Nachweismethoden Flashcards
1
Q
Warum ist die Strucktur-Aufklärung so wichtig ?
A
2
Q
Wie kann man die Gesamtproteinmenge quantifizieren und warum macht man das ?
A
- Um die Brauchbarkeit einer Probe einsehen zu können ist es sinnvoll, Infos über die Konzentration des Proteingemischs zu erlagen
- 2 Methoden:
- Bromphenolblau-Reaktion:
- reagiert mit einer pos geladenen Aminogruppe
- verschiebung des Extensionsmaximums von Bromphenylblau
- das kann photometrsch erfasst werden
- Nachteil: nur allgemeine Aminogruppennachweis -> nicht spezifisch für Proteine
- Biuret-Test:
- Probe wird mit Bioret-Reagenz versetzt
- enthält Cu2+- Ionen
- diese lagen sich an Peptidbindungen an -> Farbumschlag
- auch Lichtabsorbtionsverhalten ändert sich
- Messung der Lichtabsorbtion -> Proteinkonzentration
- Bromphenolblau-Reaktion:
3
Q
In welche Verfahren kann man die Struckturaufklärung aufteilen ?
A
4
Q
Worum geht es bei der Reinigung ?
A
Vorbereitung des Probengemisches für die weiteren Untersuchungsmethoden
- Um ein einzelnes Protein zu charackterisieren muss es zunächst von einer Vielzahl anderer Proteinen abgetrennt werden
- möglich weil jedes Protein einzigartig
5
Q
Welche Reinigungsschritte gibt es ?
A
- Reinigungsschritt: Organgewinnung-> das interessierende Protein muss beschafft werden -> Gewebe mit hohem gehalt wird gesucht
-
Reinigungsschritt: Freisetzung der Proteine-> das interessierende Protein muss in Lösung gebracht werden -> Art des Proteins entscheidet wie vogegangen wird
- Extrazelluläre Proteine
- Cytoplasmatische Proteine
- Membrangebundene Proteine
- Organellenspezifische Proteine
- Unlösliche Proteine
-
Reinigungsschritt : Konzentrierung des Probengemisches-> nach der 1. Reinigung ist es hilfreich eine Anreicherung des gewünschten Proteins zu erziehlen
- Fällung/ Aussalzen
- Zentrifugation
- Chromatographieverfahren
- Elektrophorese
6
Q
Wie setzt man in bestimmte Proteine ( Reinigungsschritt 2) frei ?
A
7
Q
Erkläre wie das Aussalzen/ Fällung funktioniert ( Reinigungsschritt 3 ) !
A
- = Ausnutzen des spezifischenLöslichkeitsverhaltens unter Einflussnahme von:
- Hochsalz
- pH
- Themperatur
- Lösungsmittel
8
Q
Was passiert bei der Zentrifugation und welche Arten gibt es ?
A
- Zentrifugationsverfahren werden genutzt um verschiedene Bestandteile des Probengemisches voneinander zu trennen
- Anwendung: ermöglicht trennung von :
- Zellen aus gemischen
- Zellbestandteilen
- Präzipaten ( beispielsweise durch Aussalzen entstanden)
- Anwendung: ermöglicht trennung von :
- Zentrifugationsarten:
- Differentielle Zentrifugation
- Dichte-Zentrifugation
- Fraktionierte Zentrifugation
9
Q
Wie funktionert die differenzielle Zentrifugation ?
A
- Trennung unterschiedlicher Bestandteile (z.B. versch. Zellorganellen) durch differentielle ( unterschiedliche) Drehzahlren
- dichteres MAterial bildet nach geringerer Geschwindigkeit Pellet
- dichteres Material benötigt höhere Zentrifugationskraft um zu pelletieren -> bleibt vorerst im Überstand
- isolierte Fraktionen können weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden
10
Q
Wie funktioniert die Dichte-Zentrifugation ?
A
- Mithilfe einer Zuckerlösung( hohe Dichte) unten und Wasserlösung( geringe Dichte ) oben wird ein Dichtegradient geschaffen-> Entstehung von Zonen unterschiedlicher Lösungsmitteldichte
- Probe wird oben aufgetragen
- anschließend wird zentrifugiert -> Auftrennung entsprechend der Dichte
- Fraktionen werden durch ein kleines Loch im Reagenz abgetrennt
11
Q
WAs ist die Fracktionierte Zentrifugation ?
