7- Expression protéines Flashcards
Différents types d’application de purif de protéines (4)
1- étude d’activité
2-structure
3-application industrielle
4-application thérapeutique
Facteurs spécifiques à une protéine
1-Localisation ds cell
2-propriétés physicochimiques (PM, pI, liaison, glycolysation, phosphorylation, méthylation, etc)
Sources de protéines les plus étudiées
1- tissus animaux
2- bactéries (E.coli)
3- Levures (pichia pastoris)
4- c. insectes
5- c. humaines (HEK293-E6)
Avantages (3) et limites (4) expression des protéines animales
Avantages:
1-protéine native
2-modifications post-traductionnelles
3-pas cher
Désavantages:
1-sources limitées
2-petite quantité de prot spécif
3-pas de tag
4-pas tjr reproductible
Étapes Expression des protéines dans les bactéries (4)
1-construction vecteur
2-selection avec antibiotique
3-culture et induction de la protéine
4-purifier et analyser
Avantages (4) et limites (3) expression des protéines bactérie
Avantages:
1-bcp protéines et pas cher
2-culture et expression rapide
3-bcp vecteurs expression différents (tags)
4- expression de protéines marquées
Limites:
1-pas modif post trad ou de ponts disulf
2-pas bon pour protéines membranaires (esp chez l’humain)
3- différents codons chez la bactéries
Comment résoudre le pb des codons rares chez les bact.?
1-synthèse avec optimisation de codons
2-utiliser ARNt exprimant les codons rares de la bact
Avantages (3) et désavantages (3) expression des protéines levure
Avantages:
1- bcp de protéines, pas cher
2-ponts disulf et modif post trad (phosphorylation)
3-expression de prot marquées
Désavantages:
1-moins rapide que bact
2-diff codons
3-pas bonnes pr protéines glycosylées
Avantages (4) et limites (3) des protéines insecte
Avantages:
1-ponts disulf, modif post trad
2-très bon pr protéines glycosylées
3-vecteurs his-tag et gst-tag
4-meilleurs codons pour grosses protéines humaines
Limites:
1-pas rapide
2-milieux spéciaux + cher
3-production de protéines marqués difficile
Expression dans les cellules humaines (vect, cell)
Vecteur pTT:
-pour expression intracell ou secretion extracell
-10x plus efficace que pCDNA
-peut produire de 20 à 60 mg de protéine recombinante par L
-fait protéines avec His-TAG
Cellules HEK:
-pas pb de codon rare
-chaperons pour un repliment optimal
-possibilité de densité cell + élevée
Avantages (4) et limites (4) expression dans les cellules humaines
Avantages:
-ponts disulf, modif post-trad et protéines membranaires
-protéines ne sont pas immunogènes
-vecteurs production His-tag
-meilleurs codons
Limites:
-pas rapide
-besoin d’un fermenteur pr grosse prod
-milieux spéciaux = cher
-production de protéines marquées est impossible
Schéma général de purif
Suspendre et lyser cellules par centrifugation= surnageant + culots
Surnageant centrifugé = protéines solubles = purif illimitée
Culots centrif+détergent (prot mal repliée + lipides) = corps d’inclusion (juste prot mal repliées) —> solubilisation avec agent dénaturant (urée ou guanidium) = purif limité —> renaturation avec tampon physio et essais bio
3 grandes étapes purif
1-isoler et concentrer (sal, aff, ion)
2-retirer grosses impur (aff, ion)
3-retirer petites impur (gel, phase inv)
Tampons pour purification (6)
1-tampon physio pH 6-9 (stabilité prot)
2-tampons tris-HCl, phoshate, HEPES (maintenir pH phsyio)
3-sels: NaCL, KCl (solubilité, stabilité)
4-dénaturants (urée, guanidium)
5-inhibiteurs de protéases
6-antioxydants: DTT et BME (rompent ponts disulf)
Concept de la précipitation saline des protéines
resuspendre chq culot contenant les prot ayant une concentration graduellement + grande de sel et voir sur électrophorèse pr identifier les prot.
chq protéine a différente interaction avec sulfate d’ammonium et aura bsn d’un certain % pr précipiter (méthode semi-sélective)
4 Méthodes les plus communes de chromatographie
1- chromato d’affinité
2- chromato d’échange d’ions
3- chromato par filtration sur gel
4- chromato en phase inverse
(1,2,3 conformation native et 4 conformation dénaturée)
Élution linéaire vs par gradient
linéaire = 1 tampon, - cher, + rapide, séparation -efficace
par gradient = plsr tampons, + cher, - rapide, sép + efficace
Détection du signal
Détection par UV de l’absorbance
A= E l C
Groupements importants pour l’absorbance des protéines
-Amides et chaînes lat des aa (<250 nm)
-aa aromatiques (>250 nm)
Filtres UV importants (3)
210 à 230 : amides et aa ( le + sensible)
250 : phe, tyr et trp (- sensible)
280: seulement typ et trp
Principe chromato d’affinité
Liaison spécif entre protéine et résine qui est facilement réversible. On exploite une propriété biochimique spécif de la prot d’intérêt.
2 types de protéines purifiées par chromato d’affinité
Protéines natives: ATP, NADP, Métaux
Protéines de fusion: GST, HIS
Rôle du bras espaceur
Minimise liaison entre la matrice et les protéines
Étapes de l’élution
1- étape d’équilibration (pas de signal les particules passent sur la résine)
2-étape de liaison (les particules non liées sortent)
3-étape d’élution (les protéines d’intérêt éluent, compétiteur prend la place sur la résine)
