1. Histologia I Jej Metody Badawcze

Question 1

Tkanki składają się z

Answer 1

dwóch wzajemnie oddziałujących ze sobą elementów: komórek i macierzy pozakomórkowej (ECM, extracellular matrix).

Question 2

Macierz składa się z i funkcje

Answer 2

wielu ro- dzajów makrocząsteczek, z których większość tworzy zło- żone struktury takie jak włókienka kolagenowe. Macierz stanowi wsparcie dla komórek i zawiera płyn, za pośred- nictwem którego są do nich dostarczane składniki odżyw- cze i odbierane produkty przemiany materii lub substancje wydzielane przez te komórki. Komórki lokalnie wytwarza- ją składniki macierzy, podlegając z kolei silnym wpływom cząsteczek substancji pozakomórkowej. Wiele składników macierzy wiąże się ze swoistymi receptorami na powierzch- ni komórek, które poprzez błonę komórkową łączą się ze strukturalnymi składnikami wnętrza komórki i tworzą kon- tinuum zapewniające właściwe funkcjonowanie zarówno komórek, jak i otaczającej je macierzy.

Question 3

Idealny preparat mikroskopowy

Answer 3

jest utrwalony w spo- sób, który pozwala tkance umieszczonej na szkiełku zacho- wać te same cechy strukturalne, które miała w organizmie. Często jest to jednak niewykonalne, ponieważ procedu- ra przygotowania preparatu może prowadzić do usunięcia z niego komórkowych lipidów i niewielkiego zniekształce- nia struktury komórek.

Question 4

Właściwości utrwalaczu

Answer 4

właści-
wości stabilizujące lub sieciujące

utrwalacz musi w pełni przeniknąć przez pobrane tkanki. W celu ułatwienia penetracji utrwalacza wycinki tkanki lub narządu tnie się przed utrwalaniem na małe fragmenty. Aby lepiej zachować cechy komórek w dużych narządach, utrwalacze są często wprowadzane do naczyń krwionośnych, co umożliwia szyb- kie i kompletne utrwalenie metodą perfuzji naczyniowej.

Question 5

Etapy przygotowania tkanki

Answer 5

Utrwalanie – małe kawałki tkanki umieszczane są w roztwo- rach związków chemicznych, które sieciują białka i inakty- wują enzymy degradujące, co umożliwia zachowanie struk- tury komórek i tkanek.
■ Odwadnianie – tkanka przeprowadzana jest przez szereg roztworów alkoholu o rosnącym stężeniu aż do blisko 100% alkoholu, co usuwa z niej całkowicie wodę.
■ Prześwietlanie – alkohol jest usuwany za pomocą rozpusz- czalników organicznych, które mają właściwość mieszania się zarówno z alkoholem, jak i z parafiną.
■ Przepajanie – tkanka umieszczana jest w roztopionej para- finie aż do czasu całkowitego przepojenia tkanki.
■ Zatapianie – przesycone parafiną tkanki umieszczane są w niewielkich formach, zalewane roztopioną parafiną i po- zostawione do stwardnienia.
■ Trymowanie – uzyskane bloczki parafinowe są wstępnie przycinane w celu uwidocznienia tkanki przeznaczonej do krojenia za pomocą mikrotomu.

Question 6

Grubość skrawka parafinowego

Answer 6

3–10 μm

Question 7

Barwniki zasadowe

Answer 7

Błękit toluidyny
Błękit alcjanowy
Błękit metylenowy
Hematoksyliną

Question 8

Co barwią barwniki zasadowe

Answer 8

Kwasy nukleinowe
Glikozaminoglikany

Question 9

Barwniki kwasochłonne

Answer 9

Eozyna, oranż G, fuksyna kwaśna

Question 10

Co wybarwiają barwniki kwasowe

Answer 10

Mitochondria, ziarnistości wydzielnicze, kolagen

Question 11

Barwienie HE

Answer 11

Hematoksyliną - DNA - ciemnoniebieski b purpurowo

Eozyna- barwnik kontrastowy - reszta struktur cytoplazmatycznych na różowo

Question 12

Reakcja PAS

Answer 12

Reakcja kwas nadjodowy–odczynnik Schiffa, wykrywanie węglowodanów - fiolet / purpura

