Tema 5. Uso de proteínas fluorescentes para medir localización y función de otras proteínas Flashcards
¿Qué es la GFP (proteína verde fluorescente)?
El descubrimiento de la GFP fue motivo para la otorgación del premio Nobel de Química en 2.008. Esta proteína fue descubierta durante el estudio del sistema de protección de la medusa Aequorea victoria:
a) Ante una señal de estrés, se produce un aumento intracelular de calcio
b) El calcio se une a un grupo prostético llamado coelenteracina presente en la proteína Aequorina. Esta unión produce un cambio de conformación en la proteína, que provoca la emisión de luz a 480 nm
c) Esta luz es absorbida por otra proteína, la GFP, que se excita y emite fluorescencia a 515 nm como máximo
Su descubrimiento supuso una evolución en el campo de la bioquímica y biología celular. Antes, para detectar una proteína, las células y tejidos debían ser tejidos y luego marcados mediante técnicas como inmunofluorescencia. Ahora, introducimos en un plásmido un híbrido entre una proteína de interés y la GFP fusionada, para que se exprese en la células. Al fusionar la GFP a una proteína de interés, si excitamos con un láser a la longitud de onda adecuada, podremos verla
Conclusión: la GFP nos sirve como una señal para ver la localización y movimiento de las proteínas in vivo¿
¿Cuál es la estructura de la GFP?
La GFP es una proteína monomérica (formada por 238 aa y con un MW de 29,6 kDa). Su estructura terciaria es un barril veta constituido por:
a) 11 cadenas beta
b) Una hélice alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud y contiene los 3 aa formadores del grupo cromóforo
El grupo cromóforo está formado por 3 aa responsables de la emisión de fluorescencia:
a) Ser 65
b) Tyr 66
c) Gly 67
¿Cómo es la reacción de ciclación en la GFP?
En un primer momento, los aa están desplegados. Cuando se excita a 480 nm con un láser se produce una ciclación entre esos 3 aa que da lugar a la formación de un anillo imidazol. Después se produce una deshidratación para estabilizar el anillo. Por último, se da una oxidación, que da lugar a la emisión de fluorescencia a 515 nm.
Esto se debe a que se remueven los electrones de la última capa, los cuales saltan y al volver a las capas basales emiten luz
Es muy importante la oxidación final, dado que si en mi cultivo no hay suficiente O2, no se va a producir la fluorescencia
¿Cómo se sintetizan nuevas proteínas fluorescentes?
Tras el descubrimiento de la GFP, los investigadores comenzaron a modificar los aa que constituían el grupo cromóforo de la GFP para ver si absorbían a otras longitudes de onda, dando como resultado nuevas proteínas fluorescentes que presentaban distintas longitudes de onda de excitación y emisión. Algunos ejemplos:
a) Cambiando la Tyr66 por His aparece fluorescencia azul
b) Cambiando la Tyr66 por Trp y la Ser65 por Thr aparece fluorescencia cian
c) Cambiando la Ser65 por Gly aparece fluorescencia amarilla
Además del cambio de aa, también debían tener en cuenta las distancias entre los residuos, la estabilidad del barril y otras propiedades fisicoquímicas del entorno que rodea la proteína (por ejemplo, en el caso de la proteína que emite fluorescencia amarilla, la modificación permite la entrada del residuo en posición 203 y ello es suficiente para la emisión de fluorescencia amarilla)
Posteriormente, comenzaron a desarrollarse por mutagénesis al azar otras proteínas dando lugar a una paleta completa de colores. Hasta entonces la información obtenida en experimentos in vivo era estática (se fijaban las células y se perdía la dimensión temporal), por lo que esto permitió estudiar las células en el tiempo
Uno de los inconvenientes al que tuvieron que enfrentarse, era que la mayoría de las proteínas, tras expresarse, formaban oligómeros (dímeros, tetrámeros…). Esto podría dar lugar a interacciones indeseadas y malos resultados
Como solución, como conocemos la estructura 3D de la GFP, podemos ver qué aa son los responsables de la formación de dímeros y modificarlos. Mutando la Ala206 por Lys la GFP queda monomérica
Las distintas proteínas fluorescentes difieren en su fotoestabilidad, intensidad de emisión, espectro, formación de monómeros… Características que deben tenerse en cuenta a la hora de realizar los experimentos
Se han buscado otras proteínas fluorescentes en otros organismos. Por ejemplo, la RFP, de fluorescencia roja, se encontró en un dicosoma, pero esta proteína formaba tetrámeros, por lo que también era necesario monomerizarla. Después de realizar 33 mutaciones se pudo convertir en monomérica y que siga siendo fluorescente
¿Cuáles son las propiedades de las proteínas fluorescentes?
