Bioch Prot Flashcards

Question 1

Q

L histoire des aa, peptides et prot

Answer

A

Les protéines ont des rôles très variés :

enzymes, canaux, structure, défense, transport, signal.
Il y a environ 25’000 polypeptides différents chez l’humain ou la plante Arabidopsis.

On pense que la première « forme » de vie était probablement sous forme ARN mais les protéines ont rapidement pris le dessus et à s’occuper de toute les fonctions.

La seule fonction qu’elles ne font pas est la reproduction :

elles utilisent pour cela les ARN.
En effet, la liaison peptidique est une liaison crée par une ARN pure.

Les protéines se retrouvent sous plusieurs formes et à plusieurs lieu :

des enzymes qui ont un rôle spécifique, des canaux qui permettent le contact avec le milieu externe, des protéines structurales sur la membrane.
En effet, la cellule régule constamment, grâce aux protéines, ses quantités d’ions dans le cytoplasme. Pour cela, des barrières sélectives sont nécessaire, des lieux de faiblesse de la cellule.

Tant que le potentiel membranaire est maintenu et donc que la situation de non-équilibre est maintenu, la vie pourra perdurer.

Cependant, pour maintenir une situation en non-équilibre il est nécessaire d’apporter de l’énergie au système.

En effet, si nous prenons l’exemple des acides aminés, il est nécessaire de les garder en dehors de tout contact avec l’oxygène externe sinon une réaction de combustion aura lieu.

La source mère de toute énergie est le soleil. Notons que les organismes utilisent l’augmentation de l’entropie du soleil (libération d’énergie) pour baisser leur entropie et maintenir un « désordre » dans leurs cellules.

Les protéines, comme toute autre molécule, sont soumises à l’usure.

En effet, le stress (par exemple la chaleur) ou encore l’oxydation cause la dénaturation des protéines qui vont exposer alors leurs parties graisseuses à l’eau.
Ces parties graisseuses vont prendre la conformation la plus favorable possible :
- l’agglomération.
Ainsi, on a une compaction des parties graisseuses de toutes les protéines qui les rendent inefficace.

On retrouve toute sorte de protéines :

 La luciférase : émet de la lumière, rôle attractif chez les insectes.

 L’hémoglobine : transport d’O2 et de CO2

 La kératine : rôle de structure, rôle défensif chez les animaux

Les protéines permettent aussi de créer des structures bien plus complexes comme des moteurs moléculaires (Kinesin) ou la soie d’araignée.

Question 2

Q

Les aa

-structure, stereoisomerisme, connaitre les diff aa, aromatique (absorbtion)

Answer

A

L’unite de base :
- l aa qui permet la formation de polymeres lineaires et parfois branches
Structure :
- Atome central alpha
- Groupe amine : NH3+
- Groupe carboxyl (COO-)
- Chaine laterale (R)
  - heterogeneite au polymere du genome humaine ayant une diversite de fonction
  - determine fonction et structure
Le stereoisomerisme chez les acides alpha-amines
- la majorite des aa sont de gauches (L-aa) mais il existe aussi des D-aa. Ce qui est plus rare
- le fait de posseder les deux (L et D) est un mecanisme de defense contre la degradation
Cf les diff aa :
- polaires, non polaires, positif, negatif, sulfure, aromatique, acides, alcool…
Quelques informations concernant les acides aminés :

 Les carbones (CH2, CH3, ..) augmentent énormément l’hydrophobicité de la molécule.

 Le soufre permet quelque interaction hydrophile.

 Les acides aminés sont plutôt semblables et donc peuvent être inter changé avec plus ou moins de conséquence (mutation).

 Les sites actifs d’une molécule ou d’un complexe sont souvent remplis d’histidine.

 La tyrosine, malgré son hydrophobicité, possède une région –OH hydrophile.

Question 3

Q

les aa aromatiques

Answer

A

Les Aromatiques :
- Phenylalanine, Tyrosine, Tryptophan
  - a 260 nm les acides nucleique absorbent tres fort. a 280 ce sont surtour les Trp et la Phe. C’est un moyen de quantifier une prot
  - détectés par UV à 280nm.
    On peut donc très facilement les détectés et connaitre leur quantité dans une protéine.
  - En connaissant son coeff d extinction spe et a condition qu elle soit pure ou qu elle ne s ecarte pas trop de la distribution moyenne en Trp et Phe

Question 4

Q

Proprietes aa

Answer

A

Lors de la construction d’une protéine, un problème de facteur limitant peut ralentir la vitesse de synthèse.
En effet, si les pourcentages du tableau ne sont pas respectés, la construction de la protéine peut être ralentie voir se stopper.
Dans un polypeptide, seules les charges terminales et celles des groupements latéraux vont compter pour le point isoélectrique.
- En rouge, sur le schéma, sont les groupes ionisables à pH 7.0.
- En effet, comme les acides aminés, les peptides et les protéines ont un point isoélectrique (pI) ou ils ne bougent pas dans un champ électrique.
- Le point isoélectrique d’un acide aminé est défini comme étant le pH auquel cet acide aminé existe sous forme zwitterion (charge neutre).
- Ce pI dépend de la nature de la chaine latérale R. On pourra noter que :

 Les acides aminés acides ont un pI vers 3

 Les acides aminés basiques ont un pI vers 9

 Les acides aminés neutres ont un pI légèrement acide vers 5-

6

Normalement nous sommes censer retrouver 5% de chq prot. Cependant, il est possible d’en retrouvver plus ou moins :
- la cysteine est presente a 1.8%
- le Trp est present a 1,3%
- la leucine est presente a 9,1%
Ces variations viennent du fait que certains sont appliques dans des sites actifs et d autres dans un role structurel (travail moins specifique)
Dans un polypeptide, seules les charges terminales et celles des groupement lateraux vont compter pour le point isoelectrique.
comme les aa, les peptd et les prot ont un point isoelectrq ou ils ne bougent pas dans un champ electrique
pI :
- est definit a pH a charge neutre = zwitterion
- depend de la nature de la chaine
- les acides sont proches de 3
- les basique proche de 9
- les neutres sont proches de 5-6
Formation du lien peptidique par condensation
- les chaines laterales servent a developper des relation avec le voisinage : quelle struct et fonction quelle va aquerir ?
Il est aussi important de connaître la charge total d’une molécule par exemple lors d’une électrophorèse afin de savoir laquelle de l’anode ou de la cathode est préférable.
En autre, connaître l’ensemble des acides aminés d’une protéine permet de tester la qualité et la quantité d’acide aminé dans un organisme.

Question 5

Q

Le processus de traduction

-ribosomes

Answer

A

L’histoire de la formation de l ADN en prot
Traduction :
- apres il est possible de “degrader pour en faire des news”, ce qui demande +++ energie = Homeostasie des prot
Ribosomes :
- enzyme composee de RNA mais decoree dde prot
- lien peptidique que dans le ribosome
- le coeur de la machine est RNA pouvant reconstt le passer de la vie sur terre
  - un ribozyme qui au cours de l evolution c est decore de +++ de prot periph aux fonctions regulatrices
- formation de la liaison peptq se fait en milieu 100% denue de prot
-  Le ribosome ne consomme pas d’ATP, c’est l’acide aminé qui le fait lors de son ancrage au ribosome.
-  Le ribosome possède deux sites de liaisons : un pour l’acide aminé et l’autre pour l’ARN-t.

 La protéine ne peut peut pas être rigide mais avoir au moins 2 formes : une d’affinité avec le ribosome et l’autre antagoniste au ribosome.

Pensez a revoir une video sur le meca de traduction

Question 6

Q

Alignement des sequences de prot

Answer

A

les aa sont simplifes en 3 lettres ou 1 lettres
on en forme des sequences de prot qu on cherche a aligner. Il existe de nos jours un programme d’alignement.
Ces prog sont efficaces parce que certains aa se ressemblent et peuvent se remplacer les uns les autres dans l evolution, en fonction des dictats spe d un eposition particuliere dans la sqc prot.
- Isoleucine et la valine : chaine laterale similaire
- parfois des mutations peuvent etre conservee dans le temps : Thr et Ser
  - OH : modification dans l evolution
  - aa charges (D et E) ou E possede un CH2 en plus due a l evolution.

Question 7

Q

Les ponts disulfures

-caract, dans le sang (insuline)

Answer

A

Les ponts disulfures se retrouvent sous deux formes :

 La forme réduite qui est peu stable hors de la cellule, dans le RE et dans les vacuoles car sont des régions oxydantes.

 La forme oxydée qui est peu stable dans la cellule, dans le cytoplasme et les organelles (sauf le RE)

En effet, les ponts disulfues se forment en condition oxydantes.
Ils stabilisent souvent les protéines sécrétées (anticorps, insuline, etc.).
On notera donc que lorsque l’on parle de pont disulfure, on se trouvera dans des conditions oxydantes et donc soit à l’exterieur de la cellule, soit dans le RE.
Ces ponts disulfures se retrouvent dans les anticorps afin de maintenir la cohésion de la structure tridimentionnelle.
De même lors de la formation de l’insuline :
- la preproinsuline devient proinsuline lors de la formation des ponts disulfures dans le reticulum endoplasmique puis devient insuline dans le sang.
- Une fois l’insuline secrété il est important qu’elle ne soit pas réduite car sinon les ponts disulfures se defont et la protéine est détruite.
- En laboratoire, il est possible de la reduire avec du DTT.
On retrouve aussi des ponts disulfures dans la kératine des cheveux.
- En les cassant par un agent reducteur, il est possible de les onduler.
- Attention a ne pas en abuser, ce même agent réducteur et utiliser dans les crêmes épilatoires.
cysteine possede un souffre en chaine laterale qu peut etre reduit

Question 8

Q

Autres aa

21,22,23
rares

Answer

A

aa naturels :
- 21 : L-selenocysteine
  - code un codons (UGA) stop et SECIS element chez la bacterie
  - chez les arche et les euka il est en 3’ UTR dans la RNA
- 22 : L-pyrrolysine :
  - code UAG (stop) et PYLYS element chez arke
- 23 : Formyl-L-methionine :
  - code AUG (start) chez la bact, mitocho, chloro, mais le groupe formyl est souvent enleve post-trad
aa rares : crees par modifications post-translationnelles dans les prot
- 4-hydroxyproline : collagenes
- gamma- carboxyglutamate : prothrombinee (extra c)
- 5-hydroxylysine : parois plantes
- 6-N- methyllysine : constt de la myosine dans les muscles
Certains aa rares peuvent appaitre lors d hydroxylation, de carboxylation ou de methylation (modf post trd). Il peut arrv que certains elements de la colonne 6 du tableau periodq (S ou O) puissent etre incorpores a des aa. On les retrouvent parfois dans qq enzymes

Question 9

Q

Les donnees moleculaires des prot :

en general
histoire evolutive

Answer

A

POIDS MOLECULAIRE : En moyenne il faut compter 110 DA par aa
- chq prot a une configuration en aa qui lui est propre. Si on connait la sqc de la prot on peut alors deduire la concentration de la prot en examinant les concentrations separees de chq aa qui la compose.
- l unite utls : kDa
  - 1 Da = la masse d un atome de H (1 uma)
- il est cependant pas impossible de trouver des aa plus grands (125 Da/aa : Cytochrome C) ou plus pett (90 Da/aa : chymotrypsinogene)
  - la plupart des molecules pesent entre 20 et 100 kDa
Cette difference de taille pourrait venir de l histoire evolutive.
- au debut les prot etaient petites
- plus tard elles ont commence a s assembler ensemble formant des prot multidomaines (creer des activites entre elles)
- mais doivent se trouver :
  - ++ affinite
  - +++ concentration
- plus la complexite augemente, plus lle risuqe de se tromper dans leur organisation est possible.
- Prenons l’exemple de la chaperonne GroEL de Echerichia Coli et de HSP60 :
  - beaucoup de zone de séquençage de ces deux protéines ont été conservées durant l’évolution et témoigne de la proche parenté des deux protéines.
  - Les zones homologues se trouvent souvent au cœur du séquençage. Les extrémités sont moins conservées.

Question 10

Q

La composition d aa entre 2 prot

utls
ex

Answer

A

Certaines prot sont associees a des molecules autres que des aa
adjonction post trad pouvant etre covalentes
d autres sont non covalentes avec +++ affinites
prot pliant correctement ont une affinite intraseque
le rapport entre aa :
- est une sorte de code base permettant leur identification
Chq prot a une composition specifique en aa qui lui est propre. Si nous connaissons la seq, on peut deduire la concentration de laprot pure avec une analyse quantitv de la concentration de chq aa
Ex :
- Met :
  - 2 residus par molecules de prot pour la Bovine cytochrome C
  - 2 residus par molecules de prot pour la Bovine chymotrypsinogene
- Ser :
  - 1 residus par molecules de prot pour la Bovine cytochrome C
  - 28 residus par molecules de prot pour la Bovine chymotrypsinogene
- la difference est de 2 fois moins pour la Bovine cytochrome C
- et de 14 fois moins pour la Bovine chymotrypsinogene

Question 11

Q

Struct 3D

Quest ce qui est faux dans ce shcm ?
meca. Osmolytes

Answer

A

L’acquisition d’une structure tridimensionnelle :
- est un procesus spontané par etapes, sujet aux erreurs, durant lequel un polypeptide déplié acquerras plusieurs structures secondaires en parallèle, puis les associera en une structure tertiaire distincte, appelée native qui sera aussi fonctionnelle.
- Ces repliements se font nottament grâce aux zones hydrophobes. Sans cette hydrophobicité et uniquement grâce au chaperonne, le temps de repliement sera extremement lent voir impossible.
- Cependant, la rapidité de pliage doit parfois être freinée car peut aussi mener à un mauvaise pliage. Ce frein se fera par des chaperonnes.
Le pliage :
- débute lors de la formation de la protéine, c’est-à-dire lorsque la protéine commence à être synthétisé dans le ribosome.
- Une prot doit son repliement et sa struct finale aux interactions entre les chaines lat des aa (pont H, disulfures) ainsi qu aux angles que forme la chaine laterale lors de la liaisonpeptidq
- Le schéma ci-contre n’est donc pas totalement vrai car la protéine, à moins d’être sous stress (exemple : chaleur), ne sera jamais totalement depliée.
- Schema :
  - en voyant le schema nous pouvons nous dire qu’il est juste, une prot naissante du ribosome est imature est donc depliee.
  - or, lorsq une prot sort du ribosome, elle sort par son extremite N-terminale et au fur et a mesure de sa sortie dans le RER, des structures secondaires se mettent en place et le reste n’est pas encore ne
  - il est tres rare que la prot reste dans un systeme spaghetti
  - le final sont LES ETATS NATIFS !!
    - une fois les plis termines, la prot devient totalement active
    - mais attention ce n est pas un etat unique
- l acquisition de structures 3D des polypetides est un processus de pliage +/- lent.
- Notons qu’un polypeptide possède plusieurs états :
  - beaucoup ne sont pas actif et d’autres ont trouvés leur chemin de repliement et le sont.

En 1972, Christian Boehmer Anfinsen est lauréat du prix Nobel de chimie :

ses travaux sur la ribonucléase (une protéine enzyme) consistaient à dénaturer celle- ci en présence d’un agent dénaturant :
- l’enzyme perdait alors sa conformation active (=native, représentée par la structure tertiaire de la protéine).
- Mais dès lors que l’agent dénaturant était retiré, l’enzyme retrouvait sa conformation native.

À la suite de ces travaux, Anfinsen édita des lois, sous le nom de « Dogme d’Anfinsen », en deux points :

 La conformation dans l’espace d’une protéine est entièrement due à sa structure primaire, c’est-à-dire la séquence d’acides-aminés qui la composent.

 Ensuite, que sa conformation dans l’espace est la conformation correspondant au minimum d’énergie, avec un maximum de liaisons hydrogène.

Osmolytes :
- pett prot solubles qui permettent aux prot soumises a un stress (env) de conserver leur struct tridi. Elles comprennent certains glucides de petites tailles, certains aa (glycine, proline, taurine) et encore des methylamines

Question 12

Q

Prot : sturct secondaires

-diag de Ramachandran

Answer

A

les types majoritaires :
- helice alpha
- conformation Beta
- beta turns
Toutes ces structures sont stabilisées par toutes sortes de liaisons non covalente, mais specialement par des ponts hydrogènes (interaction faible entre un –H et un –O).

Ces liaisons sont très faibles mais leur quantité agit comme un velcro et permet une forte adhérence.

Les chaînes polypeptidiques, dans des liaisons peptidiques, sont flexibles mais limitées conformationnellement.
- En effet, les 6 atomes du lien peptidique sont planaires (sur un seul plan) pour une chaine latéral R non planaire : C(alpha) – CO – NH – C(alpha+1) – R.
- Toute lastructure est principalement stabilisée entre quelque atome du « backbone » » c’est-à-dire entre l’amide N-H et le carbonyl O, formant ainsi des ponts hydrogènes.
Par le principe de l_’encombrement stérique :_
- c’est-à-dire la gêne provoquée par la disposition et le volume d’une partie d’une molécule lors de l’approche d’un réactif ou d’une autre partie de la molécule, lamajorité des protéines sont sous forme trans.
- Cependant, lorsque le backbone d’une protéine contient de la proline, la protéine devient cis àcertains endroits.
  - En effet, la proline force les choses car la chaine latérale se retrouve liée de manière covalente à l’azote et donc force un tournant.
  - On verra toujours un angle forcé dans la protéine lorsqu’il y a de la proline.
  - Cet acide aminé est donc très important pour le repliage des protéines.
Diagramme de Ramachandran :
- les 2 zones principales correspondant aux structures secondaires regulieres qui sont principalement obs dans les prot :
  - la region des helices alpha et celle des geuillets beta
- la troisieme region, plus petite, corrsp a une conformation en helice gauche.
- les glycines, qui ne ocmportent pas de chaines laterale, ont une plus grande liberte conformationnelle. Elles echappent donc a cette regle et peuvent se trouver en dehors des regions favorables du diagramme
Ce diag est un indicateur itls pour controler la qlt des struct de prot determinees par critallographie ou RMN
Dans les struct de haute qlt, plus de 90% des residus d aa (hors glycines) sont situes a l interieur des zones le splus fav. Plus la resolution est elevee et plus le nombre d aa en dehhors des zones privilf est faible.

Question 13

Q

Backbones

-struct

Answer

A

possd des limites de ses movements :
- ne possede pas une vraie liberte
- a certaines restrictions
- cyclisation de la partie R qui bloque les possiblite de rotation
Struct :
- 6 atomes coplanaires pour une liaison peptidique : C(alpha-n) - CO- NH- Calpha(n+1)
  - du carbone alpha d’un residue de un carbone au residu suivant
- la deuxieme structures sont stabilises par des liaisons hydrogenes entre le backbone groupe amide NH et O carbonyle
Trans et cis liaisons :
- la plupart des liaisons peptidiques sont +++ des isomeres trans (99,9% sous des conditions non produites par efforts)
- si nous tracon une courbe enl activt en fonction du temps,
  - si 5’ avec l uree (denaturant) : la courbe reste correct car la prot possd encore des caract pour retrouver sa forme initiale
  - si 60’ avec l uree : la courbe varie ou les prot des cis-trans sont devenues 50/50. Certes, elles possedent encore une certaine memoire mais pas aussi efficace que dans le premier cas
- Trans : capable de memoire
- Cis : +++ diff

Question 14

Q

Helice alpha :

-struct, localisation

Answer

A

une structure secondaire ++ repandue :
- 4 modeles montrant diff aspects de sa structure

Amino terminus/ Carboxyl terminus :
1. axe central de l helice dextrogyre
2. chaine laterale ext, orientees au tour d un axe stabilisant l helice
5.4 A (3,6 residus) :
1. liaisons hydrogene intra chaine stabilisent l helice
2. le coeur de l helice est stabilise par des liaisons VdW.
Vue polaire :
1. la position des R sont a la peripherie.
2. le coeur est stabilise par des forces de VDW
Volume atomique :
1. si nous tenons compte du volume atomique reel, l helice n est pas creuse

Certains séquences d’acides aminés sont «pro-helice alpha ».
- En effet, des interactions entre les groupes R d’acides aminés séparé de trois résidus (donc de presque un tour complet) sont propice à la formation d’helice alpha (par exemple Arg103 et Arg100).
En outre, l’interactions entre les groupes R d’acides aminés séparé de trois résidus peuvent former des hélices amphipatiques :
- Ainsi, les groupes R pourront se
  regrouper en une surface hydrophile et une autre hydrophobe.
- Resultat : l’hélice alpha devient un cylindre qui, avec ces deux surfaces, lorsque mit dans une cellule, s’insere dans les membranes
- ancre dans la membrane (IPM anchor) enfonce une partie membranaire grace aux helices hydrophobes et partcp a la constt des prot memb
- Transient receptor potential cation channel subfamily V member 2 (TRPV2) is a protein. Les helices trans-membr sont amphiphilique est importantes pour les canaux

Question 15

Q

Beta conformation :

struct
ex

Answer

A

Plus complexe que l’hélice alpha, on retrouve le feuillet beta :
- En effet, ici, l’interaction ne se fait pas avec le voisin mais à distance.
Quelques caractéristiques du feuillet beta :

 Le backbone de celui-ci est presque totalement étendu (non enroulé).

 Tous les résidus dans les feuillets beta ont un peu près les mêmes angles phi et psi

 La distance entre les résidus AA est de 3,5 ångström (plus éloignés et donc plus étirés qu’en hélice alpha.

 Les chaines latérales pointent dans des directions opposées, une fois en bas, une fois en haut (par exemple tous les hydrophobes en bas et tous les hydrophiles en haut).

 Le groupe N-H et C=O de la liaison peptidique pointent dans des directions opposées.

Ex dans prot :
- les feuillets beta twisted :
  - prot soluble : (en maj)
    - structu feuillet betta int
    - helice alpha ext
  - les feuillets peuvent etre tordus pour moduler une structure
  - si feuillet parfait :
    - cylinde ou tonneau
- les para :
  - prsc place au milieu pour molecules d eau
- anti para ;
  - tournante donnait par la nture des aa quils composent

Question 16

Q

Les feuilles beta

struct
frqc

Answer

A

30% des residus dans une prot compacte participent a des boucles qui relient les struct comme les helices et les feuillets.
Les tournants sont souvent a la surface.
- c est un tournant a 180 degres implq 4 aa
- la gly et pro y participent souvnet :
  - gly : flexibilite
  - pro : rigidite
Une formation relativement rare de feuillets est celle des feuillets mixtes, ou on trouve dans le meme feuillet des parties antiparalleles et paralleles.
Feuillets beta :
- 4 brins antiparalleles beta formant un feuillet
- plane avec des liaisons peptidiques
- formant des surfaces qui grace aux liens du frgm du polypeptides q distance creant des surfaces stables
- suffisant pour des surfacsee stables et irreversibles
- les groupements R sont places de maniere alternative de ca et de la du feuillet
sont frq :
- Antipara : retour immediat ou distant
- para : implique retour et meme orientation du polypeptide et moins stable thermodynamiquement parlant
Les residus sont orientes vers le haut ou le bas.
Leur taille sera faible (gly, ala) lorsq les feuillets seront juxtaposes comme dans la keratine ou la soie.
Dans certains model, les feuillets beta ne sont pas planaire :
- comme c’est le cas dans les tonneaux beta ou encore ERGIC-53.
- Les beta turns sont caractéristique par leur changement brusque de direction du squelette du polypeptide, à la surface de la protéine.
- Sa stabilité vient des liaisons hydrogènes qui se font à travers la « tige » de l’épingle à cheveux.
- Très souvent la glycine, l’asparagine, la sérine (petit résidus hydrophile) ou la proline (dispose d’un « coude » dans son backbone pour faciliter le virage) sont impliqué dans les beta turns.
- Notons que les régions entre les feuillets beta, hélice alpha et beta turns sont souvent considérés comme « natural unfolded » ce qui n’est pourtant pas forcément le cas. Il se peut que ces régions aient été abîmé lors de la manipulation de la protéine (faire attention aux artefacts des méthodes utilisées). On peut observer les probabilités relatives qu’un résidu soit impliqué dans une des trois structures secondaires principales.

Question 17

Q

Les beta turns (reverse turns, beta hairpins)

-struct

Answer

A

Struct :
- changement de direction abrupt du squelette polpeptidique a la surface d une prot
- stabilise par des liaisons hydrogenes le long des virages des hairpin
- capable de bouger dans l espace :
  - des problemes steriques avec les aa larges sur les cotes de la chaine, comprenant souvant Gly (tournant sec et pas place), Asn, Ser (petits residus hydrophilic) ou pro (built in un coude dans le backbone pour aider a debuter le turn)
La Gly et Pro sont moins frq dans le shelices alpha car ++ frq dans les tournants.