Question 13

Reakcja feuglena

Answer 13

Zmodyfikowana pas, DNA

Question 14

Barwienie lipidów

Answer 14

Czerń sudanowa

Question 15

Impregnacja metalami

Answer 15

No. Solami srebra - niektóre włókna macierzy pozakomórkowej

Question 16

Części optyczne mikroskopu

Answer 16

kondensor, który skupia światło na badanym obiekcie,

obiektyw, którego soczewka powiększa i rzutuje obraz obiektu w kierunku obserwatora,

okular (albo soczewka okularowa), który dodatkowo powiększa obraz i rzutuje go na siatkówkę obserwatora lub układ elementów światłoczułych

Question 17

Całkowite powiększenie mikroskopu świetl- nego otrzymuje się,

Answer 17

mnożąc powiększenie soczewek obiek- tywu i okularu.

Question 18

zdolność rozdzielcza

Answer 18

definiowana jako najmniejsza odległość między dwiema strukturami dostrzeganymi jako oddzielne obiekty. Najwyższa zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego wynosi ok. 0,2 μm, co pozwala na uzyskanie wyraźnych obrazów powiększonych od 1000 do 1500 razy.

zależy przede wszystkim od jakości so- czewki obiektywu. Duże powiększenie mikroskopu jest za- letą tylko wtedy, jeśli towarzyszy mu wysoka rozdzielczość. Soczewki obiektywów umożliwiających uzyskiwanie bardzo dużych powiększeń projektowane są w sposób zapewniający wyższą zdolność rozdzielczą. Soczewka okularowa jedynie powiększa obraz uzyskany przez obiektyw, nie poprawiając jego rozdzielczości.

Question 19

Fluorescencja

Answer 19

Pod wpływem działania światła o określonej długości nie- które składniki komórek emitują światło o większej długo-
ści fal

Question 20

Mikroskopia fluorescencyjna

Answer 20

skrawki tkankowe zazwyczaj naświetlane są światłem ultrafioletowym (UV, ultraviolet), a emisja następuje w widzialnej części widma. Substancje fluorescencyjne widoczne są jako jasne obiekty na ciem- nym tle.

Question 21

Barwniki fluorescencyjne

Answer 21

Jako barwniki fluorescencyjne można zastosować związ- ki fluorescencyjne wykazujące powinowactwo do swo- istych makrocząsteczek komórkowych. Przykładem takiego związku może być oranż akrydyny, który wiąże się zarówno z DNA, jak i RNA. Gdy obserwuje się te kwasy nukleino- we pod mikroskopem fluorescencyjnym, emitują one nie- co inną fluorescencję, dzięki czemu można zlokalizować je w odrębnych obszarach komórk

Question 22

Mikroskopia kontrastowo-fazowa

Answer 22

Mikroskopia kontrastowo-fazowa opiera się na zasadzie zmiany prędkości fal świetlnych podczas ich przechodzenia przez komórkowe i pozakomórkowe struktury o różnych współczynnikach załamania światła. Układ kontrastu fazo- wego korzysta z powyższych zmian, ukazując struktury, któ-
re są jaśniejsze lub ciemniejsze względem siebie. Ze wzglę- du na możliwość badania komórek bez konieczności ich utrwalania lub barwienia, mikroskopy kontrastowo-fazowe są podstawowymi narzędziami stosowanymi we wszystkich laboratoriach hodowli komórkowych. Modyfikacją mikro- skopii kontrastowo-fazowej jest kontrastowa mikroskopia interferencyjno-różnicowa z optyką Nomarskiego, która pozwala na uzyskanie obrazu żywych komórek z uwidocz- nionymi cechami ich trójwymiarowego

