Aula 10 e 11 - Crescimento bacteriano e fatores que afetam o crescimento bacteriano

Question 1

O que é o crescimento microbiano?

Answer 1

Pode ser considerado o crescimento dentro da própria célula ou o crescimento de uma população de microrganismos. É este último tópico que vai ser abordado nesta aula.
O crescimento bacteriano "batch" (não limitado) ocorre dentro de um tubo fechado. Um outro tipo de crescimento é a cultura contínua.
Coeficiente de cagaço: Fator de segurança

Question 2

Destingue exatidão de precisão

Answer 2

De relembrar que a exatidão é quando temos um resultado perto do resultado teórico/real e que precisão é quando os resultados de vários ensaios se encontram perto uns dos outros. Deste modo, uma experiência pode ser precisa, mas não exata ou vice-versa.

Question 3

Diz alguns métodos de cálculo cientíifico e técnico

Answer 3

Existem vários métodos de calculo científico e técnico. Temos o cálculo a olho (ballparking), permite-nos obter um valor aproximado, o cálculo preciso e exato e o coeficiente de cagaço, é a margem de erro (segurança), ou seja, é o excesso que damos para caso ocorra um problema, este valor será maior quanto mais perigoso é o falhanço.

Question 4

Métodos de quantificação de microrganismos.

Answer 4

Quanto a métodos de quantificação de microrganismos, podemos usar contagem em placas de Petri, tubos de ensaio, citometria com hemocitómetro e citometria de fluxo. A escolha do método vai depender do tipo de células que estamos a quantificar (células totais, células vivas, células com características diferenciadoras).

Question 5

Como funciona o hemocitómetro?

Answer 5

No método do hemocitómetro temos um carregamento de amostra liquido na camara de contagem, que depois é tapada com uma lamela de vidro (lamela cara pois tem uma espessura muito
exata). Quando visto de cima temos uma grelha e contando as células num quadrado, conseguimos quantificar as células existentes na amostra. Neste método podemos usar corantes para que apenas consigamos ver as células vivas.

Question 6

Quais são os dois métodos de contagem de células viváveis com placas de Petri.

Answer 6

-Método de espalhamento dos microrganismos sobre meio de agar sólido numa placa de Petri ("spread plate method").
-Método de suspensão dos microrganismos em meio de agar liquefeito com posterior colocação na placa de Petri antes do meio solidificar (“pour-plate method”). Na fase de incubação, os microrganismos não vão estar apenas à superfície, mas sim espalhados por todo o meio.

Question 7

Métodos de contagens indiretas de crescimento microbiano:

Answer 7

O método de espectrofotómetro é um método indireto de contagem através da medição da densidade ótica ou da turbidez, em que quantos mais organismo existem no meio, vamos ter menor passagem de luz e, por isso, mais absorvância. Quando temos poucos organismos temos uma relação linear, mas a partir de uma certa concentração esta deixa de ser linear (temos de fazer uma diluição, para ver se baixa proporcionalmente). O comprimento de onda usado para a deteção vai depender do tamanho dos organismos (maior organismo – maior comprimento de onda). Comprimentos de onda diferentes para o mesmo organismo vão dar valores diferentes, sendo que cada microrganismo tem o seu comprimento de onda perfeito para medições.

Question 8

Crescimento de células em recipiente fechado. Explica as 4 fases

Answer 8

No crescimento em meios fechados, as células vão usando os nutrientes do meio e deitam os residuos para o mesmo, pelo que o meio deixa de ser tão bom, podendo mesmo se tornar tóxico. Deste modo, as células têm 4 fases:
* Lag phase: é a fase de adaptação das células ao meio
* Exponencial phase (log): as células crescem o máximo que conseguem
* Stationary phase: temos uma acumulação de poluição e começa a haver uma escassez de alimento, passamos a ter um crescimento críptico (morte e crescimento é quase igual), pelo que temos uma constante do número de células
* Death phase: ocorrem danos irreversiveis nas células, pode haver a formação de esporos ou a morte das células de forma exponencial

Question 9

O que entendes por fissão binária.