Actualmente, gracias a ingeniería de proteínas, tenemos gran cantidad de proteínas fluorescentes, todas ellas dando diferentes colores, lo que nos permite usar hasta 4 ó 5 sondas simultáneamente (el microscopio no es capaz de detectar más sondas a la vez)
Según el experimento que se vaya a realizar, se deben elegir unos fluorocromos u otros, dependiendo de sus espectros de absorción y emisión. Se puede hacer in vivo y se puede registrar el movimiento a nivel de los compartimentos subcelulares simultáneamente. De acuerdo a esto:
En los experimentos de colocalización:
a) En ellos se estudia la coincidencia de los diferentes marcadores y, por ello, de moléculas variadas, en una región concreta de la célula o del tejido estudiados
b) Necesitamos que los espectros de los fluorocromos empleados estén lo más separados posible
En los experimentos de FRET (transferencia de energía de resonancia de moléculas fluorescentes):
a) Permite determinar si dos moléculas están interaccionando en una localización subcelular concreta
b) Se utilizan fluorocromos cuyos espectros estén solapados
Hay que tener cuidado ya que algunas proteínas fluorescentes son muy grandes (algunas hasta 25 kDa) y pueden estropear la función de nuestra proteína problema si las fusionamos
Es necesario tener en cuenta la fotoestabilidad del fluorocromo. El fotobleaching es la descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos. Es un fenómeno por el que, tras continuas excitaciones la sonda disminuye su fluorescencia: con la misma cantidad de proteínas fluorescentes cada vez vamos teniendo menos fluorescencia. Está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempo durante el cual estamos excitando la muestra. Este evento es muy dependiente de la estructura química de la proteína: hay unas que resisten mejor y otras que no. Si lo soportan mejor se dicen que son más fotoestables (con el tiempo la intensidad de fluorescencia casi se mantiene constante)
Las proteínas fluorescentes tienen distintas propiedades de excitación, emisión, brillo (más señal o menos), fotoestabilidad… Más que brillo, en la actualidad es más importante la fotoestabilidad y la oligomerización (deben ser monómeros, si no varían mucho los datos, pudiendo dimerizar incluso proteínas fluorescentes de diferentes colores al tener una estructura externa de barril idéntica). Todavía no son monoméricas todas, aun se siguen trabajando para ir mejorando. El mejor sistema será aquel que no interviene en la función de la proteína problema, que no es considerada tóxica para la célula, que identifica bien la proteína, que es fácil de sintetizar…
¿Cómo se llevan a cabo los procesos de colocalización (multi-color imaging)?
Hay dos tipos de experimentos que podemos hacer con estas sondas: colocalización y Transferencia de energía de resonancia (FRET). Como los mecanismos son distintos, las sondas que vamos a elegir son distintas y se eligen con criterios diferentes
En los ensayos de colocalización queremos fusionar distintas proteínas problema con distintas proteínas fluorescentes para localizarlas en el interior celular, estudiar posibles interacciones entre ellas… para ello haremos uso de un microscopio confocal. Habrá situaciones en la célula donde podamos encontrarnos, por ejemplo, una proteína en el núcleo y otra en la membrana, u otras donde se encuentren en el mismo compartimento interaccionando
Al hacer el ensayo, debemos seleccionar una región de excitación (un rango de longitudes de onda con la que excitar cada sonda) y una región de emisión (un rango de longitudes de onda para determinar la intensidad de emisión de cada sonda)
A la hora de seleccionar las sondas que vamos a usar en el experimento de colocalización, lo más importante es que los espectros de emisión de fluorescencia de las distintas sondas deben estar completamente separados (no debe existir fluorescencia cruzada entre ellos)
Motivo: necesitamos identificar cada proteína problema con un color (con una sonda fluorescente) y no debe haber ninguna interferencia ni solapamiento entre las señales de las sondas fluorescentes de distintas proteínas problema, ya que sino aparecerían contaminaciones y no sabríamos identificar la localización de las proteínas problema
¿En esta imagen, en la que tenemos el espectro de excitación y emisión de 3 sondas fluorescentes (página 6), qué dos sondas utilizaríamos para un ensayo de colocalización?
