2.5 next generatoin sequencing: moderne techniek voor het opsporen van mutaties

Question 1

waarvoor wordt NGS gebruikt?

Answer 1

voor de detectie van
- kleine mutaties
- deleties en amplificaties
- translocaties en fusiegenen

Question 2

hoe wordt NGS toegepast in moleculaire pathologie?

Answer 2

differentiaal diagnostiek
therapiekeuzen
clonaliteitsanalyse
oncogenetica
weefselidentificatie

Question 3

hoe wordt genetische info opgebouwd?

Answer 3

genetische info ligt in DNA

22000 genen

het volledige humane genoom wordt met 3 miljard basen beschreven

Question 4

hoe zit de complementariteit in dna?

Answer 4

A-T: 2 waterstofbruggen
C-G: 3 waterstofbruggen

Question 5

hoe gaat PCR?

Answer 5

polymerase chain reaction
1. denaturatie bij 90-95 °C. de strengen van het template DNA splitsen
2. hybridisatie bij 50-60 °C, de primer hecht aan het template DNA
3. elongatie bij 72 °C. Taq-polymerase plaatst nieuwe nucleotiden

Question 6

wat is thermus aquaticus?

Answer 6

bacterie die pas dood gaat bij 120 °C
PCR
synthetiseren dna

Question 7

wat is NGS?

Answer 7

2 soorten NGS:
- single molecule: sequentie van afzonderlijke moleculen wordt bepaald en niet van een mix van verschillende moleculen

• massively parallel: van een zeer groot aantal afzonderlijke moleculen wordt de sequentie in parallel (tegelijkertijd) bepaald

Question 8

wat zijn NGS methodes?

Answer 8

amplicon enrichment (IonTorrent)
hybridization capture (Illumina)

Question 9

wat is amplicon enrichment ?

Answer 9

een specifiek deel van genoom wordt gesequenced
aan PCR primers kan een label gehangen worden die mee worden gesequenced waardoor dezelfde gebieden bekeken kunnen worden van verschillende individuen

efficient maar er wordt wel maar steeds 1 fragment uit een bepaald gebied gesequences

Question 10

wat is hybridization enrichment?

Answer 10

DNA wordt in kleine fragmenten gesplitst voordat het geamplificeerd wordt.
het wordt op adapters aangebracht voor latere sequencing . interessante gebieden worden eruitgehaald (capture) en gesequenced worden

minder efficient maar er kunnen wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied gesequenced worden

Question 11

hoe gaat het sequencen?

Answer 11

mbv adapters worden moleculen gebonden aan flowcell. op het flowcell worden de dna fragmenten geamplificeerd (vermeerderd).

de daadwerkelijke sequencing vindt plaats tijdens de synthese.

elke nucleotide heeft zijn eigen kleur. door een fragment van de sequenties te vergelijken kan je zien van welk gen het afkomstig is. als de sequentie van verschillende patienten vergeleken moet worden kan dit met een barcode (dna barcoding)

Question 12

wat is coverage (deep sequencing)?

Answer 12

aantal malen dat een base positie bepaald is. hoe hoger de coverage, hoe dieper gesequenced (nauwkeuriger)

bij whole genome sequencing WES of whole exome sequencing <100x diep

bij targeted sequencing 500x-10.000x diep

Question 13

wat is variant allel frequentie?

Answer 13

aantal malen dat een variant op een specifieke positie gevonden is tov referentie

afhankelijk van
- gen
- tumorcelpercentage

Question 14

wat is het verschil tussen oud: sanger sequencing (PCR) vs nieuw: NGS?

Answer 14

sanger sequencing:
- mix van moleculen
- 1 fragment/ analyse
- output max 1000 basen
- veel dna nodig
- lage gevoeligheid
- poolen niet mogelijk
- eenvoudige analyse

NGS:
- single molecule
- duizenden fragmenten/ analyse
- output 1-20 miljard basen
- weinig dna nodig
- hoge gevoeligheid
- poolen van samples (barcode)
- bio-informatica vereist