Question 23

Mikroskopia konfokalna

Answer 23

Mikroskopia konfokalna (ryc. 1–6) uni- ka powyższych problemów i pozwala osiągnąć wysoką roz- dzielczość i ostrość za pomocą (1) małej, punktowej wiązki światła o wysokiej intensywności, najczęściej generowanej przez laser oraz (2) przesłony w postaci płytki z bardzo małym otworem – przesłony konfokalnej (pinhole) – zlokalizowanej przed detektorem obrazu. Punktowe źródło światła, ogni- skowa soczewki i przesłona detektora są ze sobą optycznie sprzężone, czyli położone względem siebie w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (płaszczyźnie konfokalnej). Unie- możliwia to przejście przez przesłonę konfokalną światła niezogniskowanego, czyli pochodzącego z innej płaszczyzny próbki [nieskupionego na oglądanej płaszczyźnie prepara- tu – przyp. tłum.]. Poprawia to znacznie rozdzielczość ob- serwowanego obiektu i pozwala na lokalizację składników preparatu z dokładnością znacznie większą niż w przypadku mikroskopu jasnego pola

Question 24

Mikroskopia polaryzacyjna

Answer 24

Mikroskopia polaryzacyjna pozwala na rozpoznanie bar- wionych lub niebarwionych struktur złożonych z wysoce uporządkowanych podjednostek. Gdy normalne światło widzialne przechodzi przez filtr polaryzacyjny, opuszcza go jako fala drgająca tylko w jednym kierunku (płaszczyź- nie). Jeżeli w mikroskopie powyżej pierwszego umieszczo- ny zostanie drugi filtr polaryzacyjny, którego oś polaryzacji jest prostopadła do osi tego pierwszego, światło przez ten drugi nie przejdzie. Jeżeli jednak pomiędzy dwoma filtra- mi polaryzacyjnymi znajdują się struktury tkankowe za- wierające uporządkowany układ makrocząsteczek, ich po- wtarzający się układ powoduje obrót osi polaryzacji światła wychodzącego z polaryzatora i stają się one widoczne w po- staci jasnych struktur na ciemnym tle (ryc. 1–7). Zdolność do zmiany kierunku drgania światła spolaryzowanego na- zywana jest dwójłomnością i stanowi cechę substancji kry- stalicznych oraz zawierających wysoce uporządkowane czą- steczki, takich jak celuloza, kolagen, mikrotubule i filamenty aktynowe.

Question 25

Transmisyjna mikroskopia elektronowa

Answer 25

wiązka elektronów, skupiona za pomocą elektro magnetycznych „soczewek”, przechodzi przez skrawek tkan- kowy, tworząc obraz z obszarami widocznymi jako czarne, białe lub w odcieniach szarości. Takie rejony mikrofotogra- fii elektronowej odpowiadają obszarom tkanki, przez którą elektrony swobodnie przeszły (wyglądające na jaśniejsze, czyli elektronowo jasne), a także obszarom, gdzie elektro- ny zostały pochłonięte lub odchylone (wyglądające na ciem- niejsze, czyli elektronowo-gęste). W celu poprawy kontrastu i rozdzielczości TEM do utrwalaczy i roztworów stosowa- nych przy odwodnianiu podczas przygotowywania tkanki

odaje się związki zawierające jony metali ciężkich. Należą do nich czterotlenek osmu, cytrynian ołowiu i związki ura- nylu, które wiążą się z makrocząsteczkami komórki, zwięk- szając ich gęstość elektronową i widoczność.

Question 26

Czemu tem można analizować bez utrwalania i zatapiania?

Answer 26

Techniki mrożenia i łamania (cryofracture) oraz krio- rytowania

powyższych metodach bardzo mała próbka tkan- ki jest gwałtownie zamrażana w ciekłym azocie, a następ- nie krojona lub łamana za pomocą ostrza. Replika odsło- niętej, zamrożonej powierzchni wytwarzana jest w próżni przez napylenie na próbkę cienkiej warstwy waporyzowanej platyny lub atomów innego metalu. Po usunięciu materia- łu organicznego, replikę powierzchni przekroju można zba- dać za pomocą TEM. W przypadku błon losowe płaszczyzny łamania często rozdzielają dwuwarstwę lipidową, ukazując składniki białkowe, których rozmiar, kształt i rozmieszcze- nie są trudne do zbadania za pomocą innych metod.

