
e) Al final se obtiene una pastilla blanca y compacta en el fondo del tubo

R =
El ARN es más polar que el ADN
Si se le agrega etanol al ARN, el ARN no precipitaría

Question 20

Lavados

Answer 20

Se lavan con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el ADN

Question 21

Resuspensión del ADN

Answer 21

Se insolubiliza en agua libre de nucleasas

Question 22

Valor de la absorbancia a la que se ajusta el espectrofotómetro para calcular la concentración de ácidos nucleicos

Answer 22

260 nm

Question 23

¿Cuánto vale el coeficiente que determina la pureza de los ácidos nucleicos?

Answer 23

260/280

Question 24

Valores, basados en el coeficiente de pureza, para calificar una extracción de ADN

Answer 24

Óptima: 1.8 - 2
Aceptable: 1.6 - 1.8
Contaminación con compuestos aromáticos y proteínas: <1.6
Contaminación con ARN: >2.1

Question 25

Método más usado para la extracción de ARN

Answer 25

Método del fenol-cloroformo

Question 26

Pasos del método fenol-cloroformo

Answer 26

1. Rompe membranas, desnaturaliza proteínas y libera ácidos nucleicos de moléculas asociadas 2. La adición de más cloroformo separa las fases 3. Se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (lisopropanol) frío, el cual es menos polar que el etanol 4. Centrifugar 5. Lavar el pellet con etanol al 75% 6. Resuspender el ARN 7. Aplicar el coeficiente de pureza 260/280

Question 27

Valores, basados en el coeficiente de pureza, para calificar una extracción de ARN

Answer 27

Óptima: 2 - 2.2 Aceptable: >1.7 Contaminación con compuestos aromáticos y proteínas: <1.7

Question 28

¿Cuáles son los 2 mecanismos para la purificación del ADN luego de pasar por la cuantificación y determinación de la pureza?

Answer 28

- Cromatografía de afinidad - Electroforesis

Question 29

¿Cuál es el medio de soporte sólido de una electroforesis?

Answer 29

Gel de poliacrilamida o de agarosa

Question 30

Gel de poliacrilamida

Answer 30

Se usa para análisis de muestras de proteínas y ácidos nucleicos, pero únicamente cuando se requiera mayor resolución que la puede brindar la agarosa

Question 31

Gel de agarosa

Answer 31

Se usa para análisis de muestras de ácidos nucleicos, aunque no pueden observarse diferencias menores a 20 pb en pesos moleculares de las moléculas analizadas

Question 32

Factores intrínsecos a la partícula en una electroforesis

Answer 32

- Relación carga/masa - Peso molecular

Question 33

Factores extrínsecos a la partícula en una electroforesis

Answer 33

- Concentración de agarosa - Voltaje aplicado - Tiempo de corrida - Temperatura

Question 34

¿Qué es la agarosa?

Answer 34

- Polisacárido formado por β-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa y α-(1-3)-D-galactosa - Soluble en agua a temperaturas superiores a 65°C - Se disuelve y se pone en la cámara de electroforesis - Da forma de matriz inerte y no tóxica

Question 35

Concentración de agarosa en gel para electroforesis

Answer 35

0.5 - 4% (peso/volumen)

Question 36

¿Cuál es el enunciado correcto respecto a la movilidad en base a la concentración de agarosa? a) La movilidad aumenta al aumentar el porcentaje de agarosa b) Entre mayor concentración de agarosa, hay menor movilidad aunque su permeabilidad es mejor c) Si la concentración de agarosa es muy alta, se tendrá mejor resolución d) Todas son correctos

Answer 36

b) Entre mayor concentración de agarosa, hay menor movilidad aunque su permeabilidad es mejor R = La movilidad disminuye al aumentar el porcentaje de agarosa Si la concentración de agarosa es muy alta, se tendrá menor resolución

Question 37

Voltaje típico aplicado en una electroforesis

Answer 37

10 V/cm de gel - En geles de 10 - 15 cm = 100 V - 130 V

Question 38

¿Cuál es el enunciado correcto respecto al voltaje aplicado en una electroforesis? a) Al incrementar el voltaje, la movilidad aumenta pero no necesariamente la resolución b) Hay menor resolución a voltajes menores c) A mayor voltaje, mayor difusión lateral d) Todas son correctos

Answer 38

a) Al incrementar el voltaje, la movilidad aumenta pero no necesariamente la resolución R = Hay mejor resolución a voltajes menores A menor voltaje, mayor difusión lateral

Question 39

Tiempo de corrida en una electroforesis

Answer 39

- A mayor tiempo de corrida, mayor resolución - Se debe cuidar que no se salga la muestra del gel - Entre más tiempo, hay más separación

Question 40

Temperatura en una electroforesis

Answer 40

- Al incrementarse la temperatura, la movilidad se incrementa como si se hubiera disminuido la concentración de agarosa - Si la temperatura es muy alta, se puede fundir el gel, por lo que normalmente se mantiene lo más baja posible - Si la temperatura y la movilidad, el voltaje y el tiempo de corrida aumentan

Question 41

¿Qué sustancias se usan en el campo de la biología molecular para visualizar ácidos nucleicos en la electroforesis?

Answer 41

- Bromuro de etidio - SYBR

Question 42

Bromuro de etidio

Answer 42

- Se intercala entre las bases - Absorbe a 260 - 360 nm y emite flourescencia de color rojo o naranja a 560 nm - Detecta hasta 1 ng de dsDNA

Question 43

SYBR

Answer 43

- NO se intercala - Alternativa menos tóxica auque menos sensible (3 ng)

Question 44

Marcadores de peso molecular

Answer 44

Mezcla de ácidos nucleicos de diferente peso molecular que sirve como referencia para el análisis cualitativo de las muestras analizadas - Sintéticos - ADN de fagos o plásmidos digeridos por enzimas de restricción (endonucleasas)