Answer 9

Durante a replicação de células por fissão binária (Ex: E.coli), temos cada célula a dar origem a duas, pelo que, em condições ótimas, o crescimento da população é exponencial e definida por: Nt=N0x2n.

Question 10

Explica unidades do crescimento batch.

Answer 10

N = número de microrganismos por volume (concentration of cells) Unidades: células/ml ou u.f.c./ml
K = taxa de crescimento específica (“specific growth rate”)
g=tempo de geração (“doubling time”) → tempo que uma população demora para passar a ter o dobro do número de microrganismos Unidades: minutos ou horas
H= número de gerações por hora→ inverso do tempo de geração (g) → Unidades: minutos-1 ou horas-1

Question 11

Porque é que os gráficos de crescimento podem ser exponenciais ou retas?

Answer 11

Os gráficos de crescimento bacteriano são exponenciais, para facilitar a visualização e o uso, usamos o logaritmo para obtermos uma reta.

Question 12

Diz exemplos de tempos de geração

Answer 12

As bacterias normalmente têm um tempo de geração mais rápidas que organismos eucariotas, uma vez que o tenpo de geração normalmente aumenta com a complexidade do organismo. A E.coli demora 40min a duplicar o DNA, mas ocorrem várias vezes ao mesmo tempo, pelo que a gestação é de apenas 17min.

Question 13

Diz 4 equações da produtividade celular.

Answer 13

Y= (massa final de células em g/L – massa inicial de células em g/L) / (nutriente limitante inicial em g/L - nutriente limitante final em g/L)
Ym= (massa final de células em g/L – massa inicial de células em g/L) (nutriente limitante inicial em moles/L – nutriente limitante final em moles/L)
YATP= (massa final de células em g/L – massa inicial de células em g/L) (quantidade inicial e gerada de ATP em moles/L - quantidade final de ATP em moles/L)
YATP=(massa final de células em g/L – massa inicial de células em g/L) (quantidade gerada de ATP em moles/1.)

Question 14

O que é um quimiostato? E um tubidoestato?

Answer 14

Um quimiostato é um frasco em que entra nutrientes esteries no frasco, por um tubo e e saem microrganismos e nutriente mais gasto por outro tubo, mantendo-se assim um volume constante. Neste tipo de sistemas há sempre um nutriente que está em concentração limitante.
Outro dispositivo é o tubidoestato que é, basicamente, um quimioestato com um sensor. O sensor permite a contagem de células que saem, e dependendo deste vai fechar ou abrir a torneira que controla a entrada de meio. Este sensor é importante em situações limite, como por exemplo a evitar o washout.

Question 15

Y ATP comum?

Answer 15

yATP=10,5 —> permite calcular quantas moles de ATP são produzidas por mole de glucose utilizada (divide-se por 10,5)

Answer 16

—MRT = Tempo médio de residência (“Mean residence time”) –> Tempo médio que o microrganismo vai permanecer no fermentador
—N = Taxa de produção de células através do crescimento (“Rate of production of cells through growth”)
—x= Taxa de perda de células através do transbordo (“Rate of loss of cells through overflow”)
—D= Taxa de diluição (“Dilution rate”)
—F= Taxa de fluxo (“Flow rate”)Se o fluxo for aumentado em demasia, as células não permanecem tempo suficiente no fermentador para se multiplicarem, pelo que o recipiente acaba por ficar sem células no seu interior.
—cr= Concentração no reservatório (“Concentration in reservoir”)
—c= Concentração no fermentador (“Concentration in growth chamber”)

Question 17

Relaciona concentração, fluxo e diluição.

Answer 17

Durante o crescimento em quimioestato, temos que quanto menor a diluição, menor o fluxo e, por isso, menor a concentraçãi de bacterias, e temos baixo doubling time. Quando a taxa de diluição é muito elevada, temos uma descida do número de células, pois o fluxo é muito grande e as células não têm tempo de se dividir antes de saírem. Isto leva o fementador a ficar vazio (washout). Para concentrações intremédias vamso ter uma concnetraçõa constante de bacterias. No entanto, temos que o doubling time diminui com a diluição devido a menos nutriente disponível?.

Question 18

O crescimento de microrganismos em cultura continua é…

Answer 18

…um crescimento em sistema aberto, com adição continua de nutrientes e remoção continua de desperdícios. Este método permite manter as células em crescimento exponencial, durante longos períodos de tempo.

