Elektrophorese Flashcards
Prinzip und Durchführung der Elektrophorese
Prinzip:
Trennung von elektrisch geladenen Teilchen aufgrund von unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten im elektr. Feld
Durchführung:
- absteigend auf einem Filterpapier oder Gel
- Flachbett-Anordnung (Gel/Papier)
- in einer Kapillare
- Kopplung mit anderen Trennmechanismen
Theoretische Grundlagen der Elektrophorese
Elektrophorese: Transport von Ionen in einer Lösung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes, wobei die wirkende elektrische Kraft F definiert ist:
F = z*e[C] * E [V/cm]
Was wirkt gegen F in einem viskosen wässrigen Medium? +Formel
die Reibungskraft F(R)
F = k n [Pa.s] v [cm/s]
v = [(ze)/ 6pinr] * E
Elektrophoretische Mobilität
mü = v/E = (z e)/ (6pin*r)
- nur Trennung geladener Analyten, Trennung beruht auf Unterschieden der Molekülgröße und Ladung
Detailiertes Prinzip
Probe wird:
- auf Trägermaterial aufgebracht (Papier-, Gelelektropherese)
- in eine Kapillare injiziert (Kapillarelektropherese CE)
Anlegen einer hohen Spannung (20-50 kV in de CE)
Kationen wander zur Kathode, Anionen zur Anode
Je nach ihrer Mobilität bewegen sich Ionen unterschiedlich schnell => Auftrennung
Neutralteilchen nicht aufgetrennt
Verwendung von Pufferlösungen => konst pH-Wert, Elektrolyt
Träger-Elektrophorese
- Verwendung eines Trägermaterials zur Trennung von Proteinen
- Wanderungsgeschwindigkeit v.a. abhängig von der Ladung der Moleküle
- Typischer Ablauf einer Trennung:
- Auftrennung auf Trägermaterial
- Anfärbung der Substanzflecken
- Entfärben (Entfernen vom ÜS)
- Transparent machen des Trägers
- densitometrisch (UV) vermessen
Gel- Elektrophorese
- Verwendung eines Gels als Träger- und Trennphase (z.B. Agarose; Polyacrylamid-Gele:PAGE) zur Trennung von Proteinen
- Trennung nach Molekülgröße und Ladung
- Porosität der Gele durch Konzentrationen der eingesetzten Stoffe steuerbar
- Gele in Röhrchen - und Flachbett- Form
Problem: - Überlagerung der Trennung nach Größe und Ladung
- Daher oft Abschirmung der Ladung durch Zusatz von Tensiden (SDS)
Kapillar-Eletrophorese: Instrumentierung
- Hochspannungsversorgung bis 30 kV
- meist unbeschichtete Quarz-Kapillaren
- UV/VIS-Detektoren
- Entstehung von Joulscher Wärme durch Stromfluss => kleine Kapillardurchmesser zur besseren Wärmeabfuhr
Elektroosmose
- bei einer Vielzahl von Materialien kommt es zur Ausbildung einer elektrochem. Doppelschicht bei Kontakt mit einer Elektrolytlösung aufgrund von Oberflächenladungen (Quarz bzw Glas => Dissoziation der Si-OH Gruppen)
- Innenseite der Kapillare: negativ geladen => positiv geladene Flüssigkeitssäule
- Elektroosmose tritt auf, wenn ein elektrisches Feld an das Elektrosystem angelegt wird
- positive geladene Flüssigkeitssäule bewegt sich im elekt. Feld in Richtung Kathode => Transport der Fl. ähnelt einer mech. Pumpe
- Fließprofil des EOF = kastenförmig
Kapillar-Zonen- Elektrophorese (Charakteristika)
- Trennung der Analytionen aufgrund von Mobilitätsunterschieden
- gleiche Puffer in beiden Reservoiren
- durch seine relativ hohe Konzentration im Vergleich zum Analyten bestimmt der Grundelektrolyt Leitfähigkeit und auch den pH in der Kapillare
- Optimierung der Trennung am einfachsten durch pH-Wert-Änderung; Beeinflussung des Dissoziationsgrads der Analyten/ starke Mobilitätsänderung am pK-Wert des Analyten
- Peakverbreitung nur durch longitudinale Diffusion
- scharfe Anfangszone bei der Probenaufgabe (1nL)
- Anw: biochem. und klinische Analytik
Vorteile und Nachteile von Kapillar-Zonen-Elektrophorese
Vorteile: -hohe Trennstufenzahl - schnelle Trennung Nachteil: - schwierige Detektion
Isotachophorese (Prinzip)
Trennung von elektr. geladenen Teilchen (Ionen) im elektr. Feld, in diesem Fall aufgrund der experimentellen Randbedingungen jedoch mit gleicher (0iso) Wanderungsgeschwindigkeit (-> tacho, phoresis)
Isotachophorese (Experimenteller Aufbau)
- Durchführung in Kapillarsäule
- Säule zu Beginn mit zwei Elektrolyten gefüllt:
a) vorne mit dem Elektrolyten mit der größeren Ionenbeweglichkeit
b) hinten mit dem Elektrolyten mit der geringeren Ionenbeweglichkeit - Grenzschicht befindet sich an der Injektorposition
- Probelösung wird an der Phasengrenzfläche aufgegeben
- Anlegen der Spannung dadurch:
- Anordnung der Ionen gemäß ihrer Ionenbeweglichkeit
- Wanderung aller Ionen durch die Trennstrecke mit gleicher Wanderungsgeschwindigkeit
- Detektion z.B. über Potentialgradienten- Detektor
Detektion Isotachophorese
a) Potentialgradienten-Detektor:
Anbringen zweier Pt-Elektroden nahe des Endes der Trennsäule. Übergang zwischen zwei Elektrolyten wird jeweils durch Potentialsprung angezeigt
b) UV-Absorptions-Detektor
Alternative für UV-absorbierende Substanzen
Isotachophorese (Charakteristika & Anwendungen)
Charakteristika:
- Probenvol: 0,1 - 100 mül Lsg von Ionen bei pH 2-12
- Erfassungsgrenze 10^-9 -10^-10 mol/l
- Reproduzierbarkeit 2%
Anwendungen:
- Biochemie
- Pharmaindustrie
- Lebensmittelindustrie