En este caso, en la ventana 2 se esta excitando a mKusabira Orange y un poco a mPlum y aunque corra la ventana hacia la derecha siempre lo estaría excitando. Con lo cual, una posibilidad sería tener ese solapamiento en cuenta en mi experimento. Observaría una señal residual de mPlum. Lo ideal sería que no existiese solapamiento
Otra posible solución, sería usar solo dos láseres, uno que excitase a mCerulean y otro que excitase a los dos restantes, pero para ello tendría que aumentar la segunda ventana de excitación para poder captar la emisión de mKusabira Orange y mPlum
A la izquierda tenemos los espectros de absorción de 3 sondas, junto con 3 ventanas que son los rangos de longitudes de onda con los que excitarlas. A la hora de seleccionar estos rangos, normalmente se eligen longitudes de onda alrededor de la longitud de onda donde más energía absorbe la onda (el pico más alto de intensidad). Vemos que la mCerulean absorbe a unos 430 nm, el mKusabira a unos 500 y el mPlum a 600
A la derecha tenemos los espectros de emisión de las 3 sondas, junto con 3 ventanas que son los rangos de longitudes de onda que vamos a captar. A la hora de seleccionar estos rangos, normalmente se eligen longitudes de onda alrededor de la longitud de onda donde más fluorecen. mCerulean emite a unos 500 nm, mKusabira a 560 y mPlum a 650
Lo que más interesa es el espectro de emisión. Si usáramos el par mCerulean y mKusabira, cuando recogemos la intensidad mCerulean a 500 nm no hay ningún problema, pero cuando recogemos la intensidad de mKusabira a 560 nm tenemos un problema: de toda la fluorescencia que recogemos a 560 nm, un % es fluorescencia de mCerulean, porque sus espectros solapan (mCerulean supone un 10% aproximadamente de la fluorescencia total recogida en esa longitud de onda). Si cuando intentamos detectar a mKusabira estamos también detectando a mCerulean, al intentar localizar a la proteína unida a mKusabira estaríamos viendo fluorescencia no solo en las partes de la célula donde está esa proteína, sino también en las zonas donde está la proteína unida a mCerulean, por lo que no podríamos determinar la localización de nuestras proteínas (no sabríamos si lo que estamos viendo es una proteína u otra)
Si cogiéramos el par mKusabira y mPlum, en principio no habría ningún problema (detectamos mKusabira a 560 nm y mPlum a 650 nm), habría un poco de solapamiento a 650 nm pero es mínimo (recogemos un poco de señal de mKusabira a 650 nm, pero no es casi nada). Sin embargo, sus espectros de excitación sí que están solapados. Esto es un problema si lo que queremos en un determinado momento es excitar únicamente a una de las proteínas: si intentamos excitar solamente mKusabira con un láser de 500 nm, también estaríamos excitando a mPlum, y quizás en un experimento determinado no nos interesa. Veríamos una señal residual
El objetivo final es que haya el menor número posible de solapamientos. Para ello cojo una ventana donde solamente recoja la fluorescencia de una sola sonda, para que la emisión de una no interfiera con la otra, pues entonces estaríamos recogiendo una señal errónea. Por ello, el mejor par es mCerulean y mPlum: mCerulean se excita a 430 nm y emite a 500 nm, y mPlum se excita a 600 nm y emite a 650 nm. Sus espectros no solapan, así que toda la intensidad de fluorescencia que recojamos a 500 nm será únicamente de mCerulean, y podremos localizarla perfectamente en el interior celular, mientras que todo lo recogido a 650 nm será de mPlum, y también podremos localizarla
Si nos vemos obligados a coger dos sondas coincidentes, tenemos que hacer una curva de calibrado para ver, a una determinada longitud de onda, qué porcentaje de intensidad captada pertenece a una sonda y qué porcentaje a la otra
Para poder recoger la emisión, los espectros deben estar bien separados y debo limitar el rango de fluorescencia recogida en los detectores o fotomultiplicadores. Si, aun así, los espectros de emisión se solapan y no existe posibilidad de realizar una correcta separación, se deberá realizar un blanco con el fluorocromo que me interfiere para saber qué proporción de la señal procede de excitar el fluorocromo que no quiero detectar (estaríamos hablando en este caso del solapamiento que se produce en los espectros de emisión de mCerulean y mKusabira Orange)
¿Qué es FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)?