Question 19

Qual a importância do crescimento em cultura continua?

Answer 19

Deste modo, crescimento de cultura continua permite a obtenção constante de células em fase exponencial de crescimento, crescendo a uma taxa conhecida, o estudo do crescimento a concentrações baixas de nutrientes (próximas das encontradas na natureza) e o estudo de interações de micróbios em condições semelhantes às encontradas em ambientes aquáticos. É ainda um método usado em microbiologia industrial.

Question 20

O que entendes por Quorum Sensing

Answer 20

Quorim sensing é um mecanismo importante para as bacteriaas, em que elas sentem as outras bacterias que existem ao seu redor. Para isto, as bacterias produzem um composto que tem livre transito (entrada e saída) da membrana. Um bactéria que mal entre no corpo produza uma toxina, vai ser detetada e eliminada rapidamente. No entanto, se a bactéria só libertar a toxina quando já existem mais bacterias iguais a si, vão ter um maior tiptuulo de infeção (algumas bacterias so são ativadas quando há outras a fazerem o memso processo). Deste modo, pode se dizer que quórum sensing é a comunicação e cooperação entre bacterias, envolvendo a secreção e deteção de sinais químicos.

Question 21

Qual a importância do AHL?

Answer 21

O composto produzido, AHL, tanto pode passar de fora para dentro, como de dentro para fora da célula. Quando a concentração extracelular de AHL aumenta até um determinado nível, como resultado da sua excreção por outras células, este composto começa a entrar para o interior das células, onde a sua concentração é menor. Então, é induzida a expressão de genes e a síntese proteica (de quorum-specific proteins) - a bactéria começa assim a sintetizar toxinas.

Question 22

Existem vários fatores que afetam o crescimento bacteriano. Explica relativamente à concentração de nutrientes, temperatura e oxigénio.

Answer 22

• concentração de nutrientes no meio: aumenta com o aumento do nutriente
• temperatura: Para cada bactéria existe uma temperatura máxima e mínima para a sobrevivência e ainda uma temperatura otima
• oxigénio: dependendo do uso de oxigénio para o crescimento, vamos ter diferentes posicionamentos de bacterias em tubos. A razão para diferentes sensibilidades ao oxigénio deve-se a sua facilidade de ser reduzido a produtos tóxicos, que necessitam de enzimas especificas para reverter o processo.

Question 23

Existem vários fatores que afetam o crescimento bacteriano. Explica relativamente à atividade da água.

Answer 23

• atividade de água: valor vai de 0 a 1, vai depender do organismo ser osmotolerante (usam soluotos compatíveis para aumentar pressão osmótica interna) ou halofilico (necessitam de altas concentrações de NaCl para crescerem) ou não. Lembrando que menor atividade da água leva a um maior tempo de conservação de alimentos, por diminuição bacteriana. As células com capacidade de regular a osmolaridade usam solutos compatíveis para esta regulação (ex: K+, açucares, glicerol, aminoácidos,..)

Question 24

Existem vários fatores que afetam o crescimento bacteriano. Explica relativamente ao pH, pressão e radiação.

Answer 24

• pH: cada bactéria tem o seu intrevalo de pHs que consegue sobreviver
• pressão: temos organismo barotolerantes (são afetados negativamente por pressões altas, mas não gravemente) e barofílicos (necessitaam de pressões altas para crescer, ou crescem mais rapidamente)
• Radiação: há bacterias que sobrevivem a radiações e outras que não

Question 25

Como podemos fazer conservação de bactérias?

Answer 25

-frio
-desidratação
-agentes osmóticos
-conservantes químicos

Question 26

Como podemos fazer esterilização?

Answer 26

- Calor
- Seco
- Húmido: <100°C e pasteurização (high temperature short-term-HTST) 72°C/15 segundos; ultrahigh-temperature (UHT) 140-150°C/1-3 seg
A 100°C: ebulição; vapor
>100°C (autoclavagem)
* Radiações (gama, raios X, UV)
* Filtração
* Agentes químicos (e.g. óxido de etileno, aldeidos)