Question 18

Q

Struct tertiare et quartenaire

Answer

A

Tertiaire :
- 1 monomere
- 3D polypep :
  - determn par X-ray diffraction of prot crystals
  - NMR spectro des prot en solution
- pliees :
  - pas seulement les positions des atomes dans le blackbone mais ausssi toutes les sideschain atomes)
- chq prot a une unique 3D struct faite des varietes des struct 2nd qui sont pliees d une certaines manieres
Quartenaire :
- agencement des tertiaires
- la struct quaternaire d un eprot est la struct que forme un assemblqge de prot entre elles pour quelles soient efficaces (fibres actines et myosines)
- le type de confo qua une prot (prot avec uniquement des helices alpha ou uniq des feuillets bbeta) va jouer un grd role sur la long de celle ci.
- Les prot les plus compactes sont constt de feuilets beta (fibres de soie)
Les deux sont des divisions artificielles
Structure d un cheveu :
- une molecule qui a evoluee pour la resistance meca
- superenroulement (levogyre) de 2 helices (qui sont indv dextrogyres)
- Les extremites sont intercalees et colles par bout a bout par des interactions hydrophobes
La BSA a un poids moléculaire de 64’500 Da avec ses 585 acides aminés.
- Si elle était complétement en hélice alpha ou en feuillet beta, sa longueur serait de 900 A ou 2000 A respectivement.
- On a donc une différence de taille jusqu’à plus de 2x dans ce cas-là.
- Notons qu’une protéine cuite aura tendance à faire des beta sheet

Question 19

Q

Le collagene :

Answer

A

Struct :
- dans la seqc des aa, tous les 3 residus se trouve une glycine
  - pro et hydroxyproline sont aussi abondant
  - les motifs repetees de Gly-X-Pro et Gly-X-Hyp donnent une strcut particuliere d helice gaucheres.
- les Hyp forment des ponts H avec les Lys des autres chaines
Le collagene est une prot enorme. Elle est secretee modifiee (Hyp) mais reste profondement intra tissulaire (VS, tissus cardiaque : elle ne sautait penetrer dans la peau avec des cremes)
La structure du collagène est complexe. E
- lle possède beaucoup de proline (force le pliage et les beta turns) :
  - on se retrouve alors avec une structure ressemblant à une hélice alpha (pas une hélice alpha) formée de beta turns.
  - Le collagène est donc une structure formé de beaucoup de glycine, proline et d’hydroxyproline.
  - C’est, en effet, des motifs répétés de Gly-X-Pro et de Gly-X-Hyp qui donnent cette structure particulière.
- Dans la structure du collagène, les hydroxyprolines forment des ponts covalents avec les lysines des autres chaines afin de consolider la structure.
- Le collagène est une protéine énorme.
- Elle est sécrétée et modifiée (ajout d’hydroxyprolines par exemple) mais reste profondément intra tissulaire (vaisseaux sanguins, tissus cardiaques). Il est donc impossible qu’elle pénétre dans la peau avec des crèmes.

Question 20

Q

Repliement des prot

Answer

A

Lors du repliement des prot, les aa hydrophobes vont se retrouver au centre car le cytoplasme contient ++ d eau.
- deux prot de la meme taille n auront pas forcement la meme struct et n auront pas forcement la meme fonction. Cela dependra de la seq des aa qui les composent
les prot se plient sur un modele pre def, ils ne cherchent pas toutes les possblt possibles jsq arrv a une structure stable
- Mais deux prot n ayant pas la meme seq qui se replient de facons semblables pourront ne pas avoir les memes fonctions ou alors deux prot qui ne se replient pas de facon semblables pourront avoir les meme fonctions : determination par crytallographie.
Les prot se replient spontanement dans des conditions physiologiques :
- a l equilbre entre l etat denature (deplie ou partiellement deplie) et l etat natif (plie, biologiquement fonctionnel) sous les conditions physiologique, la vaste majoryte des molecules sont dans un etat natif
Les structures primaires determines les struct 3rd (et 4rd) :
- demontrant que plusieurs prot peuvent se plier plus ou moins sous forme “random coil”, un mode de conformation necessitant aucune informations de la part des composants cellulaires.
- toutes les informations pour la struct 3rd proviennent de la seqc amino acides
Les prot peuvent etre denaturees in vitro par des agents chimiques, comme l uree, chaleur extremes, pH… et ensuite les renaturees par dilution des denaturants chimiques, changement du pH ..: RIBONUCLEASE
- no covalent bonds in the polypeptide chain are broken

Question 21

Q

Les prot globulaires ont une grd variere de struct tertiaires

Answer

A

Les protéines globulaires ont une grande variété de structures tertiaires qui les caractérisent.

Des protéines de même taille mais de séquence différente possèdent des structures et des fonctions différentent entre elles.

Pour appuyer cette affirmation, on peut citer trois protéines de taille similaire : le cytochrome c, le lysozyme et la ribonuclease.

Myoglobines Struct :
- ruban : struct secondaire
- gropement HEME
- ruban avec des chaines lat hydrophobes Leu, Ile, Val, Phe
- elle ne possède pas de beta sheet.
- les aa hydrophobes sont enterres et egalement au coeur des prot solubles, contrairement à son cousin l’hémoglobine car, n’étant pas solitaire (4 sous unités pour l’hémoglobine) il est nécessaire que les zones hydrophobes puissent réagir afin de former un complexe.
- Nous pouvons aussi remarquer autre chose le site actif ne peut PAS être complètement enterré afin de pouvoir réagir.
- En effet, les acides aminés hydrophobes sont généralement au cœur des protéines solubles.
- les traits jaunes représentent des ponts disulfures :
  - les protéines les contenant ne peuvent PAS être dans le cytosol car c’est une région réductrice.
Cytochrome C struct :
- transport d electrons, intracellualrei
- +++ helices alphas et - helice beta
- 12400 Da
Lysosomes :
- larmes,ouefs
- prot secrettes
- bactericide extracellulaires
- ncss pour les defenses
- 14600 Da
Taille similires, diff sequences = diff struct, diff fonctions
Le contraire existe :
- diff seqc = struct similaire, diff fonctions
- diff seqc = struct diff, fonction similires
Le « immunoglobulin fold » est un domaine « beta sandwich », c’est-à-dire la répétition de beta sheet.
- Ils sont reliés par 2 beta sheet opposé et antiparallèle.
  - On peut citer la protéine de surface des lymphocytes T (laCD4) qui possède 4 domaines identiques de feuillet beta.
    - Le repliement des 4 domaines est exactement le même.
    - Les zones de liaisons des domaines doivent donc être hydrophobes.
  - De même, la titin, le plus long polypeptide dans le génome humain, à une organisation en domaines.
    - En effet, la titin est composé d’énormément de beta sheet très similaire.
    - Lorsque le muscle est tendu, la titin s’étire ce qui déforme les beta sheet. A ce moment, des chaperonnes viennent rapidement rendre la forme native a ces structures à la fin de l’effort.
    - En effet, dans une structure tertiaire d’un polypeptide, il peut y avoir beaucoup de structure similaire (ou non) qui, sans les chaperonnes, pourraient se gênée.

Question 22

Q

Structure quartenaire

generalite
hemoglobine

Answer

A

Elle se définie comme étant la relation des structures tertiaires des différentes chaines polypeptidiques, la façon dont ces sous-unités se fixent ensemble et leur symétrie.
Il n’y a donc des structures quaternaires que chez les polypeptides qui ont plus d’une chaîne polypeptidique.
Il faut donc définir une terminologie :

 Chaque chaîne polypeptidique dans une protéine avec plusieurs chaines est une sous unité.

 2 sous unités = un dimère, 3 = protéine trimaire, 4 = tétramère

 Homo -> (dimer ou trimer etc) = sous unité identique

 Hetero -> (dimer ou trimer etc) = plus d’une sorte de sous unité

 Les différentes sous unités sont nommées par des lettres grecques (alpha, beta, … Attention, ces lettres grecques utilisées pour différencier les sous unités n’ont rien à voir avec les structures secondaires hélice alpha et feuillet beta)

 Certaines protéines, comme l’ATP synthase des mitochondries, les capsides des virus,etc, peuvent avoir des structures quaternaires très complexes.

 Un olligomère est utiliser pour qualifier un complexe protéinique composé de deux sous-ensembles (un sous-ensemble étant une chaîne polypeptidique) ou plus

l’hémoglobine :
- un hétérotétramère formé de 2 sous unités identiques alpha et 2 sous unités identiques beta (attention rien à voir avec l’hélice alpha et le feuillet beta).
- Cette structure est symbolisée par α2β2. En effet, ces sous-unités sont structurellement très semblables et ont sensiblement la même taille.
- Elles sont aussi très similaires à la myoglobine:
  - l’hémoglobine et la myoglobine ont la même structure primaire et tertiaire
  - Donc chaque niveau structurelle défini la fonction ? La différence entre ces deux protéines vient uniquement de la duplication d’une gêne ancestrale qui a conduit à une divergence des séquences (différents gènes de globine).
  - Par contre la structure tertiaire a été conservée durant l’évolution
On retrouve ainsi toute une serie de protéine avec des structures quaternaires différentes qui permettent des fonctions variées :

 GroEL14 est une chaperonne dans les mitochondries avec 14 sous unités identique (homoolligomère) organisées en cylindre formant une cavité.

 Rubisco possède une structure quaternaire ou le site actif est coupé en deux parties. C’est lorsque la fixation du CO2 se fait que les deux parties se rejoignent.

 La Cage de clathrin est un complexe (olligomère) qui se forme par invagination de la membrane et qui permet de former une vésicule pour récupérer un substrat externe à la cellule. Il sera défait lors de l’arrivée de la vésicule au lysosome.

 Le virus de la mosaïque du tabac qui est un homoolligomère ayant la fonction de protéger l’information génétique.

Question 23

Q

La criminalité des protéines: Qui cause le vieillissement et des maladies dégénératives ?

Answer

A

C’est en 1967 que Griffith propose une hypothèse selon laquelle la cause de certaine maladie infectieuse serait due à une protéine ayant adopté un repliement anormal.
- Il sera nécessaire d’attendre encore quelques années, notamment grâce à Anfinsen et Prusiner, pour comprendre la relation entre des maladies comme le kuru, la tremblante du mouton ou la vache folle et les protéines.
On sait aujourd’hui que l’information génétique doit être transcrite fidèlement en ARN d’abord et être traduite en ARN ensuite. C’est ce que l’on appelle le «cellular processes».
C’est en 1961 que Christian Boehmer Anfinsen démontra que la ribonucléase pouvait revenir à sa conformation initiale après dénaturation par un agent réducteur tout en préservant son activité enzymatique.
- Ce fait suggère que toutes les informations nécessaires à une protéine pour obtenir sa conformation finale sont encodées dans sa structure primaire.
- Il utilisa pour cela la ribonucléase bovine, très similaire à la ribonucléase humaine (avec 4 ponts disulfures).
Voici comment il procéda :

 Grâce à un agent dénaturant (l’urée) il déplie la Rnase bovine.

 Un problème survient alors : les ponts disulfures de la protéine (au nombre de 4) sont covalent et ne se déplient donc pas.

 Pour résoudre cela, il utilise un agent réducteur (la beta mercaptoethanol) qui reduise les ponts S-S en 2 groupes SH. Cela permet donc d’avoir une protéine dépliée et étirée.

 La structure native de la protéine est donc perdu (dénaturation) et la Rnases est inactive.

 Il retire maintenant l’urée par dialise ce qui replie la protéine

 Ce repliage se fait en l’absence d’agent réducteur donc l’O2 de l’aire suffit à reoxider les SH en disulfides)

 La protéine regagne alors son activité enzymatique ce qui prouve que la bonne combinaison des ponts S-S a été faite.

Cependant, seulement 30 à 40% des protéines se repliaient correctement ce qui laissait perplexe Anfinsen. On montrera plus tard l’importance des chaperonnes dans ce phénomène

Question 24

Q

Vie des prot : les chaperonnes nos sauveuses

Answer

A

les prot naissantes acquierent un repliement spe et auront un efonction propre. Si il a des erreurs lors de la mise en place de la suite d aa ou lors di repliement, la prot peut ne pas avoir de fonction ou alors peut meme avoir des fonctions de structuves dans la cell.
Il y a donc des moyens de defense de la cellulle qui permettent soit de reparer le sprot, soit les detruire, soit les stocker.
Les chaperones :
- Les chaperonnes moléculaires sont donc comme des policiers. Elles doivent savoir comment :
  - Identifier des protéines « criminelles »
  - Appréhender des protéines criminelles (sans déranger les protéines fonctionnelles)
  - Eduquer, réparer les premiers délinquants
  - Transférer les criminels aux autorités appropriées pour être éliminées
- importance dans la mise en place de la bonne structure en 3D de la prot d interet
- le pliage est spontane :
  - des prot denaturees avaient la capacite de reformer une struct fonctionnelle 3D
  - une reparation coute moins cher a lorganisme que la degradation et la resynthese
Anomalies :
- Une anomalie de formation provoque un ralentissement du trafq cellulaire.
- dans certains cas les prot malformees sont conduites dans des reservoirs et forment des agregats. Ces poubelles a prot sont generalement nefastes car les prot malformees ne sont pas eliminees de l organisme mais maintenues dans le systeme.
  - Alzheimer :
    - l’agrégation de la protéine « tau » dans la cellule et du peptide Abeta dans la cellule et du peptide β-amyloïde hors de la cellule entraîne une réaction inflammatoire locale dans le cerveau qui provoque la mort des cellules (apoptoses) atteintes et la dégénérescence des tissus nerveux.
  - Kuru (vache folle) :
    - une prot malformee est a l origine des troubles. De plus, cette prot est capable d induire les prot ayant la bonne struct a changer de confo et a devenir nefaste. La maladie se manifeste essentiellement par un sundrome cerebrale avec un trouble de l eq et de la coordination des mouvements.
    - une encéphalopathie spongiforme transmissible. Il remarque que les patients atteint de la maladie possède des structures cross-beta dans un état thermodynamique très stable mais sont mal replié.
    - Son hypothèse est que toutes les cellules ont des protéines mal repliées mais la plupart possède la machinerie adéquate pour les dégrader. Peut-être que les neurones ne la possèdent pas. Il décide d’appeler alors d’appeler les protéines mal repliées des prions.
    - En leur injection le prion, ils ne devraient normalement pas pouvoir former d’agrégats puisque la protéine saine n’est naturellement pas présente dans la souris. En effet, aucun agrégat se forment et donc les protéines peut être un agent pathogène.
  - Mucovicidose :
    - on retrouve une mutation dans un canal transporteur de chlore. En effet, un segment de la protéine est mal replié et une chaperonne s’efforce de maintenir le canal plus ou moins stable. Cependant, passé un certains âge (moyenne de 40 ans) la chaperonne ne peut plus assurer la fonction (à cause du veillissement) et le patient atteint meurt.
Dans un grand nombre de maladies liées au « mal pliage » des protéines, on trouve des chaperonnes moléculaires associées au agrégats protéiques.
On peut citer les chaperonnes HSP pour protéines de choc thermique (Heat shock proteins).
- En effet, elles sont garantes de la bonne conformation des protéines de la cellule, et les aide à se protéger des stress externes. Le suffixe « 70 » correspond au poids moléculaire.
en cas de stress, les protéines se dépliées, il est donc nécessaire de les faire revenir à leur état natif.
- Les chaperonnes peuvent donc induites par le stress pour sauver les prions.
- En effet, le but des chaperonnes n’est pas de détruire (extrêmement couteux) les protéines mal repliées mais de les sauver, de les réintégrer dans le bon fonctionnement de l’organisme.
Notons que toutes ces maladies (tremblante des moutons, vache folle, le kuru, la mucoviscidose) sont des maladies à prions.
- Il y a donc une dose limite de prion à ne pas ingérer pour éviter les agrégats.

Question 25

Q

Deux facteurs peuvent être la cause pour qu’une protéine se replie mal :

Answer

A

La charge de la protéine :
- les charges négatives doivent être à l’extérieur et les charges positives, hydrophobes, à l’intérieur.
La partie hydrophobe :
- elle doit se trouvez à l’intérieur de la protéine. Dans le cas inverse, elle pourrait faire des interactions avec des protéines semblables et former des agrégats toxiques. (Maladie d’Alzheimer, Kuru, Mucovicidose)
Notons que l’ubiquitine est associée à la formation de ces agrégats de protéine.
- De plus, contrairement à ce que l’on pourrait penser, les petits agrégats sont plus dangereux que les gros.
  - En effet, étant moins compact, les petits agrégats ont plus d’interaction avec les voisins. Les gros sont donc peu toxiques par rapport au petit.

Question 26

Q

le suicide cellulaire :

Answer

A

Si la cellule enregistre des signes qui indiquent un mal pliage, elle risque de se suicider. Il faut donc activement remedier a ce pb, par le PROTEASOME.
- les “gardiens des portes” du proteasome.
- une prot qui doit se faire degrader possd un tag :
  - une ubiquitine aidee d une chaperonne qui font une selection parmi les prot pour determiner lesquelles sont bonne pour la degradation
Etapes de degradation dans l ordre d action :
1. empecher la prot de mal se plier
2. reparer
3. degradation par proteasome
4. degradation d organelle par lysosome
5. formation d agregat (Alzheimer)

Question 27

Q

Aggresome :

Answer

A

Une struct cellulaire des euca qui concentre et compresse les agregars potentiellement toxuque et par cela les sequestres.
Les bact forment des corps d inclusion.
Bcp de medicaments anti inflammatoires augmentent les chaperonnes et les proteases (Aspirine)
- Les vertus du Curcuma :
  - anti inflammatoire
  - induit chaperonnes
  - inhib apoptose : NfkB
  - traitement anti age de la peau
Hyp : si plus de chaperonnes alors vivre plus longtemps ?
- moins de chap s expriment dans les organismes calories restrected car manger +++ est un stress exterieur apporter a l organisme ce qui diminue ainsi le temps de vie
Les effets de la fievre :
- certes, source d inconfort et est diminuee par medicaments : bonne chose ?
- il faudrait maintenir un nv Hsp70 (diminuer mort cell) et la fievre permet de l induire et de les maintenir a un certain nv.

Question 28

Q

le role thermodynamq des prot chaperonnes :

Answer

A

Grâce à Anfinsen, il est donc possible de faire le schéma suivant :
- On peut y voir le rôle thermodynamique
  important que jouent les chaperonnes
  moléculaires.
- En effet, une protéine doit
  d’abord élever sont énergie libre pour se
  déplieret seulement ensuite va pouvoir se
  plier correctement.
- Une protéine dépliée a donc une grande énergie libre.
- Sans ATP,les chaperonnes ne peuvent pas travailler et rien ne se passe.
- Avec de l’ATP, même à 37°C, les protéines sont formés, même avec une énergie libre grande en elle (état impossible sans les chaperonnes car à 37°C, l’énergie libre des protéines est grande et donc elles devraient être dépliées).
- Si on retire l’ATP à 37°C, les chaperonnes s’arrêtent et les protéines retournent à un état dépliée, dénaturée.
- Il arrive parfois que la protéine se replie mal, voire pire, qu’elle forme des agrégats en fibrille comme on peut les voir dans des maladies comme Alzheimer.
  Il est cependant possible, grâce à une augmentation du stress et donc de l’énergie libre (en chauffant par exemple) de redéplier les protéines natives et de les reformer ensuite.
durant le pliage, :
- sur le chemin de la thermo, le nombre d etats diminuent (diminution d entropie), et augmentation de la conformation native des prot et une decroissance d energie libre.
- La depression de l autre cote de l entonnoire represente un pliage un pliage intermediaire semi-stable, qui pourrait dans certain cas, ralentir le processus de pliage.
La thermo des pliements des prot peut etre representee comme un entonnoire.
- en haut : le nombre de conformation, et par consequent l entropie conformationnelle est large.
- seulement une petite fraction des interactions intramoleculaires qui existera dans les conformations natives sont presentes.

Question 29

Q

Mecanisme des chaperonnes

Answer

A

Le mécanisme des chaperonnes est le suivant :

 La protéine mal pliée est dans l’environnement

 Le chaperon moléculaire bactérien DnaK est une enzyme qui associe des cycles de

liaison à l’ATP, d’hydrolyse et de libération d’ADP par un domaine hydrolysant à l’ATP N-terminal. L’hydrolyse de l’ATP par DnaK est stimulée par son interaction avec un autre co-chaperon, la DnaJ.

 DnaK est alors fermé et la protéine se déplie.

 GrpE est la co-chaperone de DnaK et agit comme facteur d’échange de nucléotides,

stimulant le taux de libération de l’ADP de 5 000 fois. Ainsi la protéine est relâchée tout

comme de l’ADP.

 La protéine revient spontanément à un état natif.

l’état natif est l’état thermodynamique le plus bas et l’état actif de la protéine.
- Cependant, à 37°C, cette conformation n’est pas optimale et instable.
- Les enzymes se défont si l’ATP n’est pas présent pour les chaperonnes.
- Cependant, si il est présent, alors les chaperonnes seront capable de maintenir les protéines dans un état natif et actif malgré le stress lié à la chaleur.
Le corps fonctionne comme un nageur :
- l’apport d’énergie est constament nécessaire. Sans lui, l’organisme « coule » car les protéines se défont.
Parfois, les proteines ne peuvent pas être réparer. Dans ce cas, bien que beaucoup plus chère en énergie, les chaperonnes doivent la dégrader (5 ATP pour réparer, 1000x plus chère de la dégrader).
Ce sont les protéasomes qui s’en occupe. Les protéasomes sont des complexes enzymatiques multiprotéiques.
- Dans les cellules eucaryotes il se trouve dans le cytosol et est associé au RE
- Leur fonction principale :
  - dégrader les protéines mal repliées, dénaturées ou obsolètes de manière ciblée.
  - Cette dégradation se fait par protéolyse, une réaction chimique qui coupe les liaisons peptidiques et qui est effectuée par des enzymes appelées protéases.
  - La protéine est ainsi découpée en peptides longs de 7 à 9 acides aminés qui seront ensuite hydrolysés hors du protéasome et recyclé.
Les protéines sont marquées pour la dégradation par une protéine appelée ubiquitine.
- Ce marquage est réalisé par l’action coordonnée de trois types d’enzymes.
- Une fois le marquage par une première molécule d’ubiquitine réalisé, d’autres ubiquitines vont être rajoutées à sa suite.
- Il faudra une chaîne d’au moins quatre ubiquitines pour que le protéasome 26S reconnaisse la protéine à dégrader.

Question 30

Q

Certaines prot peuvent assiter les prot chaperonnes :

-1er classe : Hsp70

Answer

A

Pas toutes les prot se plient spontannement une fois synthetysees ddans la cellule. Le pliage pour bcp de prot est aide par l action de prot specialisees.
Il existe 2 classes de chaperonnes moleculaires, les deux sont aussi bien trouvees chez les bact que chez les humaines :
1. Hsp70 :
  - elle seul 1% de la masse protéique de la plupart des organismes vivant.
  - poids moleculaire : 70 000
  - deux domaines :
    - 1 liant l’ATP et
    - l’autre qui peut attacher la protéine mal pliée.
  - On a donc une conformation ouverte et une autre fermé.
  - abondance : lors d un stress ext cause pas une augmentation de la temp.
  - une enzyme qui utilise l’énergie de l’ATP pour déplier les protéines mal pliées et agrégées.
  - C’est au centre qu’un petit polypeptide va être placé sous forme compact à l’état ouvert. Puis la molécule se ferme (ATP hydrolysée) ce qui compresse la molécule et la déplie.
  - se lient sur les regions non pliees du polypeptides qui sont riches en residues hydrophobes, empechant une aggregation inappropriee. + bloque aussi le pliage de certaines prot qui doivent rester depliees jsq leur translocation apres la membrane + hydrolyse ATP
  - Parfois la protéine est recrachée sans avoir été déplié sans que l’on sache pourquoi.
  - certaines chaperonnes facilitent l assemblage quaternaires des prot oligomeriques Some chaperones also facilitate the quaternary assembly of oligomeric proteins.
Les protéines de la famille des HSP70 fonctionnent sous forme de dimères.
- flexibilité et leur capacité à lier des zones d’interactions hydrophobe.
- En plus de l’écraser, la chaperonne HSP est immobile, contrairement à la protéine qui ne cesse de bouger. Ce mouvement permet d’accélérer le processus de dépliage de la protéine.
  - En effet, en se fixant en un point, HSP permet de déplier se point la mais grâce aux mouvements de la protéine, qui agissent comme une vague sur l’environnement, ce sont aussi les zones périphériques qui se déplient.