Question 27

Skaningowa mikroskopia elektronowa

Answer 27

Podobnie jak TEM, także SEM wytwarza i sku- pia bardzo wąską wiązkę elektronów, choć w tym urządzeniu wiązka nie przechodzi przez preparat (ryc. 1–8b). Zamiast tego powierzchnia próbki jest najpierw osuszana i powleka- na przez napylenie bardzo cienkiej warstwy ciężkiego me- talu (często złota), która odbija elektrony wiązki skanującej preparat. Odbite elektrony rejestrowane są przez detektor, produkując sygnał, który przetwarzany jest w celu uzyska- nia czarno-białego obrazu. Obrazy pochodzące z SEM są za- zwyczaj łatwe w interpretacji, ponieważ ukazują trójwymia- rowy widok struktury, która wydaje się oświetlona tak jak duże obiekty wykazujące rozjaśnienia i cienie powodowane przez światło.

Question 28

AUTORADIOGRAFIA

Answer 28

est metodą polegającą na lokalizowaniu w komórkach lub skrawkach tkankowych nowo syntezowanych makrocząsteczek. Po wniknięciu do żywych komórek radioaktywnie znakowane metabo- lity (nukleotydy, aminokwasy, cukry) wbudowywane są w określone makrocząsteczki (DNA, RNA, białka, gliko- proteiny i polisacharydy) i emitują słabe promieniowanie, które ograniczone jest do rejonów, w których występują te makrocząsteczki. Szkiełka ze znakowanymi radioaktyw- nie komórkami lub skrawkami tkankowymi powlekane są w ciemni emulsją fotograficzną, w której kryształy bromku srebra działają jako mikrodetektory promieniowania w spo- sób identyczny do tego, w jaki reagują na światło w kliszy fotograficznej. Po odpowiednim czasie ekspozycji w światło- szczelnych kasetach szkiełka podlegają typowemu procesowi wywoływania obrazu w technice fotograficznej. Zredu- kowane pod wpływem promieniowania kryształy bromku srebra wytwarzają małe czarne ziarna metalicznego sre- bra, które oglądane pod mikroskopem świetlnym lub TEM wskazują tkankową lub komórkową lokalizację znakowa- nych radioaktywnie makrocząsteczek

Question 29

HODOWLE
KOMÓRKOWE I TKANKOWE

Answer 29

Żywe komórki i tkanki mogą być utrzymywane i badane poza organizmem w postaci hodowli (culture) – in vitro. W organizmie – in vivo – komórki zanurzone są w pocho- dzącym z osocza krwi płynie, który zawiera wiele różnych cząsteczek niezbędnych do ich przeżycia i wzrostu. celu założenia hodowli, komórki z tkanki lub narządu rozprasza się mechanicznie lub enzymatycznie i z zachowa- niem sterylnych warunków pracy umieszcza na przejrzystych płytkach lub naczynkach, do których komórki przywierają, zazwyczaj tworząc pojedynczą warstwę Preparaty tego typu nazywane są pierwotnymi hodowlami ko- mórkowymi. Niektóre komórki mogą być utrzymywane in vitro przez długi okres, ponieważ stają się unieśmiertelnione i ustanawiają wówczas stałą linię komórkową.

Question 30

HISTOCHEMIA ENZYMÓW

Answer 30

jest metodą lo- kalizacji struktur komórkowych, która wykorzystuje ich swoistą aktywność enzymatyczną.

stosowana jest zazwyczaj nieutrwalona lub łagod- nie utrwalona tkanka, którą kroi się za pomocą kriostatu. Tym samym unika się negatywnego wpływu ogrzewania i rozpuszczalników organicznych na aktywność enzyma- tyczną. W celu przeprowadzenia histochemicznego wy- krywania enzymów: (1) skrawki tkankowe zanurzane są w roztworze zawierającym substrat wykrywanego enzymu; (2) umożliwia się odziaływanie enzymu na substrat [zapew- nia się to, stosując odpowiednią temperaturę, pH i skład płynu inkubacyjnego – przyp. tłum.]; (3) skrawek jest inku- bowany w obecności związku markerowego, który wchodzi w reakcję z produktem aktywności enzymu; (4) końcowy produkt powstający z markera, który musi być nierozpusz- czalny i widzialny w mikroskopii świetlnej lub elektronowej, wytrąca się w miejscu występowania enzymu, co wskazuje jego lokalizację.