La transferencia de energía es la capacidad que tiene dos sondas fluorescentes de que el donador emita fluorescencia y el aceptor se excite con ella, la absorba y emita a otra longitud de onda
En estos ensayos el espectro de emisión del donador tiene que solaparse con el espectro de absorción del aceptor. Esto nos proporciona la ventaja de que solo requerimos un láser de excitación: excitamos la primera, y la emisión de esta sirve como láser para excitar la segunda (hay que evitar que el láser excite al aceptor)
La microscopía confocal o de fluorescencia, tiene un determinado nivel de resolución que no permite resolver menos de 200 nm (en el eje X-Y) y menos de 500 nm en el eje Z. Las proteínas tienen tamaños de Ä (1 nm = 10 Ä), por tanto, cuando yo visualizo a través de esos microscopios las proteínas, estaré viendo acúmulos, muchas moléculas de proteína. Esto permite realizar seguimientos a nivel de proteína única. La FRET ha permitido un mayor acercamiento al estudio de movilización de proteínas
Si las dos proteínas están lejos, detectaremos un gran pico de emisión del donador. Si las proteínas están lo suficientemente cerca, ese pico disminuirá y aparecerá otro más grande a la derecha, que es la emisión del aceptor: El aceptor ha absorbido parte de la intensidad de emisión del donador y este a su vez emite fluorescencia a una longitud aún mayor
La eficacia del proceso (E) se define como el % de moléculas donadoras excitadas que son desactivadas por FRET. ¿De qué depende esta eficacia? Hay muchos factores que influyen en la transferencia de energía, pero existen unas condiciones indispensables para que se dé transferencia:
1) El donador y el aceptor deben estar en estrecha proximidad el uno con el otro, típicamente entre 10-100 Ä. Cuanto más cerca esté una molécula de otra, más eficaz será transferencia de energía
2) El espectro de absorción o excitación del aceptor debe solaparse con el de emisión del donador. El grado en que se solapan se denomina el solapamiento espectral integral (J). Cuanto mayor sea el solapamiento mejor será la transferencia de energía.
3) La orientación del dipolo del donador y del aceptor debe estar aproximadamente en una orientación paralela
En resumen, la eficacia del proceso es mayor cuanto mayor sea el solapamiento integral y cuanto menor sea distancia entre las moléculas. A mayor solapamiento, mayor excitación de la segunda sonda. A menor solapamiento, algunos fotones fluorecerán y otros no. Esto se expresa en la siguiente ecuación:
E = (Ro^(6))/(Ro^(6)+r^(6))
Donde, E es la eficacia, r la distancia y Ro la distancia a la cual se da el 50% de transferencia de energía, que depende de las propiedades espectrales de las moléculas. Conociendo Ro y E, podemos determinar la distancia en A a la que nuestras proteínas marcadas se encuentran. Ro depende de muchos parámetros: índice de refracción del medio, orientación de los dipolos, rendimiento cuántico de las sondas…
Hay que llevar cuidado, ya que, al igual que e colocalización, si los espectros de emisión del donador y aceptor se solapan, cuando detectemos la emisión de una proteína detectaremos también la de la otra. Es por ello por lo que hay que elegir dos proteínas que solapen el espectro de emisión de uno con el de excitación del otro, pero que no solapen los dos espectros de emisión. Los espectros de emisión deben estar lo más separados posibles uno del otro
Ejemplo 1 de FRET (página 10): ¿se solapan el espectro de emisión del donador (CFP) con el espectro de absorción del aceptor (RFP)?
Sí, se solapan aproximadamente, entre el rango de 450-600 nm, por tanto, podríamos realizar FRET
Ejemplo 1 de FRET (página 10): ¿qué laser debe usarse para excitar?