Question 31

Q

Certaines prot peuvent assiter les prot chaperonnes :

-2er classe : Chaperonines

Answer

A

La 2nd classe des chaperonnes est les chaperonines :
- ce sont des complexes prot elaborees necessairent pour le pliage de prot cellulaire ne pouvant pas se plier spontanement.
- dans E. coli une estimation de 10-15% The second class of chaperones is called chaper- onins.
- Dans une cellule, le processus de repliement des protéines par médiation GroEL/ES implique de nombreuses séquences de liaisons, encapsulations et libération de protéine substrat. Les protéines substrats non repliées se lient à une aire hydrophobe sur le bord intérieur de la cavité ouverte du GroEL, formant ainsi un complexe binaire avec la chaperonine. La liaison de protéine substrat de cette façon, en plus de la liaison d’ATP, conduit à une modification conformationnelle qui permet l’association du complexe binaire avec une structure couvercle distincte, GroES. La liaison de GroES avec la cavité ouverte de la chaperonine provoque la rotation des sous-unités individuelles de la chaperonine de manière que le substrat hydrophobe liant soit soustrait à l’intérieur de la cavité, ce qui induit l’éjection de la protéine substrat du bord vers la chambre maintenant hydrophile. L’environnement hydrophile de la chambre favorise l’enfouissement des résidus hydrophobes du substrat, ce qui induit le repliement du substrat. L’hydrolyse de l’ATP et la liaison d’une nouvelle protéine substrat dans la cavité opposée envoie un signal allostérique qui provoque la libération de GroES et d’une protéine encapsulée dans le cytosol. Une protéine donnée subira plusieurs cycles de repliement, retournant à chaque fois à son état non-replié original, jusqu’à ce que la conformation native ou une structure intermédiaire destinée à atteindre l’état natif soit produite. De manière alternative, le substrat peut être dénaturé lors d’une réaction compétitive, comme un mauvais repliement ou une agrégation avec d’autres protéines mal repliées

Question 32

Q

Ubiquitin/26S proteasome pathway

Answer

A

Struct :
- une prot de 76 residus impliquee dans la regulation de la degradation des proteines
- La sqc des aa de l ubiquitine est identique entre differentes especes
Ubiquitination :
- est un marquage de la prot a degrade avec un ajout d ATP qui va etre deversee dans le le 26S proteasome : PROTEOLYSIS + ATP
- cela est permis par des molecules d ubiquitines qui vont s accrocher et donner un signal pour un complexe enzymtq proteolytique ou une proteasome qui va degrader la prot
cf l image pour comprendre le complexe et le meca

Question 33

Q

Clp protease :

Answer

A

peut interagir avec des substrats et avoir un impact proteolq dessus
meca :
1. ca[turer et deplier la prot native par l intermediaire d une chaperone
2. transloquer la prot depliee dans le ClpP
3. degradation de la prot depliee
4. relachement des fragements peptidiques
une famille de peptide à serine.
- Par exemple, ClpP est une protéase ATP- dépendante qui clive un certain nombre de protéines, telles que la caséine et l’albumine.
Elle suit le processus suivant :

 Capture d’une protéine qui doit être dégradée à l’aide d’une chaperonne

 Translocation de la protéine mal pliée dans le ClpP

 Dégradation en petit morceaux de la protéine

 Les fragments sont libérés dans l’environnement

Question 34

Q

Deportation des prot endommagees vers le lysosome :

Answer

A

cf meca en photo
Une autre façon de dégrader une protéine est de la transloquer dans le lysosome.
- En effet, le lysosome contient des enzymes de dégradation protéolytique (hydrolyse les protéines) de différent type.
- Naturellement, la membrane du lysosome est synthétisée à l’aide de protéine spécial.
  - Une vésicule se forme autour de l’agrégat de protéine qui doit être emmené dans le lysosome.
  - Une fois dedans, il est important de le dégrader entièrement. En effet, comme vu avant, les petits agrégats sont bien pires que les grand et donc une mauvaise dégradation peut conduire à plus de problèmes qu’il n’en résout.
  - Le pH est maintenu à 5.5 par des pompes à protons ATPase. Ce lysosome compte pour 1 à 15% du volume cellulaire (très abondant dans le foie et les reins).
Il est important pour la cellule de concentrer tous ces agrégats en un seul et même lieu. Pour ce faire, elle possède un aggrésome :
- une structure cellulaire des eukaryotes qui concentre et compresse les agrégats potentiellement toxiques et par cela les séquestre.
- C’est un mécanisme très précis qui concentre tous les agrégats à côté du nucléole.
- Les bactéries, quant à elles, forment des « corps d’inclusion » (inclusion bodies). L’aggrésome est pour la cellule ce que les prisons sont pour les sociétés.

Question 35

Q

Mais comment combattre le crime moléculaire, le vieillissement et les maladies neurodégénératives ?

Answer

A

Grâce aux osmolytes!
- Ils protègent les protéines thermosensibles contre la dénaturation.
- Sur le prochain schéma, on peut voir les tracés semilogarithmiques des activités de la créatine- kinase incubées dans un tampon Tris-HCl 20 mM, pH 8,05, avec différentes concentrations de glycérol à 50 ° C pendant 60 minutes maximum.
- Les osmolytes protègent la MDH (malate déshydrogénase) native de l’inactivation thermique. La MDH a été incubée à 44° C en présence de concentrations croissantes de bétaïne, de tréhalose, de proline ou de glycérol (les osmolytes). Ainsi, en présence de 3% de trehalose, il est possible de protéger ma protéine native.
- Les osmolytes sont donc des composés organiques (et non des protéines) qui ont un rôle de chaperonne chimique.
- La proline, par exemple, est un osmolyte neutre qui protège beaucoup de protéine. On le retrouve en grande quantité dans le cytosol.
Beaucoup de médicaments anti-inflammatoires augmentent les chaperonnes et les protéases.
- Par exemple l’aspirine ou l’ibuprofen qui sont des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS ou NSAIDs).
- Ils sont des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti- inflammatoires. Ils réduisent la douleur, la fièvre et l’inflammation grâce à l’augmentation de chaperonnes qu’ils produisent.
Un autre produit extrêmement bon pour la santé est le curcuma.
- Il possède des vertus anti- inflammatoires, inhibe la voie d’apoptose NfkB, induit l’expression des chaperonnes et est un traitement anti-âge de la peau depuis 5000 ans.

Question 36

Q

Systeme immunitaire : pricnp G

Answer

A

Tous les vertebres ont un systeme immunitaire capable de distinguer les cellules du soit et du non soit et ainsi detruire les envahisseurs. C est une methode pour eliminer les virus, bact, et autres pathogenes nocifs pour notre organisme.
On parle de protéine lié à la membrane capable de reconnaître les bonnes cellules des mauvaises. Ce sont des protéines transmembranaires.
- Attention, les mauvaises cellules ne viennent pas uniquement de l’extérieure mais aussi de l’intérieur d’où l’intérêt d’avoir des régions hyper variables.
On a donc divers domaine :

 Un domaine extracellulaire composé d’unité de pliage indépendante et stabilisé par des ponts disulfures.

 Une région hypervariable qui va être sélectionnée par l’organisme pour reconnaître un antigène. Ce domaine variable peut, par exemple, être en crevasse, pour la plupart du temps hydrophobe.

Les complexes d’histocompatibilité sont :
- comme les « uniformes » des cellules qui leur permettent de s’identifier comme ennemi ou amis lors d’une « guerre » (ou une greffe) cellulaire.
- permettent de s identifier comme ennemi ou amis lors d une invasion ou d une greffe cellulaire.
- Notons les régions COO- des régions intracellulaire qui joue un rôle dans la signalisation par phosphorylation.
Lorsqu’un virus infecte une cellule :
- ses protéines vont être digérées par le protéasome.
- Ces nouveaux peptides iront se placer sur les parties hypervariables des protéines transmembranaires et seront exposés à l’extérieur (formation des antigènes).
- Les cellules cytotoxiques T pourront alors reconnaître ces peptides et induiront la mort de cette cellule.
La partie hypervariable des anticorps se trouvent au sommet. L’anticorps est stabilisé par des ponts disulfures.
- C’est l’interaction entre l’antigène à la surface de la cellule et la partie hypervariable de l’anticorps qui va permettre l’envoie du signal à la cellule.
- Une fois l’antigène reconnu, l’anticorps se multiplie pour combattre plus efficacement le virus et tuer un maximum de cellule infecté en un minimum de temps.
Ce sont les lymphocytes B qui produisent et sécrètent les anticorps.
- Un anticorps à un poids moléculaires total de 150 kDa sans les sucres. Ce sont des protéines fabriquées par le réticulum endoplasmique et sécrétées via le golgi hors de la cellule, dans le sang.

Question 37

Q

Méthode immuno-enzymatique ELISA

Answer

A

Avant la PCR, qui détecte l’ADN ou l’ARN en l’amplifiant, on utilisait un test de détection de protéine extrêmement sensible : ELISA pour « Enzyme-Linked Immunosordent Assay).
La méthode immuno-enzymatique ELISA est un examen de laboratoire. Cette méthode est principalement utilisée en immunologie pour détecter la présence d’un anticorps ou d’un antigène dans un échantillon.
- le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie.
- C’est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps.
  - L’un de ceux-ci est spécifique de l’antigène, tandis que l’autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme.
  - Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l’émission d’un signal par un substrat chromogène ou fluorogène.
- C’est un test simple, facile d’emploi et peu coûteux. Il est limité par la disponibilité en anticorps spécifique.
Pour un ELISA il faut :

 Un anticorps spécifique (souvent de lapin, ici en jaune) contre la protéine antigénique d’intérêt (ici en bleu)

 Une courbe étalon avec l’antigène d’intérêt purifié.

 Un support (plaque multi-puits) qui absorbe les protéines.

 Un anticorps général (souvent chèvre contre tous les anticorps de lapin, ici en vert) auquel est attachée une enzyme révélatrice (luciférase, peroxydase, …, ici en violet) Le deuxième anticorps (de chèvre) est donc uniquement la pour reconnaître l’autre anticorps (de lapin) et d’émettre de la lumière si celui-ci s’attache à la protéine.

Cette technique permet donc de savoir si un patient est malade et de quoi. Ainsi, on prend le sang du patient, on immobilise le plasma et on le lave pour garder uniquement les protéines d’intérêt qui sont resté attaché aux antigènes de surface.
D’autres moyens de détection sont aussi utilisés comme la PCR (Polymerase chain reaction).
- En effet, un morceau d’ADN que l’on veut multiplier sera lié à une amorce artificielle.
- On introduit ensuite une polymérase et on multiplie le fragment de manière exponentielle. On verra alors, sur un gel d’agarose, une bande spécifique si le patient est malade.
ELISA quelque désavantage :
- c’est une technique extrêmement sensible, voir trop sensible et sujette à des erreurs (ou artefacts = faits scientifiques qui nous induisent en erreur).
- En effet, contaminer un échantillon avec son propre ADN est très facile et, puisque cette technique ne multiplie pas de manière exponentielle les protéines (elle ne multiplie rien), les résultats seront alors faux.

Question 38

Q

Meca d immunolg moleculaire :

Answer

A

cf image meca

Question 39

Q

Immunoglobines

Answer

A

Immunoglobulin G (IgG) est la plus grande classe d anto coprs et une des plus courante dans le sang.
Structr :
- 4 chaines polypeptiddq :
  - 2 grandes : “heavy chains”
  - 2 petites : “light chains”
- sont liees par des liaisons non covalentes et ponts disulfures.
- poids moleculaire de 150 kDa sans les sucres
les heavy chains interagissent a une extremite, et apres se separent en deux branches interagissant avec les light chains, formant un Y.
au nv des branches, l immunoglobine peut cliver avec des proteases.
liaison proteine-ligand
Ces prot fabriquees par les RE et secretees via le golgi

Question 40

Q

Cytosq :

Answer

A

cytosquelette a donc un rôle très important dans la croissance et la division cellulaire.

Il est mobile et non fixe. Le cytosquelette est composé de :

 Microtubules fait de beta et alpha tubulines qui forment un tube très rigide et qui permettent le mouvement aux organelles de la cellule (25nm).

Ils forment un gros réseau dans toute la cellule où les organelles cargo sont transportées grâce à des protéines moteur qui marche tout le long de celui-ci grâce à l’ATP (dynéine et kinésine).

Ils sont capables de faire bouger la cellule en entier et permettent ainsi le mouvement de l’organisme (par exemple les spermatozoïdes).

Pour faire tout cela, les microtubules doivent aussi pouvoir se dépolymériser très rapidement.
- C’est grâce au GTP que cela est possible (l’ATP ne peut pas jouer un rôle là-dedans).

Un microtubule est composé de 13 hétérodimère parallèle appelés protofilament.

Les microfilaments d’actines composé de deux filaments d’actines eux même composé de monomère d’actine (7nm).
- Ils permettent aussi le mouvement de certaines organelles ou de la cellule elle-même. On les retrouve aussi dans les muscles où une interaction protéique est modulée par l’énergie chimique.
- Ces microfilaments sont en interaction avec la myosine et des moteurs moléculaires permettant la relaxation et la contraction de celui-là.
La myosine (520 kDa) :
- est composée de 2 chaînes lourdes (220 kDa) enroulées et dont le N-terminal est globulaire (têtes) et de 4 chaînes légères (20 kDa).
  - Les chaînes lourdes vont attacher et hydrolyser l’ATP ce qui va permettre le mouvement d’un rail de F-Actine et provoquer les contractions. Pour les filaments d’actine, c’est différente. Ils n’hydrolysent que l’ATP pour se polymériser. Tous se système est lié à la Titin, la protéine la plus longue que l’on connaisse.
Les filaments intermédiaires :
- de 10 nm qui sont moins dynamique que les autres structures du cytosquelette. Ils sont plus rigides et sont donc parfait pour entourer des structures qui n’ont pas besoin de bouger comme le nucléole. Ainsi, ces organelles gardent leur position.
Le cytosquelette permet donc de donner non seulement de la rigidité mais aussi de la mobilité à tout l’organisme.
Une interaction des dyenines sur les microtubules se retrouve chez les flagelles euka et les ciliees. Les flagelles chez les bacteries impliquent un complexe de rotaation a la base du flagellum.

Question 41

Q

Autre exemple de mmoteur moleculaire :

Comment la chaperonne Hsp70 tire sur une prot cytoplasmq pour le deplier et l importer dans la mitochondrie ?

Answer

A

Dans la matrice de la mitoc, att gentilment Hsc 70 qui va tirer (en mordant) la prot depliee a l interieur et ATP change de confo pour le meca.
La prot doit etre depliee car les pores de la mitoc sont selectif pour empecher le passage des protons.
la chaperonne Hsp70 tire sur une protéine cytoplasmique pour la déplier et l’importer dans la mitochondrie.
- En effet, la mitochondrie à comme fonction primaire la phosphorylation oxydative pour synthétiser de l’ATP.
- Elle a donc besoin d’une différence de potentiel des protons H+ entre la membrane et l’extérieur.
- Pour maintenir cette différence, il est très important qu’aucun proton n’entre dans l’organelle. Cependant, les protéines doivent tout de même circuler.
- Puisque les protéines sont bien plus grandes que les protons, elles n’ont d’autres choix que d’entrer de manière dépliées (comme le fil dans l’anguille).
Hsp70 est impliqué dans ce dépliage.
- En effet, elle fonctionne comme un moteur moléculaire aligné sur le pore de la mitochondrie, la « bouche » ouverte.
- En arrivant, la protéine force Hsp70 à se fermer et ainsi elle reste fixe.
- Les mouvements naturels de la protéine permettent ensuite son dépliement.
- Ainsi, la protéine passe par le pore dépliée sans qu’aucun proton ne soit entré.
Notons que tout ce processus nécessite de l’ATP.

Question 42

Q

Les proteines bacteriennes :

Answer

A

cytosquelette permet donc de donner non seulement de la rigidité mais aussi de la mobilité à tout l’organisme.
Les protéines bactériennes ont aussi réussi à former des structures complexes. Prenons l’exemple de leur flagelle qui est un moteur moléculaire en forme de rotor.
- Un complexe se forme dans la membrane interne pour former le moteur capable de tourner grâce à un gradient de protons.
- Une partie charnière ainsi qu’un flagelle seront alors couplés au moteur.
- Ce flagelle est une turbine qui s’encastre dans le moteur moléculaire formé de dents permettent un changement conformationnel lors de l’entrée d’un proton.
- La construction commence dans la membrane interne puis les protéines s’organisent autour, bourgeonnant de l’intérieur du rotor.
- Petit à petit, un trou se forme et permet aux nouvelles protéines de passer pour continuer la construction.
Ce complexe permet non seulement le mouvement mais permet aussi le passage d’ARN (comme un pont) ou de protéine entre une bactérie et une autre ou entre une bactérie et une cellule.
- En effet, la plupart des bactéries ne possèdent que 16 gènes mais ont beaucoup plus de protéines.
- Ces protéines proviennent de la cellule hôte et passent par ce système de tuyaux moléculaires. Ce flagelle est capable de faire 100’000 rotations par minutes

Question 43

Q

Membranes biologiques et transport

Answer

A

Le challenge ici est de pouvoir transporter une protéine (hydrophile) d’une membrane à une autre (hydrophobe).
Le cas des protéines membranaires est donc un cas plus complexe que celui des protéines globulaires solubles.

Les lipides sont les constituants essentiels des « bi-couches » membranaires dont la cohérence est assurée par les oppositions de pôle hydrophile et hydrophobe.

On retrouve deux types de lipides :

 Le cholestérol qui permet à la membrane d’être rigide

 Les phospholipide

Question 44

Q

phospholipides : glycérophospholipides

Answer

A

Les glycérophospholipides peuvent lier plusieurs groupes comme des sucres qui se retrouveront plutôt à l’extérieur de la cellule ou des groupes phosphatent (phosphatidylglycerol) qui se retrouvera plutôt à l’intérieur de la cellule.
Les phospholipase (PL) permet de cleaver certains sites des phospholipes.
- En effet, Les phospholipases sont des enzymes qui hydrolysent les phospholipides aux niveaux des liaisons esters.
- On distingue selon le site d’action de l’enzyme :

 PLA1 qui cleave la liaison ester en C1 –OH

 PLA2 qui cleave la liaison ester en C2 –OH

 PLC qui cleave la liaison ester phosphate en C3 –OH

 PLD qui cleave la liaison ester phosphate des autres alcools au phosphate C3

* On retrouve ainsi tout plein de phospholipide pour définir la membrane (canaux, protection, signal).

Question 45

Q

Sphingolipides

Answer

A

Ils sont des lipides complexes, dérivés de la molécule de sphingosine, présents entre autres dans les membranes plasmiques.
- Ils résultent de l’amidification d’un acide gras sur une sphingosine.
- Ils jouent un rôle important dans la transmission du signal, et la reconnaissance des cellules.
- Sur la fonction alcool primaire de la sphingosine, peuvent s’ajouter différents substituants.
- En fonction de la nature du substituant, on distingue notamment les céramides, les phosphosphingolipides et les glycosphingolipides.

On peut noter certaines similarités et différences avec les lipides à base de glycérol :

 C1 à un groupe –OH (peut être estérifié en phosphate, ou en une liaison glycosidique à l’hydrate de carbone

 C2 à un groupe amino (-NH3) à la place d’un –OH sur le glycérolgroupe acyle gras en liaison amide (pas en ester)

 C3 à un groupe –OH non dérivable, et au lieu d’un atome de H sur le glycérol, C3 a une longue chaîne hydrocarbonée avec 1 double liaison

 Les céramides ont un acide gras dans la liaison amide au groupe amino de C2 dans TOUS les shingolipides

Question 46

Q

Cholesterol

Answer

A

Il est constitué de 4 anneaux d’hydrocarbones fusionnés, 3 avec 6 C, 1 avec 5 C (noyau stéroide).
Ces caractéristiques sont les suivantes :

 Il est constitué d’une structure planaire, rigide et électriquement neutre

 Il est amphipathique (groupe hydrophobe et hydrophile)

 Principalement dans les membranes plasmiques des cellules animales, les organellesen ont généralement moins, rarement retrouvé chez les bactéries

 Il joue un rôle primordial dans la fluidité des membranes

 C’est le précurseur de l’acide biliaire (emulsifiants)

 Precurseur des hormones (hormones steroides)

Le cholestérol n’est donc pas un lipide classique de par ces caractéristiques et de par le faite qu’il n’a pas la continuité classique d’un phospholipide.

Ainsi, il est capable de formé des radeaux avec les sphingolipides (microdomaine de la membrane très peu dense et très peu soluble).

Question 47

Q

Une memb heterogene : composee de radeaux(rafts)
visualiser la meembrane en 3D

Answer

A

En effet, ces radeaux (ou raft) rendent la membranes hétérogènes.
- Ce sont des structures rigides dans la membrane et constituent des zones privilégiées pour l’activité de certaines protéines qui y sont intégrées.
- Ainsi, les protéines du complexe SNARE, indispensable à la fusion des membranes dans l’exocytose, sont associées au cholestérol.
Les radeaux lipidiques forment ainsi des sites privilégiés pour la libération des neurotransmetteurs et donc pour la propagation de l’influx nerveux.
Ils ont un rôle essentiel dans la signalisation cellulaire en permettant la concentration des protéines et notamment des récepteurs comme celui de l’insuline.
Ils sont forment dans l’appareil de Golgi puis amené à la membrane via les endosomes.
Pour pouvoir visualiser la membrane en 3D (faire une carte de celle-ci donc) on utilise la technique « Atomic force microscopy ».
- Le microscope à force atomique (ou AFM) est un type de microscope à sonde locale permettant de visualiser la topographie de la surface d’un échantillon.
- Ainsi, on peut mettre en évidence les aspérités de la membrane.
- Le procédé est simple ; une aiguilles très fine est poser sur la membrane. Grâce à un système de miroir, on est capable de suivre les mouvements de l’aiguille et d’en faire une carte.

Question 48

Q

Proteines transmemb

Answer

A

On en retrouve de différente sorte :
- certains possèdent 6 hélices alpha au milieu de la membrane, d’autres sont attachés à la membrane par liaison covalente et d’autres encore ne possède qu’1 seul hélice alpha.
Mais combien d’acides aminés sont-ils nécessaire pour traverser la membrane ?
- Il en faut 25, et tous hydrophobes et sans charges, sans glycine ni proline.
Mais comment prédire la topographie des protéines membranaires?
- Grâce à l’indice d’hydrophobicité de Kyte et Doolittle, qui tiens compte de :

 Combien de fois (probabilité) un certain résidu est caché ou exposé à la phase aqueuse dans une structure protéique ?

 La distribution du résidu entre une phase aqueuse et une phase hydrophobe

Il est possible de dresser un tableau avec un index d’hydropathie :
- mesure qui permet de connaître le caractère hydrophile ou hydrophobe de la chaîne latérale d’un acide aminé.
- Cela va permettre de déterminer la nature hydrophobe d’une région d’une protéine grâce à la séquence d’acides aminés.
- Si l’on tombe sur 25 acides aminés hydrophobes pour 1 protéine, il y a de forte chance qu’elle soit transmembranaire.
Il est ensuite possible de faire un graphe selon les acides aminés.
- Si on prend l’exemple d’une protéine transmembranaire à une hélice alpha hydrophobe, on se retrouvera avec un graphe de ce type-là (cf image):
Un autre exemple peut être celui de la bacteriorhodopsine,
- une petite protéine de 248 acides aminés qu’on trouve chez certaines archées, notamment les halobactéries, où elle fonctionne comme une pompe à protons utilisant l’énergie lumineuse pour générer un gradient de protons à travers la membrane cellulaire.
- Elle se possède 7 hélices alpha transmembranaire capable de capter un rétinal et d’en faire du rétinol (lac rouge).
- C’est donc un autre système photosynthétique que celui des plantes.
- Si on s’intéresse à son graphe, on a :
  - Les Tyrosines (orange) et les Tryptophanes (rouge) sont souvent à l’interface lipide-eau. Les résidus chargés (bleu : Lys, Arg, Glu, Asp) sont, quant à eux, souvent à l’extérieur de la membrane (soit à l’intérieure de la cellule soit à l’extérieur).
Cependant, la technique de Kyte et Doolittle ne fonctionne que pour les protéines à hélices transmembranaires :
- Par exemple, les arrangements stables de chaînes beta en baril ne sont pas détectable par cette technique.
- En effet, les prédictions de Kyte et Doolittle sont incapables de prédire des segments transmembranaires qui sont amphyphiliques ou en structure beta. Les canaux hydrophiles qui possèdent des sous unité internes puis externes à répétition n’émettront donc aucun signe distinctif dans le graphe.

Question 49

Q

Les pompes a protons : prot transmemb

Answer

A

Les pompes à protons sont aussi des protéines transmembranaires.
- La lumière active la pompe qui peut alors faire tourner une turbine pour la synthèse d’ATP.
  - En effet, une zone hydrophobe va être excitée par la lumière et va permettre le passage de protons de l’extérieur vers l’intérieur.
  - Ce passage de protons va permettre la compression mécanique d’ADP et de Pi pour faire de l’ATP.
La photosynthèse bactérienne suit un modèle un peu différent.
- La consommation des protons n’est pour utiliser pour faire de l’ATP mais pour crée le mouvement du flagelle.
- Le principe reste cependant le même :
  - le lumière excite la chlorophylle qui va alors capter des éléctrons. Ces électrons vont alors permettre le mouvement des H+ et donc du flagelle.

