Western blot laboration

Question 1

Vilka kemikalier används för att det skall vara möjligt att separera proteiner efter storlek?

Vad gör kemikalierna?

Answer 1

DTT: Bryter disulfidbindingar, detta gör att de blir till sin primär struktur

SDS: Binder till proteiner med ett bestämt antal molekyler/aminosyra och gör dem negativit laddade. Effekten blir att laddning/massa blir konstant på proteinet. Oavsett hur stort proteiner är så kommer det att vandra lika fort i en lösning som man lagt en spädning över. De negativa molekylerna kommer vandra mot den positiva polen i SDS-PAGE

Question 2

Vilken funktion har running buffert?

Answer 2

Används för att de ska finnas joner som bär strömmen , men också för att upprätthålla pH vid en relativt konstant värde

Question 3

Vilka protein vandrar snabbast i gelen? Små eller stora?

Answer 3

Små de stora “fastar” i nätet. (Bis-akrylamid bildar tvärbryggor som förbinder polyakrylamid-kedjorna. Skapar ett nätverk som molekylerna måste ta sig igenom)

Question 4

Vilken gas är de som ses när elektroforesen startar?

Answer 4

Syrgas och vätgas

Question 5

Vad händer om man glömmer att stoppa SDS—PAGE elektroforesen efter angiven tid och låter den vara igång t.ex. två timmar istället för rekommenderade 60 minuter?

Answer 5

Vi kommer inte få någon separation eftersom allt kommer vandra ner

Question 6

Varför används metanol/etanol som första steg när PVDF membranet prepareras före transfer?

Answer 6

PVDF membranet är super hydrofobt så när vi sköljer med metanol/etanol blir membranet mer hydrofilt vilket förbereder för vattenbehandling.

Question 7

Vilken funktion har blocklösningen? Vad skulle hända om man inte inkuberade membranet i blocklösningen?

Answer 7

Detta förhindrar ospecifik inbindning genom att binda in till membranet, det förhindrar också en bakgrundsfärgning.

Question 8

Varför är primär antikropp och sekundär antikroppar producerade i olika specis?

Answer 8

För att dem skall kunna binda till varandra, alltså för att vi senare skall få en visualisering. Kan inte den sekundär antikroppen binda in till den primära antikroppen kommer vi inte kunna detektera.

Question 9

Antikroppar kan vara antingen polyklonala eller monoklonala. Vad menas med det? Vilka för och nackdelar finns med respektive antikroppstyp?

Answer 9

Monoklonal: bara specifik på en sak, binder till ett specfikt antigen

Polyklonala: blandning av antikroppar, som kan binda till flera olika antigen

Question 10

Vad menas med kromogen detektion, chemoluminiscent detektion?

Answer 10

Kromogen detektion: färgmolekyler -> får produkt

Chemoluminiscent detektion: -> får ljus och produkt

Question 11

Vad används Western Blot till?

Answer 11

Separera och identifiera proteiner i en mix av proteiner med hjälp av immunohistokemi.

Question 12

Innan proteiner separeras med hjälp av gelelktrofores (SDS PAGE) måste provmatrialet prepareras. Hur går du till väga med en vävnad resp celler?

Answer 12

Vänad

Behöver brytas ned mekaniskt, exempel:

• Sonikering
• Homogenistering

Celler

Lyseras kemiskt dentergenter

Question 13

Hur kan du extrahera proteiner efter dem provpreparerats inför gelelektroforesen (SDS-PAGE) ?

Answer 13

Exempel:

• Precipation
• Kromatografi
• Centrifugering

Question 14

Vilka är stegen i western blot

Answer 14

1. Prov matrail prepareras inför SDS-PAGE
2. Proteiner extraheras från cellysatet/homogenatet
3. Proteinerna separeras enligt molekylvikt i SDS-PAGE
4. SDS och DTT tillsätts
5. Proteiner transfereras till PVDF membran
6. Immunohistokemi
7. Detektion

Question 15

Vad finns de för transfermetoder för att föra över proteiner till PVDF membran?

Answer 15

Exempel:

• Diffusion
• Vakum
• Semi torr

Vanligast är vätskebaserad elektroblottning

Question 16

Hur fungerar vätskebaserad elektroblotting?

Answer 16

1. Tanken fylls med transferbuffert innehållande metanol sim neutraliserar SDS.
2. Gelen, membranet och ett filter papper läggs i kassett och förs ned i tanken
3. Elektrisk spänning läggs över kasetten och proteinerna vandrar till den positiva anoden, från gelen till membranet som immobiliserar proteinet genom hydrofoba interaktioner.

Question 17

Berätta om immunohistokemi

Answer 17

1. Membran blockas för att undvika ospecifik inbindning av ointressant matrial
   * Bovitin serum albumin eller mjölkpulver
2. Membran inkuberas i lösning med primärantikropp (antikroppen binder till epitoper på eftersökt protein)
3. Membranet sköljs med PBS el TBS innehållande dentergenten Tween för att föhindra bakgrundsfärgning/ospecifik inbinding.
4. Membran inkuberas i sekundär antikropp (detektionsantikropp)
5. detektion

Question 18

Får primär och sekundär antikropp ha samma specis? Varför varför inte?

Answer 18

Nej.

Primär antikropp ska uppvisa specifitet för protein som eftersöks (mus)

Sekundär antikropp måste vara anti-mus för att kunna binda in till primär antikropp

Question 19

Vad händer om primär och sekundär antikropp har samma specis?

Answer 19

Sekundär antikropp kan ej binda in och vi får ingen detektion

Question 20

Vilka former av detektionsantikropp finns de?

Vad är vanligast?

Answer 20

• Direkt konjugerad med ett enzym, fluorescent etc.
• Konjugerad med biotin som sedan binder till detektionskonjugerat streptavidin.

Vanligast är enzymkonjugerade antikroppar då man efter sköljning tillsätter substrat som enzymet kan konvertera till en färgad eller chemoluminiscent produkt.

Question 21

Vad gör 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP) i analysen?

Answer 21

Konventerar detektionsantikropp till färgad produkt

Question 22

Varför inkuberar du proverna på värmeblock?

Answer 22

Detta denaturerar proteinerna

Question 23

Varför lägger du PVDF membranet i etanol innan transfer?

Answer 23

Pga att de är super hydrofobt?

Question 24

Hur packar du din kassett inför elektroblotting?

Answer 24

Question 25

Vad har hänt om din gel rullat ihop sig i mickron?

Answer 25

Den har vart där för länge eller på för hög värme

Question 26

Du skall späda en antikropp 1:5000 och behöver 10 ml hur mycket ska du ta av antikropp resp lösning som dden ska lösas i?

Answer 26

Question 27

Hur bereder du en transferbuffert som ska bli 1 L?

Du har detta:

Tris-base 3,03 g

Glycin 14,26 g

Metanol 200 ml

Answer 27

Tar allt x5