Tengo que excitar al fluorocromo CFP. A primera vista escogeríamos el láser de 430 nm. Pero si observamos bien el espectro de excitación, vemos que se solapa un poco con el de la otra sonda. Por eso en lugar del láser de 430 nm, me voy a un láser de 400 nm o 395 que lo seguiría excitando y, demás, me aseguraría de que no estoy excitando a la otra sonda
Ejemplo 1 de FRET (página 10): en cuanto a la emisión, ¿a qué longitudes de onda debo poner las ventanas para recoger la emisión?
Necesito registrar dos espectros de emisión (los dos azules):
a) CFP: 450-530 nm, porque de este forma evito que se solape con el de RFP. Esta sonda está en el citoplasma
b) RFP: 630-700 nm evitando la cola de emisión del CFP. Está en la membrana
Ejemplo 1 de FRET (página 10): ahora ya tengo mi experimento definido y puedo aplicarlo al estudio de proteínas. ¿Cómo?
Al realizar una medida de fluorescencia con cada fluorocromo por separado, se observa que, en reposo, las proteínas A y B marcadas con CFP y RFP respectivamente: CFP (proteína A) aparece en el citoplasma; RFP (proteína B) aparece en la membrana
Ejemplo 1 de FRET (página 10): ahora realizo el mismo marcaje, pero solo uso el láser para CFP, detectando con el microscopio los dos marcajes a la vez:
(I) ¿Qué ocurre en una situación de reposo, cuando no he estimulado a la célula?
(II) Imaginemos que ahora estimulo a la célula con un determinado compuesto, como His, que provoca que la proteína del citoplasma se mueva al núcleo, ¿qué señal observaría?
(I) Solo observo fluorescencia del CFP, pero no del RFP
(II) a) Si ambas proteínas (la marcada con CFP y la marcada con RFP), están a una distancia de 10-100 Ä, cuando excite con el láser de 395 nm, observaré como la fluorescencia de CFP disminuye a la misma vez que la de RFP aumenta con el paso del tiempo, debido a que se ha producido FRET: la energía emitida por la proteína A, ha sido absorbida por el fluorocromo de B (imaginemos que, por ejemplo, A se ha ido a la membrana). En este caso el gráfico sería el siguiente (página 11, gráfico)
b) Si las proteínas no están lo suficientemente cerca, no se va a producir FRET, y a lo largo del tiempo observaré el siguiente gráfico, en el que solo hay fluorescencia de CFP ya que su energía de emisión no se transfiere a RFP (página 12, gráfico)
Ejemplo 2 de FRET (página 12): suponemos que tengo 2 proteínas, una marcada con Sapphire y la otra con mOrange. He mirado cada espectro por separado y observo que Sapphire la tengo en la membrana y mOrange la tengo en el núcleo. ¿Cómo estudiaríamos si existe interacción entre ellas cuando añado un determinado estímulo?
Para poder hacer el experimento FRET, he de asegurarme que el espectro de emisión del donador (Sapphire) solapa con el de absorbancia del aceptor (Orange). En este caso, si se solapan (entre 475 a 565 nm aproximadamente), puedo hacer FRET
Ejemplo 2 de FRET (página 12): suponemos que tengo 2 proteínas, una marcada con Sapphire y la otra con mOrange. He mirado cada espectro por separado y observo que Sapphire la tengo en la membrana y mOrange la tengo en el núcleo. ¿Qué láser coy a emplear?
Empleo un láser que excite a Sapphire. Por ejemplo, un láser de 400 nm
Ejemplo 2 de FRET (página 12): suponemos que tengo 2 proteínas, una marcada con Sapphire y la otra con mOrange. He mirado cada espectro por separado y observo que Sapphire la tengo en la membrana y mOrange la tengo en el núcleo. ¿Cuáles son los límites de las ventanas de emisión?
a) Para detectar Sapphire: 512-526 nm
b) Para detectar mOrange: dos opciones
1. Recoger entre 650-700 nm (poca señal)
2. Recoger entre 575-640 nm -> en este caso, se detectaría señal residual de la emisión de Sapphire. ¿Cómo lo soluciono? Realizo un blanco únicamente detectando la emisión de Sapphire, para posteriormente corregirlo y restarlo en las fórmulas de corrección