Question 50

Q

Les fusions transmemb :

Answer

A

Les fusions membranaires sont aussi d’une importance capitale pour le bon fonctionnement de la cellule.
- C’est un processus complexe qui a lieu lors de nombreux processus cellulaires, impliquant la membrane de nombreuses organelles, la plasmique ainsi que la membrane d’autres cellules ou virus.
- De plus, cette fusion ne peut pas se faire n’importe comment ; des réactions spécifiques doivent se faire selon les besoins (mort cellulaire, infection, neurotransmetteurs, …).
Lors d’une infection virale :
- la fusion peut être induite par l’hémagglutinine.
- L’HA est une glycoprotéine antigénique présente à la surface du virus de la grippe, et est responsable de la fixation de la particule virale à un récepteur situé sur la cellule cible.
- C’est une sorte de harpon par lequel le virus est capable de commencer son infection.
Lors de la fusion durant le largage d’un neurotransmetteur au niveau d’une synapse, ce sont les protéines v-SNARE et t-SNARE qui permettent l’ouverture de la vésicule.
- En effet, un mécanisme de polymérisation de ces protéines va permettre de tirer sur la vésicule pour la forcer à fusionner avec la membrane de l’organelle ou de la membrane plasmique. Suite au déversement du contenu dans le milieu désiré, il est nécessaire de recyclé les v-SNARE et t- SNARE toujours polymériser ensemble.
- C’est Hsp70 qui va permettre de les dépolymériser pour qu’elles soient à nouveau utilisables.

Question 51

Q

Les types de transport a travers une membr

Answer

A

Ainsi, on retrouve différente méthode de transport dans la cellule. Un autre type est celui des canaux protéiques.

Certains canaux sont dits :

 Uniport: Un uniport est une protéine transmembranaire permettant le déplacement dans une direction d’une seule molécule/un seul ion à travers des membranes phospholipidiques tel que la membrane plasmique. C’est un transporteur passif, son utilisation ne consomme pas d’énergie.

 Symport: Un symport est une protéine transmembranaire qui implique le déplacement d’une même direction de 2 molécules différentes ou plus ou des ions à travers des membranes phospholipidiques tel que la membrane plasmique, ce qui en fait un type de cotransporteur. En général, le ou les ions vont se déplacer en fonction du gradient électrochimique, permettant à d’autres molécules d’aller à l’encontre du gradient de concentration. Le déplacement des ions à travers la membrane relève de la diffusion facilitée et est couplée avec un transport actif de molécules. Ainsi, deux ou plusieurs molécules sont transportées.

 Antiport : Un antiport (aussi appelé contre-transporteur) est une protéine intégrale de membrane qui est impliquée dans le transport actif secondaire de deux ou plusieurs molécules ou ions différents à travers une membrane phospholipidique telle que la membrane plasmique, dans des sens opposés. Dans le transport actif secondaire, un type de soluté traverse la membrane dans le sens de son gradient électrochimique permettant ainsi à un soluté d’un autre type de se déplacer en allant à l’encontre de son gradient de concentration.

Question 52

Q

Transporteur de glucose :

Answer

A

GLUT1 est un transporteur de glucose associé à la membrane plasmique de certaines cellules de l’organisme.
- Le transporteur GLUT1 comme tous les GLUT associés sont des transporteurs de type uniport.
- Comme tous les uniports il possède 2 états dit T1 et T2 pour faire entrer le glucose.
- Les vitesses d’activité augmentent selon la concentration de la molécule que l’on veut faire entrer :
  - plus cette concentration est grande à l’extérieur, plus la vitesse sera rapide pour la faire entrer à l’intérieur et petite pour la faire sortir à l’extérieur.
  - Notons que cette vitesse est limitée à Vmax. On dit que Kt est analogue au Km de Michaelis.
La régulation des transporteurs peut être faite par certaines molécules.
- Par exemple, l’insuline régule le transporteur GLUT4 des myocytes.
- En effet, afin d’éviter d’exposer les transporteurs lorsqu’il n’y a pas de glucose à transporter, les canaux sont mis dans des vésicules cellulaires.
- Ainsi, lorsque l’insuline se fixe à son récepteur, les canaux sont transportés à l’intérieur via ces vésicules. C’est une sorte de séquestration ou de recyclage :
  - l’autre option aurait été la dégradation qui, comme d’habitude, aurait été très couteuse.
- Donc pour synthétiser, la séquestration d’un récepteur est possible par le biais d’un trafic vésiculaire mais c’est au prix d’un mécanisme de régulation complexe par l’insuline

Question 53

Q

Echangeur de chlore bicarbonate

Answer

A

Un autre type de canal interessant est l’antiport du chlore dans les globules rouges.
Ces canaux permettent de faire entrer le bicarbonate dans les globules rouges et sortir le chlore des globules rouges dans les poumons et de faire sortir le bicarbonate et entrer le chlore des globules rouges dans les tissus.
- C’est donc un canal qui change son mouvement de ions en fonction du milieu.
C’est donc un échangeur de chlore-bicarbonate dans la membrane de l’érythrocyte.
- Ce système de co-transport permet donc l’entrée et la sortie de HCO3- sans changer le potentiel électrique de la membrane.
- Son rôle est d’augmenter la capacité de transport du CO2.

Question 54

Q

Transport de Na+ et K+

Answer

A

Voyons le mécanisme présumé du transport de Na+ et K+ par une Na+K+ATPase.
- L’énergie de ce transporteur vient de l’hydrolyse de l’ATP :
  - la phosphorylation du canal coté cytosol provoque son ouverture coté externe ce qui libere les trois Na+ tout en attachant 2K+.
  - La déphosphorylation du canal provoque son ouverture coté cytosol, ce qui libere les deux K+ dans le cytosol.
- C’est donc un transporteur couplé à une pompe à ATP.
- Ce mécanisme est très chère en énergie.

Question 55

Q

le transporteur de lactose

Answer

A

D’autres transporteurs, comme le transporteur de lactose, sont couplés à un mécanisme d’ATP général ce qui revient moins chère.
On peut voir ici la structure de la Lactose prméase d’E. coli : un symport couplé au gradient de protons.

Question 56

Q

Les aquaporines

Answer

A

Les aquaporines ne sont pas que des simples tuyaux.
- C’est un uniporteur très précis avec des aa bien spécifique qui permettent la sortie et l’entrée de l’eau.
On peut voir ici la structure de l’aquaporine AQP1, une protéine tétramérique.
- L’eau doit passer librement à travers les membranes (109 S-1) qui sont hydrophobes tout en empêchant les ions de passer (H+, Na+, K+, dont certains sont plus petits que l’eau).

Question 57

Q

La memb contient aussi des senseurs de temperature:

Answer

A

En plus de tout ces canaux, la membrane contient aussi des sensseures de teempérature.
- En effet, lorsque la température augmente, la cellule à des problèmes d’hyperfluidisation de la membrane qui peuvent provoquer des chocs thermiques et la mort cellulaire.
- Pour éviter cela, la cellule va procéder à une saturation de ses membranes via le cholestérol (petit à petit).
- Il est aussi possible de la saturé en phospholipes.
- De la même manière, lorsque le froid arrive, il est nécessaire de désaturer la membrane.
- Ainsi, des enzymes permettent la saturation et désaturation de la membrane.

Mais comment la température est-elle sentie par les plantes ?

En effet, il est nécessaire pour la plante de stabilisé les agrégats de protéines se formant lors de la montée de température.
C’est Hsp17.3b qui va être induite jusqu’à 3’000x lorsque la température pase de 0°C à 38°C.
Pour cela, l’entrée de calcium extracellualire est essentiel pour la signalisation d’un choc thermique.
En effet, la température va provoquer l’ouverture du calcium et la signalisation pour activer les Hsp17.3b.
Pour prouver cela, une expérience a été menée grâce à un fort chélateur spécifique de Ca+2, l’EGTA.
- En presence d’EGTA, le calcium est neutralisé et la cascade de réaction qui provoque l’activation de Hsp17.3b n’a pas lieu.
- On peut voir ici le model de la cascade de signalisation des changements de température chez les plantes.
- Notons le rôle de signalisation que la calmoduline possède.
- La liaison avec l’ion calcium induit un changement de conformation de la protéine et forme un complexe calcium-calmoduline (Ca2+-CaM). Ce complexe permet l’activation, par changement de conformation, de nombreuses protéines, dont l’adénylate cyclase.

Chez les animaux, la chaleur, tout comme la capsaicin, sont capable d’activer un récepteur membranaire qui fait entrer (de façon transitoire) des ions de calcium.

Autant dans le cas de la chaleur que dans le cas de la capsaicin, des Haet Shock Protein (ou HSP, les chaperonnes) sont formées.

Question 58

Q

La Myoglobine et l’Hémoglobine

-en generale :

*histoire

*fonction O2

Answer

A

La Myoglobine, tout comme l’Hémoglobine :
- a la capacité de transporter de l’oxygène.
Histoire evolutive de Mb et Hd
- Cependant, avant d’en arriver là, il faut savoir qu’un long processus a du se mettre en place pour que la vie puisse utiliser l’O2 oxydant.
- Sur la terre primitive, l’atmosphère était riche en H2NH3 et CH4. L’environnement était donc réducteur. Le soleil, du a ses vents solaires, fait perdre à l’atmosphère des protons H+.
- Avec le temps, l’atmosphère devient oxydante.
- En changeant d’état (passant de gazeux à liquide), la Terre a pu accueillir les premiers organismes. C’est plusieurs millions d’années après que l’oxygène O2 apparait.
- L’oxygène est donc présent dans l’atmosphère depuis plusieurs milliards d’années déjà. Cependant, cela ne fait pas longtemps que les organismes s’en servent.
L’O2 :
- est devenu d’une importance capitale pour la plupart des êtres vivants (surtout pour ce qui se déplacent). L’apport d’oxygène aux cellules est le facteur limitant pour le métabolisme des animaux et finalement pour leur taille.
- Il est donc indispensable d’avoir des tissus capables de transporter efficacement de l’oxygène. Sans un système de transport éfficace notre taille serait rester celle des amibes.
- Notons tout de même que notre manière de transporter de l’O2 n’est pas unique et que d’autres molécules sont aussi capables de le faire chez les insectes.

Question 59

Q

En generale : la myoglobine

Answer

A

La myoglobine, :
- couramment symbolisée par Mb, est une métalloprotéine contenant un hème de fer présente dans les muscles des vertébrés, et particulièrement des mammifères.
Pour comprendre comment cet hème de fer a pu se former, une expérience a été menée :

 Un cadre de 100 acides aminés a d’abord été synthétisé (complétement aléatoirement)

 Cette protéine est ensuite introduite dans une bactérie

 La bactérie la dégrade à 90%

 Dans les 10% restant, 8% étaient insolubles et 2% (donc 150 acides aminés) étaient soluble

 Un hème de Fer a ensuite été ajouté

 Une proportion importante de ces acides aminés a eu une affinité avec l’hème de Fer

On peut donc en conclure que l’évolution de « Hème de Fer + O2 » a de grande chance de se faire.
La myoglobine :
- se trouve essentiellement dans nos muscles, proche des mitochondries.
- Elle permet d’attacher suffisamment fort l’O2 pour le transporter, mais moins fortement que les mitochondries.
L’hème transporteur d’oxygène est donc un hème de Fer qui change de conformation en fonction de la présence ou non d’O2 :

 Si O2 n’est pas présent alors l’hème ne sera pas plat et le Fer sera tiré vers le bas par une histidine

 Si O2 est présent alors l’hème sera à plat

Notons que l’hème de Fer est un tétrapyrole:
- une protoporphyrine IX contenant du Fe 2+ .

Question 60

Q

Myoglobine et Hemoglobine

ressemblances
diff

Answer

A

La myoglobine et l’hémoglobine :
- sont en fait deux protéines se ressemblant énormement.
  - On peut le voir sur cette alignement des acides aminés qui montrent que les deux se ressemblent en terme de longueur et de nombreuses régions sont completement conservées.
- Des organismes primitif, style protozoaire, possèdent de la myoglobine tandis que des organismes plus complexes possèdent de l’hémoglobines (tétramère).
Mais pourquoi un tétramère ?
- L’hémoglobine possède en effet quelques acides aminés en plus que la myoglobine. Cette petite différence change le lieu où le N-terminal se trouve et crée une différence de charge.
- Cette différence de charge permet à l’hémoglobine de travailler en meute et de jouer avec un effet allostérique : un oxygène fixé à lui permet de facilité l’attachement de l’O2 aux 3 hèmes voisins.
- Cet effet n’est donc pas présent chez la myoglobine. On parle d’attachement coopératif.

On a donc ici la liaison d’une molécule (O2) à un ligand:

 Ligand : une molécule ou ion (généralement petite) qui est lié à une autre molécule (généralement plus grande)

 Liaison coopérative du ligand : la liaison du ligand à 1 site de liaison affecte les propriétés des autres sites de liaisons (ou sous-unités) de la même protéine

 La constante K association = 1/Kdissociation. Les constantes K vont dépendre des sites actifs et du ligand.

Grâce à cette constante K, il est possible de dresser un graphe pour comprendre la différence entre la myoglobine et l’hémoglobine.
Sur ce graphe, :
- on voit que l’hémoglobine est non seulement super efficace pour charger l’oxygène, mais aussi pour le décharger ce qui la rend beaucoup plus intéressante que la myoglobine.
- Dans les poumons,:
  - on retrouve plus ou moins la même affinité pour l’O2 pour l’hémoglobine et la myoglobine (quoique la myoglobine à un peu plus d’affinité). Toutes les deux se charges en O2 fortement.
  - C’est dans les tissus que l’hémoglobine devient intéressante. En effet, la décharge de l’O2 se fait aussi sous effet allostérique et donc beaucoup plus rapidement et facilement que la myoglobine.
- Il est possible de mesurer l’affinité de l’O2 avec l’hémoglobine dans le cas où l’effet allostérique n’existerait pas (représenté par la courbe bleu). L’hémoglobine seule n’a donc pas une affinité incroyable avec l’oxygène, mais cet effet allostérique change tout.
  - En effet, avec une courbe sigmoïde, Hb peut décharger (libérer, dissocier) une plus grande partie de sa capacité de charge d’O2 dans les tissus qu’il ne pourrait en libérer avec la construction non cooperative
    *

Question 61

Q

Hemoglobine

-etats

Answer

A

Au niveau moléculaire, cela est possible grâce à un changement de conformation.
Deux états sont possibles :

 L’état relaxé (ou oxy) où les charges n’interagissent pas entre elles

 L’état tendu (ou désoxy) où les charges interagissent et donc où la molécule est plus compact et dense

On a donc une déformation liée à la fixation d’oxygène.
Cependant, cette correspondance entre état relaxé et tendu n’est pas parfaite :
- parfois les charges interagissent sans oxygène
Il y a donc une coopérativité et la formation de ponts salins et de liaisons H entre les sous- unités de l’hémoglobine par l’extrémité des chaines alpha et beta de la forme désoxy.
Une autre conséquence de ces deux états est la conformation qui va être ressentie par toute la molécule.
C’est ce que l’on appelle la communication allostérique :

 La liaison à O2 modifie la position de Fe+2 dans l’hème de Hb, initiant des changements structurels.

 En l’absence d’O2 lié, le fer hémique se situe légèrement en dehors du plan de la porphyrine, lié à un N d’un résidu His, le proximal His (His F8).

 Lorsque l’O2 se lie, Fe passe dans le plan de l’hème, entraînant avec lui son résidu His F8

C’est par une rotation de 15° que la structure quaternaire de l‘hémoglobine passe de T (tendu) à R (relax). On peut noter une fermeture de la cavité lors du passage de deoxyhemoglobine (relax) à oxyhemoglobine (tendu).
Ces chaines ne réagissent pas uniquement à l’oxygène mais aussi au pH. En effet, l’effet de Bohr influence aussi la conformation de l’hémoglobine

Question 62

Q

Effet bohr

Answer

A

L’effet Bohr :
- se définie comme la diminution de l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène (O2) lors d’une augmentation de la pression partielle en dioxyde de carbone (CO2) ou d’une diminution de pH.
- L’hémoglobine attache l’O2 dans les milieux basiques et le relâcher dans les milieux acides. C’est pourquoi, les muscles seront plutôt acides et que les poumons plutôt basiques.
- Cet effet borh ameliore la cooperation
- Cet effet Bohr est, une fois de plus, possible grâce à la coopérativité de l’hémoglobine. Sans elle, la différence de pH aurait eu un effet minime sur l’hémoglobine.
- Plusieurs résidus ont un pK affecté par le changement de forme. En particulier l’histidine terminale de la chaîne Beta et le groupe aminé N-terminal de la chaîne alpha qui sont obligatoirement protonés dans la forme désoxy.
  - Le groupe aminé N-terminal libre a un pK=8 (environnement hydrophobe).
  - 30-40% de l’effet Bohr viennent d’autres résidus (His122alpha, His143beta, Lys82beta, etc).
  - La désoxyHb transporte donc plus de H+ que l’oxyHb.
  - Plus un tissus est acide, plus il reçoit d’oxygène.

Question 63

Q

Le tampon carbonate

Answer

A

Dans les tampons d’excès de H+ dans les tissus :

 50% His C-terminale et NH2 N-terminaux

 40% autres groupes à effet Bohr

 10% autres tampons

Le CO2 est l’un des produits de la respiration oxydative. Il est tout aussi important de l’éliminé que de récupérer l’oxygène des poumons.
Le problème du CO2 est qu’il est peu soluble et donc ne diffuse pas facilement.
- Il est donc nécessaire de le solubilisé pour le transporter. On a donc une transformation de ce CO2 en bicarbonate par l’érythrocyte.
En effet, le CO2 est converti en HCO3- et H+ dans les érythrocytes par l’anhydrase carbonique.
- Les H+ (montrer par une flèche) sont fixés par effet Bohr.
- Le HCO3- peut quitter l’érythrocyte en échange de Cl-.
Le CO2 réagit avec un groupe aminé N-terminal pour former un carbamate R-NH-CO2- et H+ .
Transport vers les poumons :
- 78% HCO3-
- 13% carbamate
- 9% CO2 dissout
Le temps de vie d’un érythrocyte :
- est de deux à trois mois.
- Chaque globule rouge contient beaucoup d’hémoglobine pour fixer l’O2.
- En plus de cela, le CO2 diffuse des muscles aux globules rouges et est transformer en bicarbonate par l’anhydrase carbonique.
  - Ensuite, le bicarbonate sort du globule rouge grâce à l’entrée du chlore.
  - Donc l’érythrocyte est aussi un transporteur de chlore.
Lorsque l’érythrocyte est au niveau des poumons, le bicarbonate entre de nouveau de celui- ci et le chlore en sort. Le HCO3- devient du CO2 (et de l’eau) qui sortira des globules rouges puis des poumons.
L’enzyme « anhydrase carbonique » (et la plupart des enzymes) doit être capable d’aller dans les deux sens de synthétisation.
- Mais qu’est ce qui lui permet de faire ça ?
  - Ce sont les différences de concentrations et la différence de pH qui dictent l’action de cette enzyme.
  - Ce sont 80% du CO2 qui est éliminé de cette manière. Les 20% restant se retrouvent sous forme de carbamate dans les globules rouges.

L’érythrocyte transporte (examen) donc :

 78% HCO3-

 13% carbamate

 9% CO2 dissout

Question 64

Q

Effet du BPG :

Answer

A

Le globule rouge :
- n’a donc pas grand-chose en lui mais garde un style de vie « vivant » en transformant du CO2 en bicarbonate, en possédant des symport, en aillant des enzymes, …
Pourrait-on dire que la cellule est vivante même si elle n’est pas capable de se reproduire et de faire des protéines ?
- Pour le prof oui car maintien des réactions (autre aspect du vivant).
- En montant le haut d’une montagne, on risque d’être en anoxie (manque d’oxygène).
  - Pour contrer ce manque, le corps crée du 2,3-BPG qui change la qualité et les propriétés de l’hémoglobine.
En effet, le BPG :
- s’introduit au cœur du tétramère de l’hémoglobine et change ses propriétés en shiftant la courbe sigmoïdale de Bohr vers la droite.
- On a donc un paradoxe :
  - on diminue l’affinité pour augmenter l’efficacité de transport. En fait, en effet l’hémoglobine chargera moins d’O2 selon la courbe mais il va pouvoir le relâcher beaucoup plus facilement au niveau des tissus ce qui permet de garder une circulation normal de l’O2.
- C’est une régulation à court terme (quelques jours) puis des régulations à plus long terme prennent le relais (deux ou trois semaines).
- Le BPG permet de stabiliser la forme désoxy de l’hémoglobine.
  - Suite à sa fixation dans le trou central du Hb, une régulation allostérique (ailleurs qu’au site actif) s’en suit.

Answer 65

A

Lors de la periode de gestation, la mère doit pouvoir faire diffuser l’oxygène de son sang à celui du bébé.
- L’hémoglobine de la mère doit donc avoir moins d’affinité avec l’O2 que l’hémoglobine du bébé.
Comment cela est-il possible ?
- C’est grâce à l’hémoglobine fœtale (ou HbF) qui est un type d’hémoglobine synthétisé chez le fœtus et le nouveau-né et disparaissant par la suite.
- C’est une hémoglobine avec deux sous-unités gamma et deux alpha qui lui permet de mieux capter l’oxygène.
- A la naissance, il est nécessaire de changer l’hémoglobine gamma en hémoglobine beta ce qui est terrible pour le bébé et provoque la jaunisse.
Comme on peut le voir sur ce graphe, certaines personnes resynthétisent de la gamma hémoglobine une fois adulte.
- En effet, à cause de certaines maladies comme la thalassémie le corps compense le manque comme il peut.
- En effet, une fraction inférieure de molécules d’Hb liées à la liaison 2,3-BPG signifie qu’une plus grande partie de l’Hb fœtale est à l’état R (plus que l’Hb chez la mère). Ainsi, dans des conditions physiologiques (à la concentration de 2,3-BPG trouvée dans les érythrocytes), l’Hb fœtale a une affinité de liaison à l’O2 plus élevée que l’Hb chez la mère.
- L’Hb fœtale lie donc l’O2 plus étroitement que l’Hb maternelle (adulte) parce que l’Hb fœtale lie moins le 2,3-BPG que l’Hb adulte.
- Ainsi, la mère peut « délivrer » de l’O2 au fœtus.
- Le 2,3-BPG se lie préferenciellement aux tétramères hémoglobines contenant de la beta- hemoglobine telle que l’alpha2beta2 hémoglobine de l’adulte, mais pas à l’alpha2gamma2 hémoglobine fœtal.
- Ainsi, le côté mère du placenta produit plus de 2,3-BPG que du côté du fœtus et une grande quantité d’oxygène peut être libérée de l’hémoglobine maternelle, qui peut alors se diffuser et se lier à l’hémoglobine fœtale, qui présente une affinité beaucoup plus faible pour 2,3-BPG.
Un autre gaz, mise à part l’O2 et le CO2, doit être transporté par les érythrocytes vers les tissus : le NO.

 Le NO est un vasodilatateur

 NO est produit dans les poumons et se fixe sur Hb

 NO est relâché préférentiellement par désoxyHb

 Là où plus de O2 est relâché, plus de NO est relâché, donc vasodilatation préférentielle dans les tissus actifs

L’hémoglobine permet donc de transporter de multiples choses :

 O2 des poumons aux tissus

 CO2 des tissus aux poumons

 H+ des tissus aux poumons

 NO des poumons aux tissus

Answer 66

A

Le plus grand danger pour l’hémoglobine est l’empoisonnement au CO.
- En effet, le CO est un inhibiteur compétitif de l’O2 car :
  - à une bien plus forte affinité pour l’hémoglobine que lui.
  - Il est insensible à l’effet Bohr et donc n’est pas relâché lorsque le pH change.
- Lors d’un feu, il est souvent nécessaire de donner aux victimes de l’O2 pure afin qu’il entre en compétition avec le CO par saturation.
Linus Pauling s’est aussi intéresser aux cas de la thalassémie :
- En effet, en analysant des cas d’anémie falciforme (drépanocytose), il remarque que le glutamate en position 6 de la structure primaire des globules rouges devenait de la valine. Ce petit changement provoque la polymérisation des hémoglobines en hélice à 14 brins ce qui est complètement contreproductif pour capturer de l’oxygène en plus de provoquer la lyse des érythrocytes.
- En effet, cette tendance à faire des filaments ne permet pas aux érythrocytes de bouger correctement et donc sont incapables de remplir leur fonction.
Mais comment l’anémie falciforme a-t-elle résisté à l’évolution ?
- En fait, il a été observer qu’une résistance à la malaria était développer à cause (ou grâce) à l’anémie falciforme.
- En effet, cette maladie « veut » des globules rouges sains pour se miltiplier, ce qu’elle n’a pas avec un malade d’anémie falciforme. Un avantage évolutif est donc observer dans les populations anémiques.
- Notons que l’hétérozygote suffit pour résister au paludisme.
- Une correspondance peut se voir entre malaria et anémie sur une carte géographique. Si l’on revient à l’anémie, cinq origines différentes de la mutation ont pu être identifiées, correspondant toutes à des régions affectés par le paludisme.
Comme expliquer avant, certains anémiques réactivent leur gamma hémoglobine pour contrer l’anémie?
- Ce n’est pas génial mais cela permet d’augmenter le taux d’O2 capturé.
- Petite parenthèse : avec CRISP/Cas 9, il serait théoriquement possible de changer la mutation pour soigner cette anémie (thérapie génique ciblée).

