κ3.3 Flashcards
(3 cards)
Ποιους φορείς μεγάλων ενθέσεων γνωρίζεται ?
- Τεχνητά χρωμοσώματα βακτηρίων (BAC)
- Τεχνητά χρωμοσώματα ζύμης (YAC)
- Κοσμίδια
Έχουν επικρατήσει οι BACs φορείς καθώς μπορούν να αποθηκευτούν στους -70οC και να αναλυθούν με μεθόδους υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας (High-throughput) και ρομποτικής
Το μέγεθος της ένθεσης κυμαίνεται μεταξύ 160-200 kb
Ποια είναι η πιο άμεση μέθοδος για τη σάρωση μιας βιβλιοθήκης με σκοπό την απομόνωση ενός συγκεκριμένου γονιδίου
Η πιο άμεση μέθοδος είναι η υβριδοποίηση με νουκλεικά οξέα, είναι ένας ευαίσθητος τρόπος ανίχνευσης αλληλουχιών DNA με τη βοήθεια σημασμένων μικρών τμημάτων DNA (ιχνηθέτες) τα οποία είναι συμπληρωματικά προς τις επιθυμητές αλληλουχίες. Υπό την προυπόθεση να γνωρίζουμε τουλάχιστον κάποιο τμήμα των αλληλουχιών που αναζητάμε Το γονίδιο που μας ενδιαφέρει μπορεί να εντοπισθεί σε μια βιβλιοθήκη αξιοποιώντας τη γνώση της αλληλουχίας ομόλογων προς αυτό γονιδίων από τον ίδιο ή άλλον οργανισμό.Τα βήματα της διαδικασίας του υβριδισμού είναι τα εξής :
* Ένα μέρος κάθε πλάκας ή αποικίας μεταφέρεται σε μεμβράνες νιτροκιταρίνης ή νάιλον ώστε τα πρότυπα της διάταξης των κλώνων στα τρυβλία να διατηρείται και στη μεμβράνη
* Παρασκευάζονται μεμβράνες με ένα αντίγραφο της βιβλιοθήκης
* Οι μεμβράνες επωάζονται σε έναν ιχνηθέτη νουκλεϊκού οξέος (ραδιενεργά σημασμένος) με σκοπό την ανίχνευση των αλληλουχιών που μας ενδιαφέρουν
* Εφόσον η υβριδοποίηση ανάμεσα στον ιχνηθέτη και τις ομόλογες γονιδιακές αλληλουχίεςστόχους γίνει σε χαμηλότερες θερμοκρασίες (42 οC αντί για 65 οC) εντοπίζεται ο κλώνος.
Ποιες τεχνικές υβριδισμού γνωρίζεται ?
Υβριδισμός κατά Southern
Aναπτύχθηκε έγινε το 1975 από τον Ed southern ο οποίος συνδύασε την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα με την υβριδοποίηση
Κατά τη μέθοδο αυτή το γονιδιωματικό DNA κόβεται με ένα ή περισσότερα ένζυμα περιορισμού και τα τμήματα που προκύπτουν διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Αποτέλεσμα αυτού είναι να εντοπιστεί η συμπληρωματικότητα ή η ομοιότητα διαφόρων τμήματων DNA . Τα βήματα είναι τα εξής :
* Με την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα εμβαπτίζεται σε αλκαλικό διάλυμα ώστε τα μόρια του DNA να αποδιαταχθούν
* Τοποθετείται ένα κατάλληλο υπόστρωμα (φίλτρο νιτροκυτταρίνης ή νάιλον μεμβράνης) πάνω στο πήκτωμα
* Μετά από κατάλληλους χειρισμούς μεταφέρεται το ρυθμιστικό διάλυμα με το τριχοειδές φαινόμενο στη συσκευή μεταφοράς και συμπαρασύρει το μονόκλωνο DNA
* Το μονόκλωνο τμήμα DNA ακινητοποιείται στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης
* Η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε διάλυμα που περιέχει εκτός από άλατα και ρυθμιστικά διαλύματα και έναν σημασμένο ανιχνευτή νουκλεϊκού οξέος
* Όλο το σύστημα επωάζεται για αρκετές ώρες σε μία θερμοκρασία
* Η περίσσεια του ιχνηθέτη που δεν υβριδοποιήθηκε απομακρύνεται και το υπόστρωμα εκτίθεται σε ακτινογραφικό φιλμ (ακτίνες- Χ)
* Εμφάνιση πρότυπων μαύρων ζωνών που υποδεικνύουν τα τμήματα του DNA που φέρουν συμπληρωματικές αλληλουχίες προς τον ιχνηθέτη (αυτοραδιογραφία)
Υβριδισμός κατά Northern
Κατά τη μέθοδο αυτή ένα δείγμα RNA ηλεκτροφορείται, μεταφέρεται σε ένα στερεό υπόστρωμα και υβριδοποιείται με ένα σημασμένο ιχνηθέτη. Ο υβριδισμός κατά Northern χρησιμοποιείται για να προσδιορίσουμε:
* ποιοι ιστοί ή κυτταρικοί τύποι μεταγράφουν ένα συγκεκριμένο γονίδιο
* σε ποια στάδια της ανάπτυξης ενεργοποιούνται μεταγραφικά τα διάφορα γονίδια
* ποιοι είναι οι παράγοντες που ρυθμίζουν τη μεταγραφή τους
Υβριδισμός κατά Southern και Northern
* Για την καταγραφή των ραδιοσημασμένων ιχνηθετών χρησιμοποιούνται πλέον αντί για φωτογραφικό φιλμ επιφάνειες από ειδικό υλικό που περιέχει κρυστάλλους και αποκρίνονται στις εκπομπές ραδιενέργειας
* Το υλικό τοποθετείται σε κατάλληλη συσκευή που ονομάζεται φωσφοροαπεικονιστής στην οποία οι κρύσταλλοι διεγείρονται με laser
* Το εκπεμπόμενο φως καταγράφεται από έναν φωτοπολλαπλασιαστή
* Η μέθοδος πλέον είναι ταχύτερη και πιο ευαίσθητη
Εναλλακτικά οι ιχνηθέτες μπορεί να σημανθούν και χωρίς τη χρήση ραδιενέργειας
* Υπάρχουν έμμεσες μέθοδοι όπως η ενσωμάτωση σε έναν ιχνηθέτη νουκλεοτίδια που φέρουν συνδεδεμένο ένα μικρό μόριο όπως η βιοτίνη
* Τα μόρια βιοτίνης ανιχνεύονται με τη χρήση ενός ειδικού για αυτά αντισώματος που φέρει προσδεμένο το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση
* Η υδρόλυση του υποστρώματος από την αλκαλική φωσφατάση συνοδεύεται από εκπομπή φωτός
Υβριδοποίηση φθορισμού in situ (FISH)
Μια διαδικασία οπού γίνεται υβριδοποίηση απευθείας στο χρωμόσωμα στα κύτταρα
Γίνεται υβριδισμός της αλληλουχίας στόχου στην χρωμοσωμική περιοχή στη φυσική της θέση (in situ) και ενός ιχνηθέτη. Κατά τη μέθοδο αυτοί χρησιμοποιούνται σημασμένοι με φθορίζουσα χρωστική ιχνηθέτες για την απευθείας υβριδοποίηση σε κατάλληλα προπαρασκευασμένα κύτταρα.
Εντοπίζει αλλαγές δεκάδων χιλιάδων νουκλεοτιδίων με τη χρήση οπτικού μικροσκοπίου