A
eine Kombi aus differentieller und Dichte Zentrifugation
12
Q
Wie funktioniert die Dialyse ?
A
- Diffusion kleiner Moleküle durch eine semipermeable Membran mit unterschiedlichen Porengrößen
- große Moleküle werden Zurückgehalten
13
Q
Nenne die unterschiedichen Chromatographieverfahren !
A
- Gelfiltrations-Chromatographie
- Ionentausch Chromatographie
- Affinitäts Chromatographie
14
Q
Was passiert allgemein bei der Chromatographie ?
A
- Grundlage = Wechselwirkung zw. einer nicht beweglichen und einer mobilen Phase welche die zu trennenden Stoffe enthält
15
Q
Wie funktioniert die Gelfiltrations-Cromatographie ?
A
- große Moleküle laufen an prösem Gelmaterial vorbei und sind damit schneller
- kleine Moleküle dringen in die Gelporen ein und sind damir langsamer, haben also eine längere Laufzeit
- Trennung nach Molekülmasse
16
Q
Wie funktioniert die Ionentausch- Chromatographie ?
A
- Prinzip: Auftrennung nach Nettoladung: Die Wechselwirkung zwischen geladenen Molekülen fürt zur Bildung von einer “Säule” (Säule = geladenes MAterial= nicht bewegliche Phase)
- Folge: Moleküle die die gleiche Ladung aufweisen wie die stationäre Phase laufen hindurch, ohne dass sie aufgehalten werden -> Moleküle mit entgegengesetzter LAndung werden gebunden
- Rauslösen / Desorption der an die feste Phase gebundenen Proteine: durch Elutionspuffer mit einer steigenden NaCl - Konzentration
- sind gebundene Proteine negativ geladen -> Cl- Konkurriert um Bindungsstellen
- sind gebundene Proteine positiv geladen-> Na+ Konkurriert um Bindungsstellen
- Kationentauscher : bindet positiv geladene Proteine -> Stationäre Phase neg geladen
- Anionentauscher: bindet negativ geladene Proteine: pos. geladen
17
Q
Wie funktioniert die Affitinitäts-Chromatographie ?
A
- Prinzip: Auftrennung nach spezifischen Bindungsaffinitäten: Ausnutzung spezifischer Wechselwirkungen zur selektiven Bindung gewünschter Substanzen
- Chromatographiesäule mit Füllmaterial, das aus einer inerten („nicht reaktiven“) Matrix besteht. An diese Matrix werden Liganden (in der Abb. grau) gekoppelt. Diese Liganden sind Moleküle,die bei der Beladung der Säule mit dem zu trennenden Stoffgemisch selektiv das Zielprotein (in der Abb. grün) binden.
- Alle nicht gebundenen Bestandteile des Stoffgemisches können während der Separation mit einem geeigneten Lösungsmittel [Bei Proteinen i. d. R. eine wässrige Lösung] ausgespült werden.
- Anschließend wird das alleine zurückgebliebende Zielprotein von der Chromatographiesäule gelöst [z. B. durch Zugabe gelöster kompetitiver Liganden oder auch durch pH-induzierte Denaturierung des Zielproteins] und ebenfalls durch ein geeignetes Lösungsmittel eluiert [sog. Elution]
20
Q
Wie funktrioniert die Polyacrylamidgelelektrophorese PAGE?
A
- Zugabe von SDS (sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat) zum Proteingemisch, dies führt zur Entfaltung (Denaturierung) der Proteine
- Denaturierte Proteine enthalten durch die SDS-Bindung negative Ladungen proportional zu ihrer Molekülgröße => Kurz: „Alle Proteine werden durch SDS negativ geladen“ und wandern also allesamt zur Anode
- Die Proteine wandern durch das als Molekularsieb wirkende Polyacrylamidgel zur Anode und trennen sich entsprechend ihrer Größe auf: Die Gelmatrix bremstgroße Proteine schneller als kleine. Die größeren Moleküle werden aufgehalten und müssen „Umwege“ machen, bis sie ausreichend große Maschen treffen
- Anfärben der Proteine zum Sichtbarmachen
- Durch den Vergleich mit einem gleichzeitig aufgetrennten Gemisch standardisierter Markerproteine ist eine Abschätzung des Molekulargewichts der Proteine möglich
21
Q
Wie funktioniert die Isoelektrische Fokussierung IEF ?