Answer 67

A

Les globines :
- se retrouvent dans tous les types d’organismes vivant. On les retrouve de ce fait aussi chez les plantes où elles permettent d’amener spécifiquement de l’oxygène aux bactéries sans affecter la nitrogénase de la plante (Leghemoglobine de Lupin = hémoprotéine dans les nodules de la racine).
Si l’on synthétise les propriétés de l’hémoglobine, on a :

 Transport de plusieurs substrats (O2, CO2, H+, NO)

 Plusieurs sites actifs

 Sensibilité au pH (effet Bohr)

 Tampon du pH

 Coopérativité

 Contrôle allostérique (BPG)

 Adaptation aux besoins locaux (effet Bohr, NO)

Answer 68

A

Mais pourquoi purifier des protéines ?
- Nous possédons 25’000 à 30’000 gènes différents dans nos cellules qui codent tous pour beaucoup plus de protéines.
- En purifier la protéine, on est capable de la comprendre et de la caractériser. Ainsi, nous sommes en mesure d’agir sur elles (niveau médical par exemple).
- Il y a cependant un problème : la protéine n’aime pas cela.
  De lors, il est possible que la protéine soit complètement différente dans son état cristallisé par rapport à son état natif (elle n’a n’y ses voisines, ni le milieu naturelle dans lequel elle évolue).
Notons la différence entre protéines constitutives (qui sont constantes dans toutes les cellules) et celles qui ne le sont pas.
En comprenant la structure et la fonction des protéines, il est alors possible de résoudre des mécanismes biologiques et ainsi trouver des solutions curatives (Exemple du prix Nobel : les cellules saines attaquent les cellules cancéreuses).
Le matériel de départ
- Il existe certaines règles de base pour purifier une protéine :

 Pour commencer, il faut avoir une source très riche en protéines dont nous avons besoin : Organisme, tissu, type de cellule, …

 Il est conseillé d’isoler l’organite comme étape de purification initiale afin d’enrichir une quantité de notre protéine.

 Si la protéine est à peine exprimée dans notre tissu d’intérêt, il est possible d’utiliser un système d’expression bactérien ou de cellule eucaryote.

(Notons que cette étape peut déjà amener certains artéfacts : surexprimé une protéine dans une bactérie donnera la forme non glycolisé de celle-ci car la bactérie ne peut pas le faire)

En effet, il est très important de bien commencer car les chances de réussite augmentent exponentiellement avec l’accroissement linéaire de la concentration relative de notre protéine dans un tissu.
Une fois le tissu choisi, on peut procéder aux méthodes d’homogénéisation. Différentes techniques s’offrent à nous :

 Homogénéisateur à main ou à moteur

 Mixer

 Ultrasons

 Agitateur à billes

 « French press » : Une presse à 100 atm, les cellules sont écrasées sans être tué puis on passe à 1 atm d’un coup sec ce qui fait exploser les cellules.

Le problème numéro 1 après l’homogénéisation est les protéases libérées par le lysosome. En effet, elles vont dégradés les protéines du milieu et notre protéine d’intérêt va être digérée.
Pour contrer les protéases, il est possible de travailler à basse température et ainsi les protéases réagiront moins vite (on dit qu’elles travaillent 2x moins vite à 10°C de moins et 2x plus vite à 10°C de plus).
- Imaginons que la vitesse de digestion d’une protéase soit de 1 pont peptidique par minute (pp/m) à 20°C, on sera alors à 2pp/m à 30°C, à 3ppm/m à 40°C puis à 50°C on dépasse la température physiologique et donc la protéine se dénature seul (on aura alors une courbe augmentant jusqu’à 40°C puis une chute libre).
- En règle général, on travaille donc à 4°C (et on se dépêche).
- La température seul n’est pas suffisante, il faut aussi utiliser des inhibiteurs de Serine protéases (EDTA et EGTA).
- Attention tout de même, à ce stade il ne faut pas encore utiliser de détergents.

Après avoir homogéiné, on peut centrifuger pour enlever les gros morceaux.

C’est depuis le 19ème siècle que l’on connaît latechnique de centrifugation pour séparer les parties solubles des non solubles. Soumis à l’effet centrifuge, les structures les plus massives se rassemblent dans le fond du tube en rotation.
En général, plus on centrifuge, plus notre protéine sera enrichie.
Attention tout de même : le temps passé à centrifuger est du temps gagner par les protéases pour digérer nos protéines.
A la fin de la centrifugation, on a différentes fractions que l’on va pouvoir analyser. C’est pour cela que l’on parle de fractionnement cellulaire.

Suite à la centrifugation, on peut séparer les parties hydrophobes des hydrophiles:

Mais comment faire lorsque notre protéine est transmembranaire (donc une partie hydrophobe et hydrophyle)?
- On utilise alors differents traitements pour intéragir directement avec la protéine en question (attention d’enrichir la bonne protéine).
- Les traitements possibles sont les suivants :

 Traitements avec des concentrations croissantes de sel

 Traitements de solubilisation avec des lipases

 Traitements avec des concentrations croissantes de détergents non-ioniques

Pour le traitement aux détergents, il est nécessaire qu’ils soient très doux.
En effet, un détergent trop fort comme du SDS ou de l’urée vont dénaturer les protéines (deviennent linéaires et chargées négativement).
Travailler avec des détergents doux puis cristallisation permet donc d’étudier les structures tridimensionnelles d’une protéine.

Prenons l’exemple ci-contre :

on souhaite purifier la protéine transmembranaire sans sa GPI-linked protein ni ses protéines périphériques.
Il est possible de travailler sur les membranes avec un chélateur de calcium, de l’urée ou un changement de pH pour éviter l’agrégation de la protéine transmembranaire d’intérêt et une phospholipase (ici la C) pour lyser la GPI-linked protein.
On poursuit en ajoutant un détergent doux et polaire pour capturer et isoler notre protéine transmembranaire.
Ainsi, on enrichie la protéine qui nous intéresse.
Il est très important dans la démarre de centrifuger avant de solubiliser avec le détergent doux.

Answer 69

A

(A) Pour le cas du fractionnement selon la vitesse de sédimentation, le procédé est simple:
- on pose l’échantillon de protéines dans une solution aqueuse avec un gradient de saccharose stabilisé de 5% à 20%.
- On procède ensuite à une centrifugation qui se sépareront selon leur vitesse de sédimentation à un certain niveau dans l’éprouvette.
- Pour finir, on vide l’éprouvette par fractionnement afin de mesurer les différentes vitesses de sédentarisation mais surtout pour séparer les protéines.
(B) Pour le cas du fractionnement selon la densité, on procède ainsi:
- on commence par créer une solution aqueuse avec un gradient de saccharose raide de 20% à 70%.
- On laisse ensuite le mélange se dissocier selon la densité de chaque composant.
- On a alors la densité de chaque composant qui peut être comparé.

Answer 70

A

Lorsque la quantité des protéines que l’on veut observer est très grande (exemple de la protéomique des ethioplastes), il est possible de faire un gel en 2D, c’est-à-dire avec deux caractérisations des protéines.
Cette technique permet d’éviter la superposition de deux protéines sur le gel ayant la même caractéristique.
Le gel en 2D permet alors de voir plus (pour ne pas dire toutes) les protéines d’un mélange.
De plus, chaque protéine gardera le même spot si on refait l’expérience.
Ainsi, il est possible de faire une quantification de chaque protéine. Aujourd’hui on l’a fait avec la spectrométrie de masse.

Answer 71

A

Toutes ces techniques de purifications ne permettent pas à elles seules de purifier suffisamment notre protéine. Que faire alors ?
On utilise des sels, notamment le sulfate d’ammonium.
- Un peu de sel disperse les charges électriques et augmente la solubilité (« salting in ») mais beaucoup de sel diminue la concentration d’eau disponible pour dissoudre la protéine (« salting out »).
- Ainsi, le sel à haute concentration annule la répulsion naturelle entre protéines (plus de politesse moléculaire).
- Les protéines vont alors se coller entre elles (et pas s’agréger !! -> Pas de dénaturation) ce qui va les rendre insoluble.
- Selon la quantité de sel (0.8M de sel d’ammonium pour précipiter fibrinogen contre 2.4M pour précipiter albumine de sérum), on peut alors centrifuger et précipiter sélectivement les protéines ce qui permet d’augmenter la pureté de notre protéine d’intérêt.
- De plus, cet effet est réversible et il est donc possible de resolubiliser notre protéine après l’ajout du sel sans la dénaturer. Certaines industries vendent les protéines directement dans l’ammonium sulfate.

En faisant différente concentration de sel, on peut précipiter différente protéine spécifique :

 Un peu de sel -> protéine 1 devient insoluble -> on enlève la protéine 1

 On ajoute du sel -> protéine 2 devient insoluble -> on enlève la protéine 2

…
Il est cependant nécessaire de laisser suffisamment le temps aux protéines de devenir insoluble.

La dénaturation d’une protéine peut être faite par 8M l’urée.
Il a été montré que l’énergie libre du transfert de l’acide aminé apolaire dans les 8M urée augmente négativement en même temps que les chaînes latérales deviennent de plus en plus apolaires.
On retrouve des protéines dénaturés dans les corps d’inclusion des bactéries. En fait, ces protéines sont toutes semblables. Il est donc possible de lyser la bactérie, récupérer le corps d’inclusion et renaturer la protéine pour qu’elle soit tout de suite pure
Pour renaturer les corps d’inclusions, il existe un processus appelé processus d’Arfinsen :
- Arfinsen prouve que l’information nécessaire à la bonne conformation d’une protéine se trouve dans sa séquence primaire.

Answer 72

A

Le principe de la dialyse consiste à séparer deux solutions par une membrane.
On distingue différents types de membranes, les membranes hémiperméables (qui ne laissent passer que le solvant) et dialysantes (pores de diamètre de l’ordre du nanomètre (nm), identiques et connus) qui laissent passer le solvant et les solutés en dessous d’une certaine taille.
Par effet de diffusion (due à l’agitation moléculaire) les petites molécules traverseront la membrane, tandis que les grosses molécules (souvent macromolécules) seront retenues d’un côté.
Cette technique permet de :
- Echanger la solution tampon (ou buffer) et les ions
- Eliminer les peptides et protéines plus petites que les pores
- Concentrer la protéine d’intérêt
On utilise entre autre du Ficoll, un polysaccharide hydrophile très ramifié qui, après centrifugation, va permettre de poser les protéines en couche de haute en bas (voir le fractionnement).

Answer 73

A

Un autre problème se pose avec les corps d’inclusions ;
- certaines chaperonnes sont restées coincées dedans.

Comment s’en débarrasser ?

On utilise la chromatographie.
- La chromatographie repose sur l’entraînement d’un échantillon dissous par une phase mobile (ou éluant) à
  travers une phase stationnaire (ou phase fixe).
- La phase stationnaire :
  - fixée soit sur la surface intérieure d’une colonne soit sur une surface plane, retient plus ou moins
    fortement les substances contenues dans l’échantillon dilué selon l’intensité des forces d’interactions de faible
    énergie(comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire.
- Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.
- Les différents composants de l’échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier.
  - Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire.
La maîtrise de toutes les conditions de séparation permet la reproductibilité parfaite du temps de migration d’un composé donné.

Il existe différent appareil pour la chromatographie :

 Colonne de Séparation

 Détecteurs des pics d’UV

 Collecteurs de faction

 Poubelle

Attention à la température de tous le dispositif qui doit rester à 4°C (plus la protéine est pure, moins la température importe).
Ce sont 3 types de matrices qui sont utilisées en chromatographie :

Par gel-filtration ou tamisage moléculaire :
- Le tamisage moléculaire permet d’entrer en interaction uniquement avec les protéines les plus petites.
- Les grosses protéines passent vite la solution de bille et se retrouve en bas de la colonne (attention au agrégat et à la limite de la taille des protéines.
Echangeuse d’ion :
- Ici, on s’arrange pour que les protéines et les billes soient chargées de signes opposés.
- On pourra alors interagir avec certaine protéine selon la charge.
Chromatographie par interactions hydrophobes
D’affinité :
- Les billes possèdent un ligand qui interagie avec certaines protéines (parexemple les protéases + ATP).

Answer 74

A

La chromatographie par tamisage moléculaire ou gel filtration :
- est une technique peu dénaturante où l’on utilise une matrice de type « Sephadex » le plus souvent.
- La grande popularité de cette technique vient du fait qu’elle peut s’appliquer sur une large gamme de masses moléculaires.

La filtration sur gel :
La glycosylation d’une protéine en altère aussi fortement la géométrie. C’est pourquoi la masse des protéines glycosylées est souvent surestimée.
- sépare les molécules selon leur taille, plus spécifiquement leur rayon de Stokes.
- Cependant, puisque la taille d’une molécule d’une catégorie donnée est généralement proportionnelle à sa masse, cette technique est appliquée à la séparation selon la masse.

Cependant, il ne faut jamais oublier que les relations entre le rayon de Stokes, la taille et la masse, sont affectées par de nombreux facteurs:
- La géométrie de la molécule est un des principaux facteurs.
  - En effet une protéine fibrillaire (allongée) et une protéine globulaire de même masse ne se comporteront pas de la même façon dans un gel
- La glycosylation d’une protéine en altère aussi fortement la géométrie.
  - C’est pourquoi la masse des protéines glycosylées est souvent surestimée.
- L’hydratation :
  - quoique dans une moindre mesure, peut aussi affecter le rayon de Stokes.
- La présence de sels, d’agents chaotropiques, de détergents, etc., peut aussi modifier le comportement d’une protéine dans une filtration sur gel.
La résine d’un tel gel est constituée de microbilles très poreuses.
- Le diamètre des pores d’une résine donnée est variable, mais à l’intérieur de certaines limites précises.
- Certaines molécules seront trop grosses pour entrer dans aucune bille et ne peuvent diffuser qu’à l’extérieur dans le liquide qui les entoure. Elles prendront donc peu de temps pour éluer hors du gel.
- Au contraire, certaines autres seront suffisamment petites pour diffuser à l’intérieur de toutes les billes en plus de l’espace extérieur. Elles seront retardées et prendront beaucoup plus de temps pour sortir de la colonne.
- Certaines autres molécules, de taille intermédiaire, pourront entrer dans certains pores de certaines billes. Elles circuleront donc dans une certaine proportion des billes, en plus de l’espace externe.
- Plus elles seront petites, plus cette proportion sera grande.
  - Elles prendront alors un certain temps (inférieur aux plus petites, mais supérieur aux plus grosses) pour sortir du gel.
  - Ce temps sera donc proportionnel à leur rayon de Stokes, donc indirectement leur taille, donc à leur masse.
Un gel donné à un domaine de fractionnement spécifique (exprimé en termes de masse moléculaire) à l’intérieur duquel les protéines vont prendre, pour sortir du gel, un temps proportionnel à leur taille, donc à leur poids.
- À l’intérieur de cette marge, les molécules peuvent être séparées les unes des autres.
  - Les molécules plus grosses que la limite supérieure de fractionnement, la limite d’exclusion, vont donc sortir ensemble, assez rapidement.
  - Les molécules plus petites que la limite inférieure sortiront ensemble beaucoup plus tard.
  - Dans ces deux cas il est évidemment impossible de séparer les molécules selon leur masse.
  - Les molécules ayant une masse entre ces deux limites pourront donc être séparées les unes des autres.
  - Ces limites sont appelées domaine de fractionnement.
Il existe plusieurs types de résine ayant des domaines de fractionnement différents selon les besoins qu’on a.
- Chaque colonne faite avec une résine donnée a donc des caractéristiques différentes.
- Cette technique dilue les protéines à l’infinie et donc tout complexe non attaché de manière covalente sera dissocier sous la dilution.
- Il est important de faire attention lorsque l’on utilise cette technique car les structures quaternaires des protéines risquent d’en être altérées.
Le débit doit être très stable et lent si on veut obtenir une bonne résolution.
- Les résines de filtration sur gel sont plutôt fragiles, particulièrement celles ayant une limite d’exclusion élevée car elles ont une grande porosité.
- Les vitesses de débit et les pressions hydrostatiques doivent donc être soigneusement contrôlées pour éviter que les billes du gel éclatent.
  - Comme les pompes péristaltiques peuvent développer des pressions assez fortes, on doit utiliser ces appareils avec précaution.
Les filtrations sur gel peuvent se faire sans problème à température de la pièce.
- Cependant, elles se font souvent à 4°C, dans une chambre froide ou un réfrigérateur à chromatographie, pour éviter la dégradation des protéines.
- C’est évidemment le cas lors de la purification de protéine où la stabilité des protéines est cruciale.
Il arrive que l’activité d’une enzyme soit visible sur le graphique de notre gel filtration.

Cette activité montre que la purification n’est pas encore parfaite puisqu’il y a toujours des interactions entre protéines.

 Les grandes molécules sont exclues des pores et ne voient que le volume mort V0

 Les petites molécules utilisent tout le volume interne des pores Vi et voient donc Vt = V0 + Vi

 Les molécues intermédiaires voient un volume d’élution Ve = V0 + Kd Vi

 Kd = (Ve – V0)/Vi est entre 0 et 1

 Kd esntre 0.15 et 0.9 ~ log masse

 Influence de la forme de la protéine ! (globulaire ou fibrillaire)

 Influence de glycanes

 Précision ± 10%

Notons que ces chiffres sont important !

Comme expliquer avant, la forme de la protéine joue un rôle important dans le comportement de celle-ci et dans nos résultats.
- Dans le cas d’une protéine globuaire, la temps nécessaire à la protéine pour descendre la colonne est proportionel à son poids moléculaires :
Cependant, certaines protéines sont fibrillaires.
- Celle-ci auront tendance à moins visitées les billes pour un même poids moléculaire.
- Elles sortiront donc bien plus tôt qu’attendu.
- Cette technique est donc très utile pour les protéines globulaires mais pas pour les fibrillaires.

Answer 75

A

La chromatographie par échange d’ions :
- sépare les molécules selon leurs groupes chargés respectifs.
- Les ions de l’analyte subissent des interactions ioniques avec des charges opposées fixées sur la phase stationnaire, ce qui entraîne leur rétention.
- La phase stationnaire en question est constituée d’une matrice immobile qui contient des groupes fonctionnels chargés.
Ce procédé de séparation est basé sur des processus d’échange d’ions se produisant entre les analytes dans la phase mobile et la résine fixée sur la colonne.
La chromatographie d’échange d’ions est utilisée pour séparer les anions et les cations inorganiques et organiques.
- La séparation des anions est réalisée avec une colonne d’échange anionique et la séparation des cations est réalisée avec une colonne d’échange cationique.
- Les résines utilisées sont de type sépharose, séphacryl ou celluloses substituées que l’on va charger par différents groupements :

 Chargés négativement (échange de cation)

Sulfoniques
Carboxyliques
Phosphates
Sulfoéthyle

 Chargés positivement (échange d’anions)

Diéthylaminoéthyl (DEAD)
Aminoéthyl
Triméthylamine

Ce support chargé forme la phase stationnaire dans la colonne.

On sait que les protéines ont des charges variables en fonction du pH.
Ainsi, chaque protéine en fonction de sa séquence primaire, présente une courbe particulière de charge en fonction du pH.
Chaque protéine à un pHi définit pour lequel elle n’a pas de charge.
Si le pH >pHi :
- la protéine sera chargée négativement
si le pH<phi :>
<li>la protéine sera chargée <strong>positivement</strong>.</li>
</phi>
Cette propriété sera utilisée pour la séparation par chromatographie d’échange d’ion.
En effet, il est donc possible d’éluer en faisant variant le pH.
- Certaines protéines seront sensibles à un certain pH différent d’une autre.
- Il est alors possible, en faisant varier le pH de la solution, de décrocher certaines protéines avant d’autre.
- Le pH peut cependant modifier temporairement ou pour toujours la structure des protéines.
Il est possible de les éluer par le sel et ainsi jouer sur les charge.
- En ajoutant un gradient de sel, les protéines vont aussi être séparées petit à petit (des moins attachées au plus attachées).
Contrairement au tamisage moléculaire (gel filtration chromatography) qui dilue les protéines, la chromatographie par échangeuse d’ion concentre les protéines.
On peu injecter 50 ml d’un mélange de protéines et obtenir une fraction pure de notre protéine d’intérêt dans 3 ml.
Le détachement se fait brutalement ce qui est top pour concentrer la protéine.

Comme dit tout à l’heure, aux lieux d’éluer les protéines avec du sel on pourrait, en principe, aussi les éluer en réduisant le pH (pour les anion exchange Q) ou en augmentant le pH (pour les cation exchange S)

Cependant, par rapport au graphique des résultats, on préfèrera la séaration par gradient de sel car elle se fera tranquillement et elle sera bien visible sur le graphe.
En effet, la séparation par variation de pH donne une courbe brutale.

Exemple:

supposons que vous ayez 5 protéines différentes, avec les points isoélectriques relatifs.

0———–pI#5———-pI#4——-6.5——–pI#1———–pI#2———-pI#3————- 14

Supposons que votre colonne soit équilibrée et éluée à un pH de 6,5 (le pH de travail est de 6,5), par lavage la colonne avec un gradient de tampon de concentration croissante en sel.
ÉCHANGE DE CATION
- La matrice d’échange de cations a des groupes chargés (par exemple, des groupes carboxyméthyle(CM)).
- Une molécule avec une charge nette négative ne collera pas, elle sera donc lavée et éluée avant toute chose (protéines 4 et 5 dans l’exemple actuel).
- Les molécules avec charge nette + élueront dans l’ordre de leurs valeurs de pI, à cause des différences de charge nette:
  - la molécule la plus chargée (celle dont le pI est le plus éloigné du pH de travail) adhère le plus étroitement (élue en dernier).
ÉCHANGE D’ANION
- La matrice d’échange d’anions a des groupes chargés positivement (par exemple, des groupes DEAE (diéthylaminoéthyle)).
- Une molécule avec une charge + nette ne collera pas, donc se lavera et éluera avant toute chose (protéines 1, 2 et 3 dans l’exemple actuel).
- Les molécules avec charge positive nette élueront dans l’ordre de leurs valeurs de pI, à cause des différences de charge nette:
  - la molécule la plus chargée (celle dont le pI est le plus éloigné du pH de travail) colle le plus fortement et sera élue en dernier.
- On peut laver, dans le cas d’échange de cation pour les protéines chargé négativement et dans le cas d’échange d’anion pour les protéines chargés positivement, avec du sel pour séparer ces protéines.

Answer 76

A

La chromatographie d’interaction hydrophobe :
- est une chromatographie en phase liquide à haute performance utilisée pour la séparation sans dénaturation des acides aminés hydrophobes, des peptides et des protéines.
- On utilise des billes à surfaces hydrophobes (liés à des lipides) où les charges négatives auront une grande affinité avec ces surfaces.
- Il est nécessaire d’ajouter une grande quantité de sel pour enlever la politesse moléculaire.
- On va ensuite imposer un gradient de sel décroissant au milieu afin de détacher petit à petit les protéines.
- En effet, cette forte concentration en sel va permettre l’interaction des protéines avec les billes du gel.
- Notons de plus que l’eau n’aime pas dissoudre des substances
  apolaires (hydrophobes).
  - Elle doit former des structures en cage
    autour de ces molécules.
  - Il est plus favorable de former une cage autour de plusieurs de ces molécules qui sont regroupées, rejetées par l’eau.
  - C’est ce que l’on appelle l’effet hydrophobe.
Si on résume on a une matrice hydrophile, substituée avec des groupes hydrophobes type phenyl ou octyl. La phase mobile est aqueuse et salée, ce qui permet d’augmenter les interactions hydrophobes. L’élution ce fait par un gradient de concentration diminuée de sel, qui est généralement du (NH4)2SO4.
Si on est intelligent, on peut jouer avec cette caractéristique de la chromatographie par interactions hydrophobes (le sel).
- On peut, par exemple, commencer par une chromatographie ion exchange
- puis continuer avec une chromatographie par interactions hydrophobes puisque le sel sera déjà présent.

