Κεφάλαιο 4

Question 1

Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες?

Answer 1

Ενζύμα που κόβουν το DNA σε κομμάτια με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων.

Question 2

Τι βοήθησε στην ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδιασμένου DNA?

Answer 2

Η απομόνωση και χρήση πολυάριθμων ενζύμων, έδωσε στους ερευνητές τη δυνατότητα «αναπαραγωγής» των διαδικασιών της αντιγραφής, αντίστροφης μεταγραφής, μεταγραφής και μετάφρασης in vitro.
Ειδικότερα η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών και των ειδικών φορέων που μεταφέρουν DNA από κύτταρο σε κύτταρο.

Question 3

Τι ονομάζουμε ανασυνδιασμένο μόριο DNA?

Answer 3

Τεχνητό μόριο DNA που περιέχει γονίδια από δύο η περισσότερους οργανισμούς.

Question 4

Που μπορεί να εισαχθεί ενα τεχνητό μόριο DNA?

Answer 4

Σε ένα βακτήριο ή σε ένα ευκαριωτικό κύτταρο. Τα γενετικά τροποποιημένα βακτήρια ή κύτταρα είναι ικανά να ζούν και να αναπαράγονται μεταφέροντας στους απογόνους τους τις καινούργιες ιδιότητες.

Question 5

Τι ονομάζουμε Γενετική Μηχανική?

Answer 5

Τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό.

Question 6

Που βοήθησε η Γενετική Μηχανική?

Answer 6

α. Στην κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης πάνω στη Γη
β. Στη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσης του ανθρώπου.

Question 7

Τι περιλαμβάνει η τεχνολογία του ανασυνδιασμένου DNA?

Answer 7

Περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές που οδηγούν σε μεταφορά του γενετικού υλικού από τον ένα οργανισμό στον άλλο

Question 8

Πως μεταφέρουμε το γενετικό υλικό ενός οργανισμού σε έναν άλλο οργανισμό?

Answer 8

I) Tο ολικό DNA από έναν οργανισμό δότη απομονώνεται, κόβεται ενζυμικά με τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες, και ενώνεται με ένα φορέα κλωνοποίησης.
ΙΙ) Μεταφέρουμε το ανασυνδυασμένο μορίου DNA σε ένα κύτταρο-ξενιστή.
ΙΙΙ) Επιλέγουμε και απομονόνουμε τα κυττάρα-ξενιστες. Στο στάδιο αυτό τα κύτταρα-ξενιστές που έχουν προσλάβει το ανασυνδυασμένο DNA επιλέγονται από εκείνα που δεν το έχουν προσλάβει. Κάθε βακτήριο που προσλαμβάνει ένα μόνο μόριο ανασυνδυασμένου DNA πολλαπλασιάζεται και παράγει μια αποικία που αποτελεί ένα βακτηριακό κλώνο.
ΙV) Επιλέγουμε έναν βακτηριακό κλώνο που περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA. Αυτο πραγματοποιείται με τη βοήθεια ειδικών μορίων ανιχνευτών.

Question 9

Τι είναι ο φορέας κλωνοποίησης?

Answer 9

Ο φορέας κλωνοποίησης είναι ένα μόριο DNA, (πλασμίδιο ή DNA φάγων), το οποίο μπορεί να αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο-ξενιστή όπως ένα βακτήριο.

Question 10

Τι ονομάζουμε μετασχηματισμό?

Answer 10

Μετασχηματισμό ονομάζουμε την εισαγωγή του DNA σε βακτηριακό κύτταρο-ξενιστή.

Question 11

Τι ονομάζουμε κλώνο?

Answer 11

Ο όρος κλώνος αναφέρεται σε μια ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων, ή οργανισμών.

Question 12

Τι ονομάζουμε κλωνοποίηση?

Answer 12

Ο όρος κλωνοποίηση αναφέρεται στην κατασκευή, κατά προτίμηση μεγάλου αριθμού, πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών.

Question 13

Ποιός είναι ο φυσιολογικός ρόλος των περιοριστικών ενδονουκλεάσεων?

Answer 13

Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια και ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να τα προστατεύουν από την εισβολή «ξένου» DNA. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA.