A
- Prinzip: Bei dieser Form der Gelelektrophorese macht man sich zu nutze, dass Proteine einen isoelektrischen Punkt besitzen. Sie trennt Proteine also nach Neutralpunkten:
- Für die IEF erzeugt man in einem Gel [Wichtig: Diesmal ohne SDS-Zusatz :D]einen pH-Gradienten, der sich von der Anode zur Kathode erstreckt
- Anschließend lässt man das Proteingemisch durch das Gel wandern
- Aufgrund seiner Ladung wandert jedes Protein Richtung zu dem pH-Wert, an dem isoelektrischer Punkt liegt [Denn hier ist die Nettoladung des Proteins = 0, entsprechend hat das elektrische Feld keinen Einfluss mehr auf das Protein.)
22
Q
Wie funktioniert die 2D-Elektrophorese ?
A
- Die 2D-Elektrophorese ist super, weil sie 1. aus Analyseverfahren besteht, die wir schon kennen und 2. sehr aussagekräftig ist. Bei der 2D-Elektrophorese werden die isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) und die SDS-Elektrophorese (2. Dimension) kombiniert.
- Prinzip:
- Dimension: In der ersten Dimension wird ein Proteingemisch auf einem schmalen Gelstreifen durch IEF aufgetrennt -> 1. Trennung erfolgt nach dem isoelektrischen Punkt
- Dimension: Der Streifen wird anschließend in einer SDS-Lösung getränkt und für die 2. Dimenion an ein SDS-Gel angelegt, sodass die Proteine im elektrischen Feld in das zweite Gel einwandern können. -> 2. Trennung erfolgt nach Größe
- Resultat: Das Ergebnis kann informationstechnisch vergleichen werden
- Fazit: Sehr genaue Analyse komplexer Proteingemische und das wichtigste Protein-Analyseverfahren.
23
Q
Wie Funktionsiert die Analyse das AS -Zusammensetzung ?
A
- Gerätschaft: Aminosäure-Analysator: Bestimmt den Gesamt-AS-Gehalt, aber nicht die Sequenz!
- Prinzip:
- Hydrolyse des Proteins durch Säurezusatz: Aufbrechen der Peptidbindungen = Abbau des Proteins zu AS
- Trennung der Aminosäuren durch Ionenaustauschchromatographie
- Detektion einzelner AS [Laut versch. Quellen erfolgt die Ermittlung der Konzentration der einzelnen AS durch die Ninhydrinreaktion: Ninhydrin reagiert mit den primären Aminogruppen der Aminosäuren zu einem blau-violetten Farbstoff, wobei die Farbintensität der Konzentration an Aminosäuren entspricht]
24
Q
Wie funktioniert die Analyse der Proteinmasse ?
A
= Analyse der Aminosäuresequenz (= Primärstruktur)
- Gerätschaft: Massenspektrometrie (-Gerät :D19)
- Prinzip:
- Überführung der Proteine in einen gasförmigen, ionisierten Zustand durch Laseranregung
- Beschleundigung der gasförmigen Peptidionen in einem elektrischen Feld: Die dabei erreichte Geschwindigkeit hängt vom Masse-/Ladungs-Verhältnis ab
- Vakuum: Nach der Beschleunigung in 2. durchfliegen die Peptidionen ein Vakuum, wo sie sich aufgrund ihrer unterschiedlichen Geschwindigkeiten auftrennen
- Die unterschiedlichen Flugzeiten werden erfasst
- Und mit Referenzmolekülen abgeglichen [-> Man benötigt zum Abgleich also unbedingt eine Datenbank!]: Hierdurch lassen sich schließlich Rückschlüsse auf die Masse der untersuchten Proteine zu, wodurch wiederum ersichtlich wird, welche AS vorhanden sind. Eine Angabe zur AS-Sequenz kann man so nicht machen
- Limitation: Nur kleine Peptide (< 15.000 Da) nachweisbar
31
Q
Wie fuktioniert der ELISA: Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay ?