Answer 77

A

La chromatographie d’affinité :
- est une technique de chromatographie qui permet de séparer un composé en utilisant des interactions biologiques entre un ligand spécifique (greffé sur une matrice macromoléculaire) et son substrat, en l’occurrence la molécule à isoler.
Comme toutes les chromatographies, la chromatographie d’affinité permet de séparer les composants d’un mélange, donc de purifier les substances.
- Pour cela, elle utilise les propriétés d’interactions biologiques, donc elle peut purifier un composant en une seule étape.
Une matrice insoluble à laquelle est attaché un ligand spécifique de la molécule à purifier et se liant de manière réversible avec celle-ci est utilisée.
- La molécule d’intérêt se fixe donc à la matrice et les autres composants sont élués.
- Puis on détache celle-ci de la matrice, ainsi la molécule est purifiée.
- Pour pouvoir séparer des composants par cette méthode, il faut donc connaître la structure et la spécificité de la molécule d’intérêt afin de choisir un bon ligand, c’est-à-dire que le ligand ne doit pas accrocher d’autres composés que la molécule.

Le ligand d’affinité peut être :

 Un substrat

 Un analogue de substrat

 Un inhibiteur compétitif

 Un cofacteur

 Un antigène

 Un anticorps

L’élution peut être faite par :

 Substrat libre

 Le pH

 Dusel

Comme la chromatographie par échangeuse d’ions, la chromatographie par affinité aussi concentre les protéines

Un exemple de ligand avec lequel on peut utiliser facilement cette chromatographie est :
- l’anticorps.
  1. On commence par immobiliser l’anticorps (modifié à notre convenance) par un lian covalent sur la surface de la bille.
  2. On ajoute ensuite le mélange de protéine.
  3. Il suffit ensuite d’éluer avec du sel et
  4. on récupère notre protéine d’intérêt très facilement.
Un autre façon de faire est :
- de travailler directement sur l’ADN.
  - En effet, lorsque l’on a reconnu le gène de la protéine d’intérêt, on peut lui ajouter un epitope artificiel qui va coder pour 6 ou 7 histidines.
  - Ces histidines vont avoir une forte affinité pour le nickel.
  - Une fois la fusion epitope/gène faite, on introduit le brin d’ADN dans une bactérie qui va alors synthétiser notre protéine couplé à nos histidines.
L’epitope code souvent pour des histidines qui auront de l’affinité pour une colonne contenant du ions nickel immobile sur elle.
- Cependant, l’epitope peut coder d’autre chose que des histidines :

 Des déterminants antigéniques reconnus par un anticorps spécifique

 Une glutathione S-transferase (GST) qui se lie à une colonne d’affinité contenant du gluthation

On procède donc par épitope tagging pour la purification (voir la localisation) de protéines.
- Notons que toutes ces parties artificiels ajoutées (ici les 6 ou 7 histidines) peuvent potentiellement interagir avec ma protéine et changer sa forme native.
Comment garder la forme native ?
- Pour cela, on utilise une résine en nickel qui aura une forte affinité avec les histidines et on utilise une TEV protéase pour l’élution.
- La protéase TEV, ou protéase du virus de la gravure du tabac, est une protéase à cystéine du virus de la gravure du tabac (TEV).
  - Elle est apparentée à la chymotrypsine et catalyse l’hydrolyse de liaisons peptidiques situées en aval d’un résidu de glutamine, avec une spécificité particulière dépendant des six résidus en amont de cette liaison.
- Dans notre cas, son site de scission se trouvera entre la protéine et les 6 His. On se retrouvera donc avec la conformation native suite à l’élution par la protéase TEV.
Un autre problème se pose :
- nous avons ajouté de la TEV protéase alors que nous souhaitons purifier au maximum notre solution.
- Pour éviter que la protéase se mélange à notre milieu, on ajoute une queue de histidines à la TEV et, ainsi, elle interagie avec la résine et rester fixer au nickel.
Un autre exemple d’epitope est la GST ou Glutathion S- transferase :
- En raison de la forte affinité et de la spécificité de GST pour le ligand GSH (gluthation qui est un tripeptide (réducteur) composé de trois acides aminés : le glutamate, la cystéine et la glycine), la GST est devenue une protéine populaire à fusionner avec des protéines recombinantes d’intérêt afin de créer une protéine pouvant être facilement isolée et purifiée en solution.
- Ceci est accompli en insérant la séquence codante de l’ADN de GST à côté de celle qui code pour la protéine d’intérêt, habituellement dans un plasmide circulaire utilisé dans la
  transformation.
- Après transcription et traduction, la protéine
  GST et la protéine d’intérêt seront exprimées ensemble sous la forme de deux protéines fusionnées.
- Étant donné que la protéine GST a une forte affinité de liaison pour le GSH, les billes revêtues de GSH peuvent être utilisées pour isoler la protéine d’intérêt en se liant à l’étiquette GST.
- Les billes sont lavées avec de la GST libre pour détacher la protéine d’intérêt
  des billes, ce qui donne une protéine purifiée.
- L’étiquette de la GST a une taille de 220 acides aminés (environ 26 KDa), ce
  qui, par rapport à d’autres étiquettes communes, est assez grande. Il peut être fusionné à l’extrémité N-terminale ou C-terminale d’une protéine.
- Cependant, de nombreuses sources de plasmides marqués à la GST disponibles dans le commerce incluent un domaine de la thrombine pour le clivage du marqueur GST pendant la purification de la protéine.
Un autre problème se pose :
- la co-purification des protéines qui sont complexées avec la GST-tagged fusion protein.
- En complant du GST à notre protéine et en travaillant à des conditions natives, il se peut que toutes les protéines avec lesquelles notre protéine d’intérêt interagit forme un complexe.
- On n’éluerait pas uniquement notre protéine met tout son complexe et donc toutes les autres protéines

Answer 78

A

Les porfils d elution ressemblent a cf image
- on part d un extrait brute de notre solution on appauvries certaines bandes. Un prot concentree devient alors dominante.
- Le pb c est qua chq state d elution on perde une qntt X de notre prot d interet.
- Selon le prog : apres 200 purification, on perd 90% de notre prot
Le meilleur moyen de visualiser notre prot est d utils l electrophorese. Elle permet de diffeencier des espece chagees et notamment des port apres leur deplacmeent dans le champ electrique.
- en biochimie, l electrophorese sur gel est utls pour separer les macromolecules biologiques (ADN) en fonction de leur taille et de leur charge electq.

Answer 79

A

Le gel est constt d une matrice de polymere baignant dans un tampon conducteur.
Pour reprendre l exple de ADN, comme c est une molecule chargee negativement, si on la met a un endroit sur le gel et qu on fait passer un courant dans le gel, elle migre de la borne moins vers la plus.
Au cours de cette migration les brins d ADN de pett taille migrent plus vite que les brins plus gros, le gel agit comme un tamis popur separer les brins d AFN en fonction de leur taille.
- Ainsi, au bout d un certain temps de migration, les pett molecules d ADN ont parcouru une plus grd distance que le smolecules d ADN plus grd qui se trouvent plus pres de la position d origine.
Deux principaux polymeres sont utls :
1. agarose
2. polyacrylamide
- on peut faire vairer la concentration de polymere par rapport a celle du tampon, ainsi que son taux de reticulation.
- plus le polymere est concentre et reticule et plus la taille de spores du gel est pett
- on peut ainsi ajuster les prop du gel a la taille des molecules a analyser
pour les 2 types de polymeres le gel peut se faire en conditions natives ou en conditions denaturantes (electrophorese sur gel en gradient denaturant)
- dans ce second cas on ajoute un agent denaturant dans le tampon : un detergent, le SDS pour la separation et le depliement des prot (SDS-PAGE) un agent chaotropique, l uree pour les aa nucleiq
- en plus du SDS on ajoute un agentt reducteur comme du BME pour couper les ponts disulfures S-S en plus de charger la prot negativement
il arrv que l ajout de l uree en plus du SDS soit necssr dans le cas de grd complx comme la calmoduline qui resiste bien. Dans le cas contraire, la prot va former des agregats et blq la migration. En effet, tres peu de prot resiste a l uree
On peut faire une estimation du poids moleuclaire apparent en faisant une courbe etalon. En effet si on connait le poids moleculaires de certains prot que l on a fait migrer on peut estimer le poids de la prot d interet inconnu
La coloration a l argent est +++ sensible que le COomacie

Answer 80

A

un SDS-PAGE permet apres coloration la mise en evidence de toutes les prot les plus abondantes dans notre melange.
Cependant, il est neccs de reco la prot d interet de toutes les autres prot
On utls pour cela une technq immunochimique dite wester blotting qui fait appel a l utls d anticpors diriges contre une prot donnee
Pour avoir les anticorps, on procede de la maniere suivante ;
- purification de la prot apr chromatographie successv
- injection de la prot purifiee dans un lapin, dont le systeme immunitaire reconnaitre la prot comme un antigene et produira des anticorps capables de se lier spe a cette prot
- prelevement du serum de lapin qui contient les anticoprs et son utls pour la mise en evidence de la prot
Pour mettre en contact la prot et son anticorps spe, il faut proceder au transfert des prot contenues dans le gel SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose. Cette tecnq est le wester blotting. Le trsf se fait en appliquant un courant electrq tranv perpendi la surface du gel
- Pour le gel SDS PAGE on utls du bleu de coomacie dans le cas du West Blot on pref du rouge ponceau
Apres un bain en presnc de lait pour saturer avec des prot non spe les sites d attachement non spe, la memb est mise en contact avec l anticoprs primaire qui se fixera la ou se trouve l antigene contre leq il a ete produite.
- cette interaction anticors/antigene sera mise en evidence par un anticorps secondaire produit par inejction de la region constt des anticorps produits par le lapin a un animal diff
- les anticorps produit par l anml diff seront donc capable d etablir une interaction avec tous les anticoprs issu du lapin
l ajout du produit colore permettra de detecter la presence et la position de la prot recherchee sur le blot
- l intensite de la coloration donnera une indication sur la concentration de la prot recherhcee
En effet le west blot est semi quantitatif :
- le sbandes representent la qntt de prot dans notre echantillon

Answer 81

A

Le gros pb du Gel SDS est quil est un gel denaturant et rend la prot irrecuperable
- Pour isoler un complexe et ainsi quil reste fonctionnel on utls le gel natif. Il constt a refuire le pourcentage d acrylamide et on ne met pas de BME. Le gel devient alors extremement delicat et se dechire tres facilement
La 1er chaperonne a ete obsv grace a ce gel. Elle a permit de voir que la Rubisco avant prendre sa confo final fait de loto stop sur la chaperonne GroEL. De plus une surexpression de GroEL permet de voir l actvt de Rubisco sur le gel natif.
- on le voit clairement sur la bande 3 (cf image) ou GroEL permettait l assemblage et le bon fonctionnement de la Rubisco
La migration par gel natif se fait selon la taille des prot.
- on peut coupler une migration par gel natif et une electrophorese pour avoir des obs en 2D
- noton suqe nous ne sommes pas forcer de prendre le gel natif, on peut tout aussi bien coupler l electrophorese avec une autre electrophorese denaturante comme le SDS PAGE
Comme electrophorese on utls la focalisation isoelectrique.
- elle est une technq de separation des molecules tel que les prot par des diff dans leur point isoelectriue. C est un type d electrophorese de zone
Cette technq, l electrophorese bidimensionnelle (gel 2D) a ete introduite par Patrick H. O Farelle et devrait permettre d analyser au max 5000 prot.
- L utlis de ces deux technq de separatio permet une grd resolution puis le pI et le poids moleculaire d une moleecule ne depend pas l un de l autre.
  - la 1er D du gel 2D est tjrs la focalisatio isoelectrique et par la suite le gel de SDS (car denaturant)
On se retrouvera non plus avec de sbandes mais des spots de prot qui si les electrophoreses sont parfairement realisees auront tjs la meme valeur. On peut donc realiser une meme cartographie dans un labo diff.
- rapp que la separation na donc dabord ete faite par la charge (focalisation electrique) puis par la taille de la prot (SDS-PAGE)
- Grc a ces tech on peut explq au nv moleculr le phenos d un caract connu depuis 150 ans
  - phenos rugueux des poids de Mendel qui est cause par le manque de l enzyme SBE (strach branching ensyme). Cette ensyme va former des branchements au nv des chaines de glucose (dans le cas du pheno lisse)
L analyse par immunotransfert (immunoblot, “western”) a permis de mettre en evidence cette enzyme :
1. coloration de toutes le sprot
2. detection par anticorps (les anticorps detectent les prot phospho sur des threonines)

Answer 82

A

Test specifique de l enzyme/ prot a purifier
choix du materiel de depart
homogenisation (tampon, inhb de protease, …)
Choix et ordre des methd selon l echelle, le tems, l equipement, expertise

En general on commence par des techn de solublt puis chrmato et electrophrs.
- De plus on commence par une chromta echangeuse d ions (haute capct, concentration) puis un tamissg moleculaire (plus faible capacct, dilution) et pas l inverse.
- On finit tjrs par les chromato a haute resolution faible capact (FPLC, affnit)
- Cependant s il est possb de sauter toutes les etapes et de faire unqm une chromato d affinite c est aussi possibble et ca fait gagner du tmps
Apres avoir vu toutes ces technq, notons que des technq vieilles de 40 ans sont toutes aussi efficace et permettent d avoir de tres bonne purification : purification de l adenylate kinase du msucle de porc
1. prnd des muscles de porc et on homogeneise et filte celui ci avec des gaz (utls pour faire du frmg) pour eliminer les gros morceaux
2. acidifier a pH 3,5 (coca ~2,5). Ainsi les prot s agregent irrvsblm ce qui n est pas le cas de notre adenylate kinase
3. on centrifuge le sprot en retirant les hydrophobes (agregats). La kinase soluble reste dans le milieu
4. on met notre melange dans une colonne de phosphocellulose ou l adenylate kinase pourra se fixer par interaction avec le phosphate
5. on elue avec une solution d AMP
6. on fractionne notre melange grace a de l ammonium sulfate
7. on fait une chromato par gel filtration sur du Sephadex
8. on finit par cristalliser notre prot
Notons que tout ce processus se fait entre 0-5 degres celcius.
- On commence avec une qntt de 16L de melange pour finir avec presq rien. En effet on a une elimination de 2/3 de la prot mais uniqm de 15% de son actvt
On finira par des test analytq (cf image) a echelle microspq pour montre la presence d impurtes (et non demontrer leur abs)
- att le stock doit etre fait a -80 degres.
- meme de tres faibles traces de proteases peuvent causer la degradation totale

Answer 83

A

Maintenant que notre prot a ete purifiee, il est important de savoir a quel point elle est pure.
- Quelles sont les methodes pour l analyser et comprendre sa structure?
- Comment resoudre sa struct G et ses struct sous jacentes ?
- il est tout d abord possible d analyser sa composition en calculant la proportionnalite des aa.
Pour cela on peut hydrolyser les liaisons peptidq grace a :
- 6M d HCL
- 110 degres
- sous vide
- 24-48-72h
Les pb sont les suivants :
- le tryptophane est detruit : mesurer au photometre, rapporter a la tyrosine
- la Cys et Met sont partiellement oxides : oxydes complement a l acide performique et doser a l acide cysteique et a la methionine sulfone
- Ser, Thr, Tyr sont instables : extrapoler a 0h d hydrolyse
- Leu, Ile, Val hydrolyse lente : 72h d hydrolyse
- Amides hydrolyses : Glu+Gln = Glx, Asp+Asn = Asx
En effet les aa sont comme un code barre pour la prot. Il est donc important de la connaitre c est donc une premiere mesure utilse pour connaitre la purete de notre melange final
Un moyen pour verifier la purete d une prot est d etablir le spectre UV des aa aromatques. Le Trp est le seul aa a absorber a 280nm. Par exemple, dans GroEL il n y a pas de Trp c est donc un moyen pour analyser la purete
2 methodes pour verifier la concentration d une prot :
- la methode de Bradford
- Spectre UV
Tres souvent on va proceder par test enzymatique.
En effet, en biologie clinique, l enzymologie est surtout utls pour connaitre la qntt d une enzyme presente dans le serum ou un autre milieu biologique. Il n est pas courant de mesurer directement l enzyme comme une prot, c est sa fonction biologique (actv catalytique) qui est generralement mesuree
Il existe actuellement une simplicite apparente des methodes de mesure de ces actv, alors que la mise au point de telles techq est tres delicate. Un certain nombre de precautions dans lutilisation de ces methodes sont a prendre :
- le test doit etre somple a faire et bon marche
- de preference par spectroscopie (=ideal):
  1. Apparition d un produit fluorescent ou colore turbidite
  2. oxidoreduction de NAD(P) -> changement d absorption a 340nm
- sinon possblt de faire des reactions radioactiv (mais plus lourd que la spectroscopie)
- possiblt de reactions couplees :
  1. Luciferin + ATP -> lucieryl adenylate + PPi
  2. Luciferyl adenylate + O2 -> oxyluciferin + AMP + light (= indicateur_
- de preference en test continu :
  1. methode de brandford : courbe standard en fonction de la concentration de la prot
On peut citer qq exemples de test enzymatq :
- si on veut mesurer l actv de l hexokinase on pourrait mesurer l actv de l ATP mais ce n est pas facile : lors de la coloration de mon ATP il devient radioactif
- C est dont une methode tres lourde si on ne la couple pas a d autres reactions
- mais si o rajoute de la Glc-6P DH on peut suivre l actvt en mesurant le pic de NADPH a 340nm

Answer 84

A

On peut predire la seqc d une prot a partir de sa sqc d ADN.
- En effet de sites spe permettent de suspecter certaines seqc d aa d avant l analuse a proprement parler.
- Cependant, ces sites ne peuvent que donner une piste car enormement d ensymes sont capables de faire des changement post traductionnelle sur cell ci
La seqc permet de connaitre le nombre, la nature chimique et lordre de tous les residus d aa dans un polypeptd.
- Si la prot contient plus d une chaine polypeptdq celle ci va devoir tout d abord etre separee puis purifee
  - generalement toutes les liaisons S-S vont etre reduites
Apre isolement d une chaine polypeptidique, la seqc pourra etre etudiee par des methodes chimiques ou enzymatique liberant les aa un par un a partir de l extremite C ou N terminales ou pas des methodes de spectrometrie de masse.
- Le STEP 3 et 4 peuvent etre couplees pour reconstituer la prot

Answer 85

A

tres utile pour analyser les aa d une prot. En effet, cette methode permet la scission de sponts peptidq de maniere controle et par etape.
Elle peut etre utls pour des chaines allant de 20 a 30 aa.
- Elle utls une molecule appelee la phenylisophiocyanate pour casser la 1er liaison peptidique entre le 1er et 2eme aa
- Sur une surface on attache le peptides et on fait passer la phenylisothiocyanate pour affaiblir la region N terminale par hydrolyse
C est pas spectrometrie de masse que l on va ensuite identifier le polypeptide
C est un test tres lourd et empoisonnant la cause du PITC. Cependant en recommencant la meeh=thode plusieurs fois on est capable de connaitre toute la seqc polypeptidique
L avantage de cette methode est donc le suivant : le polypeptide va pouvoir etre recupere a chq cycle
Mais avant de proceder a la methode d Edman, il est necssr de ocuper notre prot au max.
- pour cela on peut introduire des enzymes comme la trypsine
voyons les diff methodes qui permettent de caract la prot en plus de la methode d Edman :
- une hydrolyse totale afin de connaitre le nombre de residus de chq aa presents
- reaction avec du FDNB sur le residu N-terminal qui permet de connaitre le residu en cette position
- reduction de sponts dissulfures
- introduction d enzymes comme la trypsine ou des reactif chimiques comme du bromure de cyanogene qui pourront cleaver la prot a des lieux comparer tous les fragments pour reconstruire la prot (comme un puzzle)

Answer 86

A

permet de mesuer le poids moleculaire d une prot ou molecule tres precisement et donc de quantifier celle ci. On l a def comme une technq analytique pour la determination de la composition elementaire dune molecule
On commence par administrer une impulsion laser sur l echantillon de prot d interet prealablement coupe par la trypsine pour changer les prot puis on les separe selon leur ration masse/charge par analyse massique.
On a deux etapes a realiser avant de pouvoir analyser les donnees :
- ions source grace a ESI et MALDI ou on va charger nos prot :
  1. ESI est la dispersion d un lqd sous forme de gouttelettes chargees electtriquement.
    1. En appliquant une diff de potentiel elevee entre le xtremite de l emetteur et un orifice situe a proximite on est capable de charger positivement fes gouttelettes contenant notre prot d interet
  2. MALDI est une technq d ionisation douce utls en spectrometrie de masse.
    1. Elle permet l ionisation et la vaporisation de biomolecules comme des prot.
    2. Ces biomolecules ont tendance a se fragmenter lorsq sont ionisees par des methodes plus conventionnelles
    3. Elle est relativement similaire a l ionisation par electrospray (ESI) en douceur relative et en ions produits
- Mass analyser ou l on separe les ions par le ration masse/charge grace a la spectrometrie a temps de vol ou TOF
  1. TOF ou spectrometrie a temps de vol est une methode de spectrometrie de masse dans laq les ions sont acceleres par un champs electrique de valeur connue.
    1. il resulte de cette acceleration que les ions de meme chare eletrq acquiere la meme qntt de mouvement
    2. La vitesse des ions par contre depend ud rapport masse sur charge
    3. on mesure le temps mis par une particule chargeee pour atteindre un detecteur situe a une distance connue
    4. la determination du rapport masse sur charge dependra du temps de vol
L avantage de cette technq est quelle est rapide et precise. De plus elle permet aussi de fractionner la prot

Answer 87

A

Principe 1 :
- si dans la cellule il y a 10 fois plus de copies de la prot A que de la prot B, les peptd de trypsine spe de la prot A atteindront en moyenne 10 fois plus le detecteur que les peptides de trypsine specfq de la prot B
Principe 2 :
- meme lorsq diff auqntt d extrait prot total sont injectees la fraction massv de chq prot par rapport a toutes le prot (100%) restera la meme.
- Par conseq si les prot A et B ont le meme poids moleculaire et que tous le ssignaux MS de la prot A sont a 1% et que tous les signaux MS d ela prot B representent 0.1% du signal total, cela signiie que A est 10 fois plus abondante que B
Principe 3 :
- une fois que nous connaissons la fraction de masse d une prot son poids moleculaire et la densite de sprot dans la cellule (par exemples 250mg/ml=100%) nous pouvons estimer la concentration R de ch prot dans la cellule, en micromolaire
Illustration : rat en labo mangant a doses diff
- 1er hypothese etait de dire que la restriction alimentaire aug la concentration cellulaire de HSPs (chaperons/proteases) et retarderait ainsi le vieillissement et aug la duree de vie
- cependant, dans la restruction alimentaire (RES) il n y a pas daug des HSPs.
  - Au lieu de cela, compare a AL, RES montre une augmentation massive des prot mitoc
- Donc dans la restriction alimentaire (RES) il n y a pas moins de HSPs que dans AL. Or, les HSPs aug lors de stresses par exemple heat-shock
- Cela implique que Ad libitum (cf image) serait un stress qui accelererait le vieillissement et reduirait a la duree de vie
  - les humains nont pas evolue pour se nourrir ad libitum (cad en exces) cest un stress continu donc la cuase de maladie degenerative comme l obesite. Ad Libitum est un mode d alimentation non naturel pour les humains entrainant une duree de vie plus courte

Answer 88

A

Une premiere methode pour analyser ces struct est la cristallographie a rayon X qui prend de plus en plus d importance
Elle permet de faire des modeles de prediction sur la struct que vont donner certains aa a patir de score de prediction. Bien evidement, ces modeles ne sont pas uniquement cree grace a la cristallographie mais a une serie de technq
Les resultat de prog comme “Screach Prot Predictor” pemettent de comprendre l interaction entre deux struct secondaire pour former une struct tertiaire

Answer 89

A

On peut aussi parler du dichroisme circulaire qui a pour but de determiner la proportion de struct secondaire dans uen prot. Elle permet surtout de montrer si certains changement ont eu lieu dans la struct lors de stress (type pH, temps). Cette technq ne donen ps la position presise de la struct
Ex en cas de stress :
- si on a rajoute de l uree -> denaturation -> grpahique plat
- si on chauffe -> denaturation puis agregaion -> agregations possed plus de beta sheet que aucune helice alpha
- si on met des chaeprones sur une prot deplie -> Active donc graphe a courbe
Il existe des segments prot nat non plies (natively unfolded prot) :
- pauvres en residus hydrophobes (I,L,V,W,F,Y,C,N) et les rares qui sont presnt sont disperses
- riches en residus charges (E,K,R)
- Riches en G Q S P
Ex :
- les Late abondant embrtogenesis : dans les mitoc des grains au dernier stades de sa formation, la densite est enorme. Les LEA permettent de stab la memb de ces cellules en tension en forment des alpha helix
- Tau = la maladie d Alzheimer
- Alfa synuclein = maladie de parkinson
- Bcp de domaines dit “random coil”
Attention certins domaines “natives unfolded” pourraient acqueir une struc en entrant encontact avec une prot (inducted fit) ou qd l environnement change :
- a temperature elevee ou plus basse
- durant la dessicacation et/ou l augmentation de sel
- en entrant en contact avec la memb