Question 14

Αναφέρετε γνωρίσματα της περιοριστικής ενδονουκλεάσης EcoRI.

Answer 14

Η EcoRI που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli. Το ένζυμο αυτό όποτε συναντά την αλληλουχία:
5’-G Α Α Τ Τ C-3’
3’-C Τ Τ A A G-5’ στο γονιδίωμα, κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του G και του Α (με κατεύθυνση 5’→3’) αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα.

Question 15

Πως μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα μονόκλωνα άκρα τα οποία έχουν κοπεί ενζυμικά από περιοριστικές ενδονουκλεάσες?

Answer 15

Τα άκρα αυτά μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τις συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση.

Question 16

Τι ονομάζουμε γονιδιωματική βιβλιοθήκη?

Answer 16

Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιέχει το συνολικό DNA ενός οργανισμού δότη.

Question 17

Αναφέρετε τα στάδια κατασκευής γονιδιωματικής βιβλιοθήκης με την χρήση της EcoRI.

Answer 17

1) Απομονώνουμε DNA από οργανισμό δότη όπου η αλληλουχία GAATTC υπάρχει διάσπαρτη στα γονιδιώμά του.
Το γονιδίωμα του οργανισμού δότη κόβεται ενζυμικά απο την EcoRI σε χιλιάδες κομμάτια.
2)Κόβουμε ενζυμικά με την EcoRI πλασμίδια (φορέας κλωνοποίησης)όπου έχουν τη συγκεκριμένη αλληλουχία μία μόνο φορά δημιουργόντας έτσι ένα γραμμικό μόριο DNA με μονόκλωνα άκρα. 3)Αναμιγνύουμαι τα δύο είδη DNA, του πλασμιδίου και του οργανισμού και επειδή έχουν συμπληρωματικά άκρα, ενώνονται μεταξύ τους με τη μεσολάβηση της DNA δεσμάσης.
4)Στο στάδιο αυτό δημιουργούνται ανασυνδυασμένα πλασμίδια. Μερικά πλασμίδια ξαναγίνονται κυκλικά, χωρίς να προσλάβουν κόμματι γονιδιώματος του οργανισμού.
5)Σε αυτό το στάδιο μεταφέρουμε τα ανασυνδιασμένα πλασμίδια σε βακτήρια - ξενιστές. Ως ξενιστές χρησιμοποιούνται βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια διότι είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά. Για να μπει ένα πλασμίδιο μέσα στο βακτήριο, τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια, μετά από κατάλληλη κατεργασία.
6)Σε αυτό το στάδιο επιλέγουμε τα βακτήρια που δέχτηκαν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Η επιλογή στηρίζεται στην ικανότητα ανάπτυξής τους παρουσία αντιβιοτικού (το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο περιέχει ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό). 7)Τοποθετούμε τα βακτήρια σε θρεπτικό υλικό και σε ευνοικές για αυτά συνθήκες πολλαπλασιάσμου μας δίνουν ένα κλώνο.Το σύνολο των κλώνων αυτών που περιέχουν το συνολικό DNA του οργανισμού δότη ονομάζεται γονιδιωματική βιβλιοθήκη.

Question 18

Σε τι χρησιμεύουν οι ανιχνευτές?

Answer 18

Στην επιλογή ενός κλώνου που περιέχει ένα επιθυμητό γονίδιο.

Question 19

Ποιά είναι η διαφορά του βακτηριακού φάγου λ από τα πλασμίδια?

Answer 19

Ο βακτηριοφάγος λ μπορεί να ενσωματώσει μεγαλύτερα κομμάτια DNA δότη.

Question 20

Σε ποιά περίπτωση κατασκευάζουμε cDNA βιβλιοθήκες?

Answer 20

Όταν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα.

Question 21

Τι είναι οι cDNA βιβλιοθήκες?

Answer 21

Οι cDNA βιβλιοθήκες περιέχουν αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα που περιέχουν τα γονίδια που θέλουμε να κλωνοποιήσουμε. Οι cDNA βιβλιοθήκες έχουν το πλεονέκτημα απομόνωσης των εξωνίων.

Question 22

Πως κατασκευάζεται μια cDNΑ βιβλιοθήκη?