A
- Aufbau und Ablauf:
- Mikrotiterplatte mit kleinen, napfförmigen Vertiefungen („Näpfen“), in denen der Antikörper wohnt [Er ist „immobilisiert“], den wir nutzen wollen, um unsere Probe zu untersuchen
- Pipettierung des Probengemisches, das (hoffentlich) das gesuchte Antigen („Analyt“) enthält, in die napfförmigen 24Vertifungen
- Der Antikörper fischt sich sein Antigen und bindet diesen
- Abwaschen der nichtgebundenen Proteine-Zugabe eines enzymgebundenen Antikörpers [Der logischerweise ebenfalls spezfisch für unser gesuchtes Protein (= Antigen) sein muss] [Die Zugabe eines weiteren Antikörpers, der ebenfalls an unser Protein bindet, erklärt auch den Namen „Sandwich-ELISA“: Das gesuchte Protein (= Antigen) ist zwischen den beiden Antikörpern eingeschlossen]
- Es wird ein passendes Substrat hinzugegeben, das vom Enzym umgesetzt werden kann und zu einer Farbreaktion führt, die mit einem Photometer gemessen werden kann
- Bsp. für ELISA aus dem Alltag: Der Schwangerschaftstest (Schnelltest)
- Der Schnelltest ist ein immunchromatographischer Test
- Bei einer Schwangerschaft befindet sich ab dem 10. Tag das Hormon hCG im Urin
- Schwangerschafts-Farbstreifen: Auf dem Teststreifen des Schwangerschaftstest befindet sich ein immobilisierter Antikörper, an den hCG bindet. Anschließend bindet ein Enzym-Linked-Antikörper an hCG (-> Entstehung des Sandwiches, s. o): Es kommt zu einer Färbung-Kontrollstreifen: Wurde der Test korrekt (mit ausreichender Urinmenge) durchgeführt, sollte sich ein Kontrollstreifen bilden. Da dafür ebenfalls der Antikörper genutzt wird, der auch an hCG [Der Enzym-Linked-Antikörper] bindet, für den Kontrollstreifen aber eine weitere Strecke zurücklegen muss, stellt dies sicher, dass genügend Urin auf den Teststreifen aufgetragen wurde. Der Antikörper bindet an einen weiteren immobilisierten Antikörper, sodass auch hier eine Farbreaktion hervorgerufen wird.
- Bsp. für ELISA aus dem Alltag: Der Schwangerschaftstest (Schnelltest)
33
Q
Erkläre Western-blot !
A
- Methode zur Protein-Qualitätsbestimmung (Größe (-> SDS-PAGE) + immunologische Eigenschaft (-> Antikörperbindung))
- Zuerst: SDS-PAGE [s. o.] zur Trennung der Proteine
- Anschließend: Übertragung der Proteine aus dem SDS-Gel auf eine dünne Membran [Grund: Solange sie sich im Gel befinden, sind sie unzugänglich für die großen Antikörpermoleküle, die wir für unsere Analyse benutzen]
- Technik der Übertragung: Platzierung des SDS-Gels auf der Membran; Anlegung einer Spannung senkrecht zur Gelebene [Elektrophorese]: Die negativ geladenen Proteine wandern zur Anode, d.h. zur positiv geladenen Elektrode. Zwischen Gel und Anode liegt die Membran. Ergebnis: Die im Gel nach ihrer Größe aufgetrennten Proteine befinden sich auf der Membran, wobei das in der Elektrophorese erzeugte Bandenmuster erhalten bleibt.
- Zugabe des primären Antikörpers: Er bindet an die Proteine, die das von ihm erkannte Antigen enthalten
- Zugabe des sekundären Antikörpers: Dieser bindet an den primären Antikörper [Achtung, Achtung: Nicht wie bei ELISA an das Antigen!]. Der sekundäre Antikörper ist i. d. R. an ein Enzym gekoppelt oder selbst fluoreszenzmarkiert