Answer 90

A

Un microscope electronqie (ME) est un type de microscope qui utls un faisceau de particules d electrons pour illuminer un echantillon et en creer une image tres agrandie.
Les microscopes electronq ont un plus grd pv de resolution que les microsp optique qui utls des rauonnements electromgntq.
- Ils peuvent obtenur des grossissements bcp plus eleves allant jusq 5 millions de fois alors que les meilleurs micrscopes optiques sont limites a un grossissmenet de 2000 fois.
- Ces 2 types de microscpes ont une resolution limite, imposee par la longueur d onde du rayonnement qu ils utls.
- la resolution et le grossissement plus grd du microscp elecronq sont dus au fait que la longueur d onde d un electron (long d onde de Broglie) est bcp plus pett que celle d un photon de lumiere visible
Le microc electronq utls des lentilles elctrostatq et electromagnetq pour former l image en controlant le faisceau d electrons et le faire converger sur un plan particulier par rapport a l echantillon.
- ce mode est similaire a la facon dont un microspc optq utls des lentlles en verre pour converger la lumiere sur ou au travers de lechantillon pour former une image
Donc une technq ++ precise et qui determine la struct des prot de maniere soft mais qui a besoin d un env defavorable (destrcution du milieu pa le faisceau d electron) C est grace a l uranyl Acetate, qui cree un contraste de l image quelle va devenir visible

Answer 91

A

Une autre techq revolutionnaire etant une technq sans artefact de fixation et de coloration et permet de prendre une photo instantanee de l etat de la molecule dans son milieu a l eqd
Elle permet donc dobsv la prot sous toutes ces formes et donc de cree une image 3D a partir d images 2D, contrairement a la cristallographie a rayon X
Desavantages ;
- faible contraste
- programme d analyse puisssant
- struct cristalline pour ancrer

Answer 92

A

la cristallographie est une bonne premiere methode pour determni la struc 3eme et 4 d une prot
la prot va passer d un milieu desordonne lqd a un milieu ordonne solide, remplacant ainsi les interactions prot sovant par des interactions prot-prot
le bur :
- creer des cristaux qui contiendront ces prot toutes sous la meme forme c est par rayon X que l on va pouvoir observer les prot en suivant la diffraction des rauons.
- sa struct ne sera pas la struct native du fait que son milieu aura change
- la struct interne restea plus ou moins inchange mais les agencements entre domaines pas totalement

Answer 93

A

applicable uniquement aux pett prot. En efet la lect des prahq devient vite complq avec une forsse prot
la spectro RMN est tecnq qui exploite les prop magnetq de certains noyaux atomq. Elle est basee sur le phenomene de RMN utls egalement en imagerie medicale sous le nom IRM
elle repose sur la detection du phenos RMN qui se produit lorsq des noyaux atomq de spin non nuls sont places dans un champ magnetq externe generalement uniforme et quils sont excites par un rayonnement radiofrq accorde sur les diff d energie entre les diff etats possible du spin nucleaire
l avantange est que la prot reste sous la forme native mais malheuresment on ne peut que travailler sur des pett molecules

Answer 94

A

methode de centrifugation dont le but est de separer des particules tres fines dispersees dans un lqd de densite prqmt egale
Pour cette separation ait lieu la vitesse de rotation de la centrifugeuse doit depasser les 15 000 tours par minues
Elle permet de trouver le poids molecualires des prot sans dissocier les complexes. En effete contrairement a d autre tecnq, les mesures se font a l eq. Les prot homogene au debut vont peu a peu etre pousse selon la viscosite et leur taille
c est donc la vitesse de sedimentation qui vapermet de calculer la taille de la prot.
cette technq est parfaite pour faire une estimation precise de la taille des osus unite d une prot a association lache (liaison non covalente)
des technq d observation optiq seront utls durant l ultracentrifugation pour observer les prot
- optiq Schlieren ou
- interferometrie de Rayleigh
Montre la dynamq brownienne des particles de l echantilon lors de l ultrafiltration. Le mvmt brownin est le nom du phenomenre corrsp au mvmt aleatoire de particules dans un fluide
- ce mvmt de particules dans un fluide provient du fait que le fluide st lui meme fait de particules (molecules)
- dans un lqd les molecules sont proches les unes des autres mais peuvent qd emme se deplacer les unes par rapoort aux autres (sinon solide)
- ces molecules sont soumises en permanance a une agitation thermq, cad que les particules bougent et vibrent les unes par rapoort aux autres
- l agitation thermq rep le phenos microscpq principal qui fait qu un materiau peut stocker de la chaleur : tout ce qui est chaud , cad au dessus de la temp du zero absolu stocke la chaleur sous la forme d agitation moleculaire
L analyse par ultracentrifugation permet :
- caract le meca d assemblag et de dassemblage de complexe biomoleculaire
- determiner la stoechiometrie des sous unites
- mesures la constt d eq et les parametres thermo pour les systemes d association sprotq
notons que l avang de cette tecnq est quelle. ne denature pa sla prot et donc devient interessante pour des complexes qui auraient de la peine a se former dans un gel natif (qui denature les complexes lache a liaison on covalente) ou des tamisages molecules. ON peut des lors caract l etat de notre prot sous diff conditions

Answer 95

A

la technq MALS permet de mesure la lumiere diffusee par un echantillon en plusieurs angles
utls pour determinee a la fois la masse molaire absolue et la taill emoyenne des molecules en solution, en detectant la maniere dont elles dispersent la lumiere.
- la lumiere colmatee provenant d une source laser est le pus souvent utls
- dans ce cas la tecnq peut etre appelee : diffustion de lumiere laser multiangle (MALLS)
- l insertion du mot laser visait a rassurer ceux qui etaient habitues aux mesures de diffustion de la lumiere avec des sources de lumiere conventionnelles telles que les lampes a arc au mercue que des mesures a faible angle pouvainet maintenant etre effectuees
Elle combine la technq du gel filtration avec dautres technq en corrigeant les artefacts du gel filtration (les prot fibrillaires semblent plus lourdes que ce quelles sont R). En effet les plus grosses prot dispersent plus de lumiere que les pett ce qui nous permet de faire des estimations sur la taille de celle ci
On peut facilement coupler cette tecnq avec d autres qui mesure l index de fraction permettant de trouver la concentration
SUr le graph on voit que les complexes diffusent plsu de lumiere que le smonomeres : complexes plus grd que les monomeres

Answer 96

A

Une tecnq ressemblant a MALS est SAXS
- la diffusion des rayosn X aux pett angles (SAXS : small angle X rays scattering) est une technq exp qui permet d etudier les prop struct de smateriaux a une echelle allant de 1 a 100nm
- cette technq se base sur l interaction elastq des photons avec les nuages lectronq
- les photons sont diffuses en traversant l echantillon et fournissent des info sur la fluctuation des densites elec dans la metiere heterogene
La tecnq SAXS permet de caract la struct des prot, notamment en donnant la taille des domaines d un complexe t leur interaction.
- Attention des sur l interaction doivent etre donnee a l analyse pour pouvoir l etudier ce qui se pfait par d autres methodes
Une mesure SAXS determine la diffustion moyenneee par rotation d intenstite d une molecule en fonction de la frq spatiale (protf SAXS) typiqm a une resoltuin de 1 a 3 nm

Answer 97

A

tenq des complexes prot utls le BN page (Blue native PAGE : technq du gel natf avec ajout de bleu de coomacie) pour la premeire dimension/direction e celle du SDS PAGE pour la seconde dimension
echantillon est d abord incube avec du bleu brillant de coomacie G 250 (colorant non denaturant qui permet a la prot de migrer) pour stabiliser le complexe prot puis seprarer apr native PAGE (gel natif).
- les bandes (cree simplement en mettant le melange de prot dans le spuits) corrsp a chq complexe prot est excise incubes avec du SDS et un agent reducteur (coupe les ponts disulfures) pour dissocie les complex puis les sous unites sont seprares par SDS PAGE poour la deuxieme dimension
- l intensite des resultats va eetre proportionnel a qntt de prot dans le mileu
Noton que le complex protq doit avoir des liaisons covalentes poru ne pas etre dissocie par le gel natif!!!!! la dissociation se fait apres le gel natif et pas pendant
Les avantages de cette tencq sont quelle n est pas chere, besoin de peu d equipement spe et compatible avec d autres methodes d analyse en amont. Par contre on a besoin d une grd concentration de prot, la resoltion est bassse et on pas d info entre les interactions entre les complexes
De plus, cette technq ne marche pas dans le cas ou le complexse prot est dynamq et a de grosse affinite (complexe cohesif)
on peut ajouter a cela que les agregations de prot ne vont passer dans les puits des gels

Answer 98

A

le but est de pv precipiter unantigene en solution qui etre notre prot par un anticorps.
on travail en amont de l ADN afin d ajouter un FLAG a la prot d interet en C terminal
- c est ce FLAG qui va etre reco par des anticorps
- l ajout du FLAG lb a l echantillon permettra aux anticorps de sse lier a la prot d interet
On chercher par cette tehcn a faire un pull down dont le but est d attraper non seulement notre prot d interet immobilise par le tag mais aussi toutes les prot qui interagissent avec elle. Ainsi il sera possble d eutider les interactiosn prot/prot
On peut donc def l immunoprecipitatio comme une technq de precipiation d un antigene de prot en solution a l aide d un anticorps qui se lie spe a la cette prot
- ce processus peut etre utls pour isoler et concentrer une prot particuliere a partie d un echantillon contenant plusierus milieurs de port diff
- l immunop neccssst que l anticoprs soit couple a un substrat solide a un moment donne de la procedure
on peut le coupler grace a la fixation de GST (gluthatione S transferase) en N termnal a une surface de gluthation puis l eluer avec de la gluthatione lb
les avantage de cette methode est quelle est simple et compatible avec des methodes d analyse ne amont. Par contre il est parfoit diff d obtenir des antoicorps spe ou ils n ont parfois que des interactions faibles avec la rpot
*

Answer 99

A

les agents de pontage vons nous donner des info sur la struct et les associations de sous unites via les liens qui vont se former entre eux
les agents de pontages vont lier le sous unites de l oligomere en fonction du temps. On peut donc determiner quels liens vont se faire de preference (cinetq de liaison)
- ainsi si on fait un un gel SDS on peut voir le poids moleculaire aug.
- Chez GroEL on va remarq qu il y a plus de pref pour les laisions intra anneau que pour les inter anneau
les agents de pontages ne sont pas de produits anodins mais biend es artegacts qui malgres tout permettent de maniere un compelxe de prot soudes meme sous SDS page..
- en effet l agent va regarder ces deux voisines et dnas le cas ou les deux sont des arginines va creer une liaison covalentes irreversible
- on aura donc un shift dans la mesure du poids moleculaire
ces agents nous permettent donc principalement de garder un complexe de prot liee et de la maintenir ainsi meme lors d un SDS page.
- il suffit de les ajouter dans le SDS PAGE et de le laisser agir suffisament longgtmeps
- plus le tmeps sera long, plus l agent aura le temps dagir et donc de ramener une prot complexe
- Ex : Hsp7 compose de 2 anneaux de 7 sous unites identq : en laissant agit peu de temps je ne ramenerais unq les 2 sous unites en anneau separes tandis que sil emteps est suffm long les deux sous unites L7 seront ensemble et ma prot sera mesure correctment par le SDS PAGE
Les 3 agents de pontages :
- ils reagissent avec les amines lb (lysine)
- DSP et DRSSP sont clivable par un agent reducteur
- DSB et DSP soont insoluvles dans l eau et traversent les membranes
- DTSSB est soluble dans l eau
Les agents de pontages sont des produits a utls avec precaution
- on ajoute a notre melange un artefact qui l faut savoir controler pour ne pas faire d erreur d interpreation
On peut utls l hetero bifunctional UV crosslinker :
- actv par source UV
- capable de rendre visble par fluo toutes les partenaires de la prot etudiee
- la biomolecular fluo complementation analysis ressemble aux agents de pontages.
  - en effet deux frgmt (YN et YC) de la prot fluo YFP sont fusionnes a des partenaires d interaction putative.
  - si association : complex flu est alors forme et nous permet d avoir l interaction des deux partenaires

Answer 100

A

branche de la biologie etudaint la struct et lorganisation spatiale des macromolecules biologiques. Nous avons vu plusieurs de ces techq permettant de connaitre la struct 3D d une prot.
Nous allons maintenant nous interesser plus en detail sur 4 de ces techq tres utls auj pour mieux comprendre commnet un scientfq travaille une prot :
1. cristallo aux rayons X
2. microsp elec
3. RMN
4. tomographie electron
Petit rappel :
- prot sont des chaines d aa
  - cette chaine corresp a la seq dite primaire de la prot.
  - les prop des chaines laterales est a l orgn de toutes les fonctions diverses et sophistiqq des prot
  - en effet chq aa possd une chage propre et peut etre polaire ou non
- la prot possd diff nv stuct dont la 3eme et 4eme definssent la fonction :
  - primaire : chaines des aa liee par des laiisons pep (liaison covalentes)
  - second : repliement loval forme d helice alpha et beta sheet
  - tertiaire (fonction): repliement des struct second formant une forme spatial complexe et donnant une fonction a la prot
  - quaternaire (fonction): union des sous unites de diff prot donnant une fonction a la prot (hemoglobine)
- les prot ont diff role dans la cellule comme le transporrt (hemog), les reactions enzymatiq (rubisco) ou encore la prot immun (anticorps)

Answer 101

A

commence par purifier notre port de facon homogene
- utls toutes les tecnq vus : TAG, sel….
le but :
- transformer notre prot en cristal pour la visualiser
- une fois purifier il va falloir la concentrer enormement (saturation) puis la melanger avec des substances de precipitations. Cete precipitation qui va permettre la fornation du cristal
la plupart des prot peuvent cristallier. Pour les faire precipite chq prot doit etre maintenue a des condtions spe (bon pH et qntt de precipitant specifq)
- pour toruver ces conditions, on fait des centrains de puits avec des concentration de precipitant et de prot diff en plus de variation de pH (une machine le fait pour nous)
- ainsi on trouve la meilleure concentation de chq reactif pour que la prot cristallise dans son etat natif
notons que chq cristal est compose de miliers de prot. Les cristaux de prot sont composes de 30-50% d eau et retenons que la prot est sous sa forme native
un cristal est un solide dont les constt (prot) sont assembles de maneire reguliere. En effet toutes les molecules auront la meme forme, ce qui nous indq deja la limitation de cette tecnq :
- elle ne permet pas d etudier les mouvement des prot maus uniqm une confo de celle ci
Cette technique est fondée sur la difraction des rayons X par la matière cristalline.
- En effet, des rayons X seront bombardé sur notre cristal pour avoir un cliché de diffraction du cristal.
- Il est important que le rayon soit de longueur d’onde inférieure à ce que l’on veut observer mais tout de même assez luisant : le rayon X est donc parfait.
- Le cliché de diffraction est une sorte de carte de la diffraction de la lumière sur les atomes et permet de voir leurs positions. C’est au CERN et au SLS (Zurich) où l’on travail avec ce genre de diffraction.
- Une fois le cliché optenu, la construction d’un modèle 3D de la protéine peut être faite.
  - Ce sont des analyse computationnel qui font permettre de créer une carte de densité électronique et de positionnement des atomes de la protéines.
  - Cette carte de densité électronique va ensuite permettre la construction d’un modèle de la structure de la protéine et faire des interprétation biologique.
La résolution de cette technique va être de l’ordre de 0.5 Å à 2.5/3.5 Å : c’est donc une technique plutôt précise.
Le modèle protéique va devoir être construit en plaçant la bonne séquence d’acides aminés dans la carte de densité électronique. Il n’est pas toujours simple de la construire.
- Il est nécessaire que la densité électronique soit facile à suivre pour l’ordinateur.
- Il est possible de le faire à la main directement.
- L’important est que chaque acide aminé soit avec sa bonne densité électronique.
la structure 3D d’une protéine dans un cristal est un « snapshot » de sa configuration dans un moment déterminé.
- L’image de la protéine est figée dans un moment t. Il est donc nécessaire d’utiliser d’autre méthode si l’on souhaite comprendre le fonctionnement de notre protéine.
- On peut voir l’exemple du phytochrome ci-contre : un photorécepteur présent chez les bactéries.

Answer 102

A

Le principe de cette méthode :
- est de préparer un échantillon et projeter des électrons sur celui-ci de manière très puissante.
- Ainsi, on récupère l’image de la protéine sous différents angles.
Avant Dubochet, le principal problème était de protéger l’échantillon. Il a trouvé comment le protéger du bombardement : la vitrification.
- Elle permet non seulement de protéger l’échantillon, mais aussi d’augmenter la puissance du rayonnement afin d’obtenir une meilleure résolution.
- Cette technique permet d’étudier la protéine sous toutes ces conformations.
Le processus est le suivant :
1. . Préparation d’un échantillon de protéine pure et homogène.
2. L’échantillon est ensuite congelé rapidement (« flash frozen ») de sorte que des cristaux de glace ne se forment pas.
3. Les molécules protéiques sont maintenues dans leur forme naturelle dans une très fine couche de glace.
4. L’échantillon est ensuite bombardé par les électrons, et les électrons transmis sont enregistrés par une caméra pour produire une image (2D).
5. Les molécules de l’échantillon sont orientées de façon différente.
6. Les logiciels informatiques regroupent ensuite les molécules en fonction de leur orientation pour former une image 3D.
7. Des milliers d’images sont nécessaires pour créer une carte 3D de densité électronique des protéines.
La Cryo-Microscopie électronique permet donc la visualisation de grands complexes protéiques en état native (en solution).
- Elle nous a déjà permis de comprendre le mouvement de STE (système transporteur d’électron).
- Le principal désavantage de cette technique est qu’elle ne permet que d’analyser de très grande protéine.
- Cependant, la Cryo-M a tout de même augementer la résolution de la microscopie électronique de façon spectaculaire en passant de 20 Å avant 2013 à 3-2,5 Å aujourd’hui.

Answer 103

A

La RMN exploite les propriétés magnétiques de certains noyaux atomiques.
- Elle utilise la propriété magnétique du spin (2 états énergétiques alpha et beta) pour déterminer la structure d’une protéine.
On identifie l’état de résonance du noyau (haute énergie, Beta spin) de l’état à basse énergie (Alpha spin).
- Le spectre RMN représente l’énergie nécessaire pour amener chaque noyau en résonance.
- Le spin réagit comme un aimant et donne donc des propriétés à certains atomes comme H, C, N, F ou encore P.
- En effet, l’atome aura les caractéristique d’un dipôle électrique avec un pôle positif et un autre négatif
Grâce à un aimant très puissant, il est possible d’influencer ces attomes et connaitre leur état énergétique (alpha, beta) selon leur orientation.
- Ainsi, on est capable de ploter un graphe qui nous idiquera quels atomes sont blindés par les électrons et lesquels ne le sont pas (blindé = besoin de peu d’énergie pour atteindre son état de résonance car moins influencé par l’aimant, les électrons absorberons les effets de l’aimant).
- En effet, avec une source d’energie à radiation rf, il sera possible de connaître l’énergie qu’il faut délivrer à un atome pour le faire passer d’un état alpha à beta.
- Un atome blindé par ces électrons aura besoin de moins d’énergie qu’un atome déblindé pour passer dans son état de résonance.
En regardant le graphique, on peut voir que les atomes blindés se trouvent plus à gauche.
- Ces atomes auront plus d’électrons autour d’eux et donc auront moins besoin d’énergie pour passer à leur état de résonance.
- Au contraire, les atomes très déblindé se trouve à droite ; ils auront besoin de beaucoup d’énergie pour passer d’un etat bas spin à haut spin.
Prenons le cas du Cl-CH2-CH3 :
- les électrons de CH2 vont être attirer par le Cl et donc CH2 sera donc fortement déblindé.
- CH3 sera aussi déblindé mais bien moins que CH2.
- Plus on est proche de Cl, plus l’effet de déblindage sera grand. Même principe pour le CH3-CH2-OH sur le graphe.
- La RMN nous permet donc de reconnaître la formule brute d’une molécule à partir d’un graphe de déblindage/déblindage et de distinguer deux molécules ressemblantes entre elle.
Si on revient a nos protéines, la détermination de la structure d’une protéine par 2D RMN est possible par le même principe.
- Pour cela, on suit deux atomes (par exemple N et ses H). Historiquement, les protéines ont été étudiées par la RMN du proton (H1) présent en abondance.
Les étapes sont les suivantes :
1. 1ère étape ou l’expérience de COSY : établir une corrélation entre les signaux du spectre et les atomes d’H de chaque résidu de la protéine.
2. 2ème étape ou expérience de NOESY : expérience de corrélation à travers l’espace par effet Overhauser. Grâce à l’utilisation du principe de NOESY, on peut calculer les distances interatomiques (entre 4-6 A). Le principe de NOESY établit la corrélation entre différents acides aminés dans l’espace. En effet, il permet de savoir si une Ala est connectée à une Val ou une Pro grâce à un graphe (information sur les couples).
La RNM permet donc de trouver la taille des protéines mais aussi leurs dynamiques ! En effet, puisque la protéine est en solution, on peut travailler sur sa dynamique.
- Cependant, la taille de la protéine est limité par cette technique : uniquement des protéines de 10kDa sinon on aura des superposition du spectre.
Il est aussi possible dêtre plus précis et de réaliser une 3D RMN en marquant 3 éléments (souvent H1, N15, C13 qui sont abondant dans la nature). La 3D RMN est beaucoup plus précise et utile.
La NMR basée sur la Methyl-TROSY (la technique TROSY pour Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy) permet de déterminer la structure de plus grands complexes protéiques en marquant les groupes méthyl. C’est une méthode compliqué mais qui est très forte pour comprendre le mouvement d’une protéine lors de sa réaction. Avec cette technique, on peut monter à des analyses sur des protéines de taille allant de 700 à 800 kDa.

Answer 104

A

La Cryo-tomographie électronique permet la visualisation des complexes de protéines in situ.
- En effet, elle permet, par projection d’électron, d’observer des protéines dans le tissu directement.
- Ainsi, on peut travailler dans un milieu non synthétique et voir comment les complexes protéiques, enzymes et molécules en général interagissent entre elles.
La résolution de cette technique est cependant très faible mais elle reste efficace pour la visualisation des complexes protéiques de membranes
Insistons sur le faite que c’est la combinaison de plusieurs méthodes qui va permettre de comprendre une protéine.