Answer 22

1)Απομονώνουμε το ολικό «ώριμο» mRNA από κύτταρα που εκφράζουν το επιθυμητό γονίδιο.
2)Χρησιμοποιούμε τo mRNA σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA με την παρουσία ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση. Έτσι παράγονται υβριδικά μόρια cDNA-mRNA. 3)Αποδιατάσουμε το υβριδικό μόριο cDNA-mRNA με θέρμανση ή προσθέτουμε κατάλληλες χημικές ουσίες για την διάσπασή του.
4)Προσθέτουμε το ένζυμο DNA πολυμεράση για την κατασκευή συμπληρωματικών αλυσιδών με καλούπι την αλυσίδα cDNA.
5)Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους και κλωνοποιούνται με τη διαδικασία του μετασχηματισμού και της καλλιέργειας.
6

Question 23

Σε τι αποσκοπεί η κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης?

Answer 23

Όταν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα γονίδια. Το κλωνοποιήμενο μόριο cDNA μπορεί να κατευθύνει την σύνθεση μιας ειδικής πρωτείνης του συγκεκριμένου γονιδίου μεσα στο κύτταρο ξενιστή.

Question 24

Τι ονομάζουμε αποδιάταξη?

Answer 24

Αποδιάταξη είναι ο διαχωρισμός των δύο συμπληρωματικών αλισιδών του DNA είτε με την χρηση κατάλληλων χημικών ουσιών, είτε με θέρμανση. Και στις 2 περιπτώσεις σπάνε οι δεσμοί υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των αζωτούχων βάσεων.

Question 25

Τι ονομάζουμε υβριδοποίηση?

Answer 25

Υβριδοποίηση ονομάζουμε την σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσιδών DNA ή συμπληρωματικων DNA - RNA

Question 26

Σε τι χρησιμεύει η υβριδοποίηση?

Answer 26

Η διαδικασία της υβριδοποίησης ακολουθείται και για την απομόνωση ενός συγκεκριμένου γονιδίου από μια cDNA βιβλιοθήκη.

Question 27

Με ποιά διαδικασία μπορούμε να εντοπίσουμε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA ανάμεσα σε πολλά άλλα κομμάτια DNA?

Answer 27

Η τεχνική που χρησιμοποιείται συνήθως περιλαμβάνει τη χρήση ιχνηθετημένων ανιχνευτών μορίων DNA ή RNA που περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές προς το κλωνοποιημένο DNA. Οι ανιχνευτές αναμειγνύονται με το DNA της βιβλιοθήκης (το οποίο έχει αποδιαταχθεί) και υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό τους DNA.

Question 28

Που αποσκοπεί η δημιουργία πολλών κλώνων?

Answer 28

Η κατασκευή βιβλιοθηκών μας δίνει τη δυνατότητα να απομονώσουμε το βακτηριακό κλώνο που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο. Στη συνέχεια πολλαπλασιάζο και δημιουργούνται πολλά αντίγραφα του γονιδίου που περιέχεινται τα βακτήρια του κλώνου. Αυτό αποσκοπεί στην μελέτη του συγκεκριμένου γονιδίου και στην παραγωγή της πρωτεΐνης που αυτό κωδικοποιεί.

Question 29

Που χρησιμεύει η PCR?

Answer 29

Με την διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται η επιλεκτική αντιγραφή, εκατομύρια φορές, ειδικών αλληλουχιών DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων dNA, χωρίς την μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου, χωρίς δηλαδή να απαιτείται κλωνοποίηση.

Question 30

Τι προυποθέτει η PCR?

Answer 30

Να είναι γνωστή η νουκλεοτιδική αλληλουχία του τμήματος που θέλουμε να κάνουμε PCR.

Question 31

Τί είναι PCR?

Answer 31

Κλωνοποίηση in vitro

Question 32

Τι δυνατότηα έχει η PCR?

Answer 32

Έχει την δυνατότηα ανίχνευσης ενός μόνο DNA μορίου σε ένα μείγμα.

Question 33

Που εφαρμόζεται μια PCR?

Answer 33

1) Στην Ιατρική για την διάγνωση ασθενειών οπως AIDS
2) Στην Εγκληματολογία για την διαλεύκανση υποθέσεων
3) Στην μελέτη DNA από απολιθώματα.