Question 31

Przykłady enzymów wykrywanych histochemicznie

Answer 31

■ fosfatazy usuwające grupy fosforanowe z makrocząsteczek
■ dehydrogenazy przenoszące jony wodoru z jednego substratu na drugi; należą do nich liczne enzymy cyklu kwasu cytrynowego (cyklu Krebsa), umożliwiając hi- stochemiczną identyfikację tych enzymów w mitochon- driach;
■ peroksydazy katalizujące utlenienie substratów po- przez przeniesienie jonów wodorowych na nadtlenek wodoru.

Question 32

WYKRYWANIE SWOISTYCH CZĄSTECZEK

Answer 32

Specyficzne makrocząsteczki w skrawkach tkankowych mogą być identyfikowane przez zastosowanie znakowa- nych związków lub makrocząsteczek, które swoiście wiążą się z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Związki, które oddziałują z cząsteczką, muszą być widocz
ne pod mikroskopem świetlnym lub elektronowym, często dzięki dołączeniu do nich wykrywalnego znacznika.

Question 33

Najczęściej stosowanymi znacznikami w wykrywaniu swoistych cząsteczek są

Answer 33

są związki fluorescencyjne, radioaktywne atomy, które mogą być wykryte przez autora- diografię, cząsteczki peroksydazy lub inne enzymy wykry- wane histochemicznie oraz cząsteczki metali (zazwyczaj złota) możliwe do zaobserwowania za pomocą mikrosko- pii świetlnej lub elektronowej.

Question 34

Przykładami cząsteczek, które swoiście oddziałują z in- nymi cząsteczkami, są:

Answer 34

■ falloidyna –silnie oddziałuje z aktyną, czyli białkiem mikrofilamentów;
■ białko A – może być zastosowane do lokalizacji naturalnie występują- cych w komórkach lub wprowadzonych do nich przeciwciał łączących się ze strukturami komórkowymi;
■ lektyny – glikoproteiny pochodzące przede wszystkim z nasion roślin i wykazujące wysokie powinowactwo oraz swoistość wiązania z węglowodanami; różne lekty- ny wiążą się ze specyficznymi cukrami lub sekwencjami reszt cukrowcowych, umożliwiając zastosowanie fluore- scencyjnie znakowanych lektyn do swoistego barwienia glikoprotein lub innych makrocząsteczek ze swoistymi sekwencjami reszt cukrowcowych.

Question 35

Immunohistochemia

Answer 35

Przykładem wysoce swoistej interakcji między makroczą- steczkami jest ta, która zachodzi między antygenem a skie- rowanym przeciw niemu przeciwciałem. Z tego powodu znakowane przeciwciała są rutynowo stosowane w immu- nohistochemii w celu identyfikacji i lokalizacji wielu swo- istych białek, a nie tylko tych wykazujących aktywność en- zymatyczną, którą można wykryć za pomocą histochemii

Question 36

Techniki hybrydyzacyjne

Answer 36

Hybrydyzacja oznacza zwykle swoiste wiązanie pomiędzy dwoma pojedynczymi nićmi kwasu nukleinowego, które za- chodzi w odpowiednich warunkach, jeśli nici są komplemen- tarne. Im większe jest podobieństwo sekwencji nukleotydo- wych, tym łatwiej komplementarne nici tworzą „hybrydową”, dwuniciową cząsteczkę.

Question 37

hybrydyzacją in situ

Answer 37

bezpośrednio na od- powiednio przygotowane komórki poda się roztwór kwasu nukleinowego o określonej sekwencji.

Technika ta idealnie nadaje się do stwierdzenia, czy komórka posiada specyficzną sekwencję DNA, taką jak gen lub jego część

rozpoznania komórek posia- dających swoiste informacyjne RNA (mRNA) (czyli takich, w których odpowiedni gen podlega procesowi transkrypcji), a także do (3) wskazania lokalizacji genu na specyficznym chromosomie. DNA i RNA analizowanych komórek muszą być na wstępie zdenaturowane przez ogrzanie lub działa- nie innych środków, aby stały się całkowicie jednoniciowe.

Question 38

Artefakty

Answer 38

Niewielkie nieprawidłowości na preparacie powstałe przy przygotowywaniu