Answer 105

A

Les enzymes sont des prot caralyseurs des sysym biologique
Un catalyseur :
- permet d acceler la vitesse d une reaction chimique
- il existe cependant une exception de catalyseur qui est non prot : le ribozyme
  - sont des ARN quqi possedent la prop de catalysesr une reaction chimique spe
  - le terme ribozyme est un mot valise forme a partir des motes acide ribonucleique et ensyme
A la decouverte de ces molecules en 80 indp par T. Cech et S. Altman a ete une grande surprise car jsq les prot etaient les seules macromolecules bio connues pour cata des reactions chimique
Les prop cata des ribozymes :
- liees a la capacite de l ARN de se replier pour former une struc compacte bien def qui comme dans le cas des prot perment la formation de cavites formatn des sites de fixation de ligands
- des groupements react precisement orientes realisent alors la catalyse prop dite
- si on prend la reaction : Glucose + 6O2 —> 6CO2 +6H20 (+energie) sans catalyse enzymq sa duree serait de plusieurs annees.
  - avec une catalyse enzymaq elle ne dure que quelques secons
- la reaction de transcpt de DAN en RNA —-> 78 millions d annnes
- la synthese de la chlorophylle et de l hb —> 2,3 milliairds d annees
On peut donc dire que la vie n existerait pas sans ensymes. Elles permettent de rep aux besoins vitaux des cellules dans lesquelles les reactions doivent avoir lieu quasi instantenement
Les enzymes sont donc des prot (pour la plupart) catalyseurs puissants et extremement spe
- en effet une enzyme cata une seule reaction chimq ou un ensemble de reactions etroitement appraentees a la fois
Une enzyme puisq tres spe possede une struct 3D speciale et specfq a son substrat

Answer 106

A

les noms des enzymes ne sont pas tres orign, on appelle les enzymes selon la reaction quelles catalysent :
- la sucrase coupe les sucroses
- la protease coupe les prot (retenons la trypsin qui est une serine protease)
- la lipase coupe les lipides
- les nucleases coupenet l ADN et l ARN
les enzmyes agissent a faible concentration et sont regeneres en fin de reaction. En effet les enzymes ne osnt pas conso
Les ensymes ne changent pas non plus la raction :
- elles sont utls temporairement
- ults encore et encore pour le meme reaction avec d autre substrat mmoleculaire
- des ptt enzymes sont ncassc pour aider la conversion su substrat en produit dans plusieurs reactions
- elle sont en quantt faible dans le cors (car utls pluseirus fois)
- possede bcp dd energie intrinsq

Answer 107

A

De nombreuses enzymes requierent des cofacteurs pour etre actifs. L actv catalytique de plusieurs enzymes depend de la presence, dans le site actf de pett molecules denommees cofacteurs
le cofacteur peut etre :
- un ion metallique (Mg2+, Mn, Zn2+)
- petite molecule organq : coenzyme (vit, CoA, Biotine)
- Apoenzyme : ensyme qui ncsst un cofacteur pour fonctionner
- Cofacteur : substance organq simple ou inorganq qui rend une enzyme actv en s y fixant
- Coenzyme : cofacteur orga plusieurs vit sont des coenzymes
- Apoenzyme + cofacteur = holoenzyme

ensyme : prot avvec la capact a cata les reactions chimique
substrat : molecules qui fixent sur le site actif et qui vont etre modf par l enzyme
Produit : molecule produite comme resultat de la reaction cata
Site actf : partie de l enzyme qui va interargir avec le substrat pour former le produit
Cofateur : subst organq simple ou inorganiq necsse a l actv d une enzyme

Answer 108

A

C est la struct 3D de l enzyme qui va determiner la spe enzyme substrat. Lorsq le substrat se fixe (pas de liaison covalente) a l ensyme celle ci change de confor
L act enzsymatq depend des fact suivants :
- pH : la pepsine (enzyme intestin) trv a pH=3 tandis que la trypsin (ensyme dans le pett intestin) a pH = 8
- la temp : cors a 37 degres
- cocentration des cofacteurs qui vont faciliter grandement l activt enzymq
Il est essentile que l enzyme soit correctement pliee (comme toutes les prot en G).
- En effet si la prot se deforme le site actif resque d etre mmof et de devenir alors inactf
- l eznyem a alors perdu ses prot catalytq elle ne peut plus remplir sa fonction
- les prot peuvent etre denaturees par la chaleur, les variaistion de pH, les fortes concentrations d electrolytes (ions) ou encore les solvants organsiuqe
Dans la cellule les reactions enzymatq se font souvent a la chaine (par voies metabo)
- les ensymes ne travaillent jjamais isolees mais font parties d une chaine de reactions metabo (durant glycolyse 1er etape de la respi cellulaire).
- les produits de la reaction A deviendront substrat de la reaction B

Answer 109

A

Notre organisme contient des miliers densymes.
- Les ensymes les plus importantes sont celles qui nous permettent de digerer la nourrt
  - on en trouve dans la bouche en passant par l estomac jsq rectum
  - la trasnformation des monomeres d aliments sera faite par toutes ces ensymes
  - chq ensymes travaillent a un pH diff
Mais comment font elles pour accelerer la reaction ?
- elles sont en fait capable de diminuer l energie d actv de la reaction et donc l energie necessaire pour atteindre l etat de transition
- cette E d actvation est def comme l energie qui doit etre apportee a un systme chimique pour que la reaction ait lieu
- Ainsi l ensyme facilite la formation de l etat de transition sans modif ∆G de la reaction
- les enzymes stabilisent l etat de transition et mettant les substrat dans des orientations favorables pour la formation des etats de transitions.
  - en effet les ensymes forcent par leur confg 3D la formation de l etat de transition
Le site actf est une cavite 3D qui occupe une partie reduite de l ensyme :
- un µenvi non polaire (qui peut contenir des residus polaires)
- les substrat sont fixespar des attractions faibles, en effet si la laison etait covalente le complexe ne pourrait pas se defaire ou tres diff (et on vuet reccup l ensyme pour la reutl)
  - c est donc dans le site actf zone tres petit de l ensyme que les substrats sont dixes et orientes

Answer 110

A

La specificite de la fixation depend de la disposition des atomes dans le site actif.
- modele de la serrure et la cle ou l ensyme a une forme complementaire de celle du substrat
- le modele de l adaptation induite ou l ensyme change de forme lors de la fixation du substrat
On pense que la realt se trouve entrte ces deux modeles :
- un modele “selection conformationne equilibrum” ou l ensyme aurait une struct 3D qui ne satisterait pas un substrat spe mais un max d entre eux
  - ainsi l ensyme est capable d adapte les substrats au bon voulor
  - on peut prendre : une fragmentase d un cylindre de metal
Prenons l exmp des anticorps catlytq pour bien comprendre l importance de la fixation spe de l etat de transition pour lacvt enzymtq
- leur missions est de detecter une molecule etrangere au corps, l antigene et la detruire
- on peut utls cette prop pour cata des reactions chimq choisis
- en effet si on est capable de generer un anticorps reco une molecule dans son etat de transition, celui ci sera capable de catalyser la reaction
Les anticorps catalytq (absymes) sont des anticorps capable de cata une reaction chimq
- ils sont normalement produits artificiellement
- par rapport a une ensyme normale. Ils possd une meilleure spe par rapport au substrat
- un autre avantage est quils peuvent etre produits pour cata toute sorte de reactions
- comme toutes les ensymes ils fonctionnenet en stabilisant l etat de transition de la reaction
- en pratq :
  - sont dvp et select a l aide d une molecule ressemblant a cet etat
Comment produire ces anticorps ?
- il est neccs de prodiure un analogue de letat de transition de la molecule (factuer limitant).
- synth diff analogue de la molecule que l on va injecter a une souris ou un lapin
- son sysym imun va alors se declencher (en la tuant) pour produire des anticorps que l on va pouvoir reccp

Answer 111

A

la protease TEV pour comprendre son fonctionnement d une triade cata :
- composee de 3 redidus d aa qui interviennet ensmble dans le site actf de certaines ensymes
- le site act de la protease TEV, une peptidase tres selectv du virus de la gravure du Tabac montre le substrat et les residus de la triade cata, l aspartate (acide) histidine (base) et la cysteine (nucelophole)
La chiyotripsine :
- une peptidase digestive secretee par le pancreas de la famille des prot a serine qui cata des proteolyses des prot du systm digestif
- le site actf comporte une poche hydrophobe dans lq se loge l aa du substrat
- ceci permet le positionnement de la liaison a cliver en regard de la serine cata
- son site actf est aussi une triade cata composee d Asp His Ser
- la reaction enzymatq est decoupee en 2 phases : une cata covalente puis acide/base:
  1. rapide : acetylation de l ensyme
  2. lent : hydrolyse et dissociaytion de l acide acetq
- la vitesse de la reaction est tres rapide au debut puis diminue

Answer 112

A

prot globulaire longue dune centaine aa (130 chez l etre humain) qui est impliquee dans la denfense contre les infections bacte
presnt chez +++ espec animaux
- on trouve en partc dans un certain nombre de secretions (larmes, salives, lait maternel, mucus, estomas des ruminants) et dans le blanc d oeuf (129 aa chez la poule)
Il s agit dune glycoside hydrolase acide secretee par les granulocytes et les monocytes.
- elle detruit la paroi bact des bact a Gram positif en cata l hydrolyse des peptidoglycanes la constt
- cette pro a incite certains auteurs a la qulf d antibiotq corpo
constt de l immunite innee
compose de 2 parties :
- une alpha helix et l autre beta sheet
- de plus son site avtf est une diade catalytq faite d un residu Asp et lautre de Glu
- son site actf permet d hydrolyser les chaines de sucre qui compose les parois bact en changenant la confo des monomeres de ces polysacchrq
- l eau va elors pouvoir entree dans la bact et une lyse cell va avoir lieu

Answer 113

A

Jsq 1955 les enzymes etaient baptisees par leurs decrouvreurs
- les enzymes sont a presents classees selon des criteres reactionnels en 6 classes comportant de nombreux sous groupes
- chq enzyme est identifiee par un numero EC a 4 chiffres (enzyme commission)
Les oxydoreductases sont des enzymes qui cata les reactions d oxydoreduction en trasferant les ions H+ et les electrons. En effet elles permettent de faire des reactions de types :
- A- + B —> A + B-
- A est le reducteur (donneur d e)
- B l oxydant (accepteur d electrons)
- Ces enzymes sont assc a des coenzymes d oxydoreduction (NAD, FAD, FMN….)
On retrouve :
- les oxydases (fixation d un O) :
  - le cytochrome c oxydase (EC 1,9,3,1) qui permet le passage d e dans le complexe 4 de la chaine respi
  - Ce complexe realise la derniere etape metabolq de la respi cellulaire et se trouve dans la membrane mitoc interne (c est donc une prot transmembranaire) La cytochrome c oxyde permet la reaction suivant :
    - 4 Fe2+ - cytochrome c +8H+in + O2 —-> 4Fe3+ cytochrome c + 2H2O + 4 H+out
  - en effet 4 cytochromes c vont etre oxyde et permettre le passage de 4 e- dans le complexe 4 (qui va a son tour permettre le passg de 4H+). Ce complexe va etre couple a ATP synthase pour la formation de l ATP
  - Les pathologies liees aux oxydases pepuvent etre par exemple la deficience en COX (enzyme permet la formation des prostanoides) et causer la faiblesse muscu le dysfonctionnement cerebral et de sprb cardiq par manque d ATP
- Les deshydrogenase (depart de 2H)
  - alcool deshydrogenase (EC 1,1,1,1) ou ADH
  - cette enzyme permet l interconversion de certains alcools et notamment l ethanol en aldehydes et cetones couplee la redction du NAD+ en NADH. Ainsi elle metabo l alcool
  - La reaction formant des acetaldehydes est la cause de la guele de bois
  - chez certains pop (asiat) un manque de ADLH qui est la 2eme enzyme du metabo de l alcool permettant de transformer l acetaldehyde en acetate provoque le Flushing response (l individu a une coloration rouge de la peau notamment au nv de la tete)
- Les reductases (fixation de 2H)
  - la catalases ou hydrogene peroxyde oxydoreductases (EC 1.11.1.6)
  - les catalases protegent les organismes aerobies contre les degats de H2O
  - c est une enzyme homotetramerique de 200-340 kDa avec 4 groupes prosthetq heme
  - ces catalases se trouvent dans le peroxysones
    - elle a donc une mission de detoxification de leau oxygene qui peut devenir tres reactive et dangereuse
    - uen patho liee a cette enzyme est la maladie de Takahara qui cause de nombreuses infections dans la bouche, des ulcerations et des gangrenes des tissus

Answer 114

A

Ces enzymes caralisent des reactions de transfert selon :
- X-Y+Z —-> X+Y-Z
- X : groupe donneur
- Y : groupe transfere
- Z : groupe accepteur
ON retrouve aussi diff type de transferase :
- les transferases de groupes monocarbonees
- les glycosyl transferase (enzymes de synthese des polyssaccharides : amidon et la cellulose)
- les aminotransferase (ou transaminases) qui sont cruciales pour la synthese des aa :
  - on retrouve l aspartate transcarbamylase (ATCase et EC 2,1,3,2)
  - le substrat carbamyl P contient une liaison riche en energie cela assure l unidirectionnalite de la reaction
  - cette enzyme intervient a la 1er etape de la biosynthese des pyrimidines
- les phosphotransferases (synonyme de kiinase) :
  - les kinases catalysent les reactions de phosphorylation
  - elles ont donc la capacite de transferer un groupe phosphate d une prot a une autre
  - A-P+B <—-> B-P+A
Les kinases ont beoins d un groupe metal pour coordonner leur reaction de phosphorylation
- cette liaison faite avec le phosphore est covalente mais reversible
- les kinases sont largement utls pour transm des signaux et reguler des processus complexes dans les cellules
- la phospho de molecules peut augment ou inhb leur actv et moduler leur capact a interagit avec dautre molecules
- ainsi la phospho peut changer la conformation d une prot et donc sa facon d interagir
- elles sont aussi tres presente dans la division celllulaire et donc tres etudiees pour guerir et comprendre les cancers
Les nucleotidyl transferase (enzymes de synthese des acides nucleiq) :
- l ADN polymerase (EC 2,7,7,7)
- l ADN polymerase est un complexe enzymatq en cahrge de la replication de lADN
- les substrats sont tous les desoxynucleotides sous forme triphosphates (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
- ADN polymerase utls un briin d ADN comme matrice
  - elle est donc respo de la proliferation de lADN (existe diff polymerases avec diff mission : Pol 1, Pol 2, Pol 3)
  - son role est l elongation de la chaine qui se fait par l alcool lb -OH du carbone 3’ du desoxyribose
  - cette elongation se fait dans le sens 5’-3’
  - la vitesse de reaction chez les euka est de 2000 nucelotides/min
Dans cette classe on retrouve aussi l ARNp qui a 4 fonctions :
1. association a l ADN
2. louverture de la chaine
3. production d une amorce
4. liaison au brin d ADN pour la formation du brin complementaire
- Cette machine moleculaire possd 12 sous unites et pese 550KDa
L ADN p est utls dans des applications biotehcnq telles que la PCR
- la PCR permet de generer de grande qunatt d ADN identiq :
  - c est une sorte de photocopieuse d ADN
  - c est donc unef orme de clonage

Answer 115

A

Les hydrolases constituent une classe d enzymes qui catalysent les reactions d hydrolyse de molecules suivant la reaction generale :
- A-B + H2O —> A-OH + B-H
Ces enzymes catalysent la scissiosn de diverses liaisons covalentes (C-C, C-N, C-O) avec scission simultane d une molecule H2O
- La majorite de ces enzymes interviennet dnas des voies catabilq (degradationss)
- ces enzymes sont actv par des cations
Les esterases (lipases)
- elles hydrolysent les esters
- La triacylglycorol lipase (EC 3,1,1,3) qui permet de former des lipides de reserve chez les animaux et chez les vegeraux a partir de triglyciride
- cette enzymee possede une triade catalytique
- on la retrouve notamment dans le foie
Les peptidases :
- hydrolyse les liaisons peptidq dans les prot
- les substrats de ces enzymes sont de tailles tres variees depuis les dipeptides jusq enchainement polypeptidq ayant des masses moleculaire de qq molions de Da
- on peut les exopeptidases qui detachent les aa un par un a partir des extermites de la prot
- on distingue :
  - les Aminopeptidase (EC 3,4,11) qui coupent entre le premier acide amine et le second aa de la chaine
  - les carboxypeptidases (EC 3.4.16/17/18/19) coupent aux extremites C-terminales
- Il existe aussi les endopeptidases qui contrairement aux exopeptidases peuvent couper a l interieur de la chaine peptidq
- ce type d enzymes possednet une triad catalyq avec 1 aa qui agit comme acide 1 comme base et 1 comme nucleophile
  - notons uqe le nom de l enzyme est determiner par le residu (soit l aa amine) qui joue le role de nucleophile car c est lui qui “fait” la reaction (la chymotrypsin est une enzyme a serine).
  - le meca d action de ces enzymes peut etre diff selon les residus implq
- chq enzyme aura aussi une certaines selectivt selon la taille de lentree du site catalytique et des interactions des residus si trouvant
- ces peptidases sont notament utls pour la fabrication de fromage en utls de la chymosine bovine
- d autres peptid extremement importantes de la cellule sont des proteasomes
  - leur fonction principale est de degrader les prot mal repliees, denaturees ou obsoletes de maniere ciblee
  - elles realisent leur action avec l aide d endoprotease CIpA/P, CIpXP et HsIUV
  - la compartimentalisation assure que l enzyme n agisse que suur des prot choisies par ses ATPases qui sont gardiennes de la chambre proteiasique
  - ce sont 80-90% des prot qui sont degradees par cette 26S proteasome
  - le proteasome est forme de deux paties : la 19S et la 20S qui ont deux roles diff
    1. le systeme de selection de la prot a degrader et permet de depliement et sesubiquitination par les ATPases
    2. la degradation
  - les prot a digerer sont marq petit a pett par l ubiquitine
  - les chaperonnes sont des peptidases
Les glycosidases :
- elles hydrolysent les polysaccharides (sucres)
  - leurs roles sont divers : degradation des glucides complexes (cellulose), defenses antibacteriennes (lyzozymes) ou dans le metabo cellulaire (amylases ou enzymes de debranchement du glycogene pour le metabo energetiq)
- Alpha amylase (EC 3.2.1.1)
  - enzyme digestive classee comme saccharidase (enzyme qui brise les polysacchard) constt du suc pancreatq et de la salive requis pour le catabolisme des glucides a longue chaines (amidon) en unt plus pett
  - synth dans de noumbreuses especes de fruits pendant leur maturation ce qui les rend plus sucres et aussi durant la germination des grians de cereales
Les phosphatases :
- hydrolysent les produits phospho (ATP + H2O —> ADP + P_
- fonction : enlever un groupe phohsphate d une molecule simple ou d une macromolecule (ADN, prot)
- Trypsine phosphatase dont le site actf a une conformation parfaite pour faire entre la tryrosine phosphate
  - ces enzymes clivent les groupes phosphate des residus de tyrosine phospho sur les prot
  - la phospho des residus de tyrosine est une modification post trad courante susceptible de generer des motifs de reco moleculaire pour les interactions entre prot et la localisation cellulaire, d affecter la stabilite de la prot et de reguler l actv enzymatq
Les nucleosidases :
- hydrolysent les liaisons nucleotdq et font donc le travail inverse de l ADN polymerase
- on peut parler des enztmes de restrictions par ex qui coupent l ADN dans une seqc spe
  - genere des sticky end qui permet de faire du clonage qpres introduction d un gene dans le genome bact
  - ces enzymes coupent entre groupe 3’ du sucre (OH) et 5’ phosphate : hydrolyse

Answer 116

A

enzymes qui catalysent le clivage des liaisons C-C, C-O, C-N autrement que par l hydrolyse ou oxydation
- ces liaisons sont clivees par le processus d elimination et le produit resultant est la formation d une double liaison ou d un nouvel anneau
l Isocitrate lyase est une enzyme implq dans le cycle du glyoxylate qui n existe que chez les plantes, les bact et les leuvures
- le cycle du glyxylate permet la conversion de l acetyl CoA en succinate pour la synthese des glucides

Answer 117

A

catalysent des rearrangements intramoleculaires pour la conversion de la molecule en l un de ses isomere
Glucose 6 phosphare isomerase (PGI) un dimere de 64 kDa qui joue un role dans le glyconeogenese
La prot disulfide isomerase (pliases)
- double acvt chez ces enzymes : generent des liaisons disuldites a l interieur d une molecule et changent l orientation des SH afin de remettre la conformation native d une molecule (sorte de chaperonne)
- elles ont donc une actv oxydoreductase et isomerse

Answer 118

A

Une ligase est une enzyme qui peut cata la jonction de deux grandes molecules en formant une nouvelle liaison chimique generalement accompagnee de l hydrolyse d un petit groupe chimique sur l une des plus grosses
en general une ligase cata la reaction :
- Ab + C —> A-C + b
L ADN ligase 4 joue un role dans la reparation de l ADN (dans non homologous end joinning) est une ligase
- utls dans des app biotechnologiques car elle permet de retablir des liaisons entre diff groupe nucelotidique
- ainsi peut aider dans la formation d un genome transgenq

Answer 119

A

enzyme acide ribonucleique (ARN ) qui cata une reaction chimique
- le ribozome cata des reactions spe d une voie assimilee a celle des enzymes de prot
- elles se trouvent dans le robosme ou ils joignent des aa ensemble aux reseaux de prot se formant
les ribozymes jouent egalement un role dans d autres reactions indispensables telles que l ARN episant la biosynthese d ARN de transfert et la replication virale
Le ribosomes est le ribozymes le plus important pour la vie
- ribosome est compose de 2/3 ARN et 1/3 de prot
- il permet de cara la reaction de traduction dans la cellule
- on l utls aussi dans les therapies genetq ou il est possble de frbq des ARN synthetq assice a des morceaux dADN spe

Answer 120

A

La cinetique enzymatique est l etude des vitesses de reation des enzymes. Elle depend de 4 parametres diff :
1. l efficacite catalytique
2. l affinite E-S
3. la temp
4. concnetration enzyme, reactifs
La vitesse (V) est la qntt de S qui disparait pendant une unite de temps et suit :
- Reaction S —> P
- V = ∆S/∆T = ∆P/∆T = K [S]
- avec K : constt de vitesse
- on peut aussi la definit comme etant la qntt de produit qui est forme pendant une unite de temps
L equation de MM permet de decrire la cinetique d une reaction catalysee par une enzyme agissant sur un substrat unq pour donner irreversiblement un produit.
- Elle relie la vitesse stationnaire initiale de la reaction a la concentration initiale en substrat et a des parametres caract de l enzyme
- l equation decrit un comportement cinetique tres classique, observe avec de noubreuses enzymes
- l eqt nest pas valable si la reaction est catalysee de facon reversible et que le produit de la reaction est present
Avec des conditions diff (des qntt de substrats diff) on peut faire un graphe des concentrations sur le temps
- il permet de calculer la vitesse initiale V(0)
- a un certain temps t, l enzyme sera sature et le graphe atteint un plateau qui represente l eq entre le produit et le substrat
- il est possble de faire un graphe de la concentration du substrat en fonction de la vitesse
  - sur ce graphe les etoiles corrps a la vitesse de catalyse de l enzyme par rapport au substrat
  - on atteint aussi un plateau corsp a la Vmax
  - lorsq l enzyme l atteint l enzyme est saturee par le substrat
La cinetique enzymatique s interesse en effet a la vitesse d interaction de l enzyme avec son substrat
- E + S <—-> ES <—–> E + P
  - —–> K+1 —–> K+2
  - <—— K-1 <——- K+2
On peut simplifier ces reactions en considerant la vitesse de reaction a des temps proche de zero
- en d autres termes, on calule la vitesse de reaction a t=0 pour simplifier l eqt :
- E + S <—-> ES <—–> E + P
  - —–> K+1 —–> K+2
  - <—— K-1
  - K2 = [E][P] ~0
Nous chercons une expression qui relie la vitesse de catalyse aux concentrations de substrat et d enzyme qu aux vitesses des etapes indv
- Notre point de dep : on sait que la vitesse de catalyse est egale au produit de la concentration du complexe ES et de K2
- Eq 1) V0 = K2 [ES]
Maintenant nous avons besoin d exprim (ES) en termes de qntt connues :
- Eq 2) Vitesse de formation de ES = K1 [E] [S]
- Eq 3) Vitesse de destruction de ES = K(-1) + K2 [ES]
Pour simplifier proposons l hypothese de letat stationnaire
- il ne s etablit pas forcement un eq rapide pour toutes les enzymes entre les formes lb de lenzyme et du substrat (E et S) et le complexe enzyme-substrat (ES)
- Si on part du principe que [ES] est constt (donc la vitesse de formation - la vitesse de destruction) on peut poser
- Eq 4) K1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
- Eq 5) [E] [S] / [ES] = (k-1 + K2) / K1)
De la on peut trouver la constt MM Km (next card)

Answer 121

A

On trouve la constt de MM Km :
- Km = (K-1 + K2)/K1)
Lm a les unites d une concentration (M) et est ind des [E] [S]
ON peut alors simplifier ((K-1 + K2)/K1) par Km dans l equation :
- Eq 5) [E] [S] / [ES] = (K-1 + K2)/K1)
- Eq 6) [E] [S] / Km = [ES]
- Eq 7) (Et - [ES]) [S] / Km = [ES]
- [Elibre] = Et - [ES]
Avec Et, l enzyme totale et Elibre, l enzyme non lie au substrat. En resolvant l equation (ES = k1 [E][S]) par rapport a [ES] :
- Eq 8) ([Et][S] / Km)/ (1+ [S]/ Km) = [ES]
- Eq 9) [ET] [S] / ([S] + Km) = [ES]
En substituant ES et en posant V0= Vmax et [Et] = [ES] enzyme sature :
- on finit par trouver l eq MM qui permet de trouver V0 a partir de Vmx, [S] et Km
Km correspond a la concentration de substrat pour lq la vitesse de reaction atteint la moitie de sa valeur max
- cette constt est une importante caract de la reaction cata par une enzyme et est significatif de sa fonction biologique.
- en effet la Km peut etre vu comme la quantification de la capact d une enzyme a cata une reaction
Les valeurs de Km et Vmax sont des caract importantes des enzymes
- un Km plus haut signifie peu d affinite
- Un Km plus bas signifie plus d affinite
- En effet si Km est bas cela veut dire qu il faut peu de substrat pour atteindre la moitie de la vitesse de la reaction.
- Ainsi la Km fournit une mesure de la concentration en substrat requise pour une catalyse significative s effectue
La Km depend du substrat et des conditions exp telle que le pH, T, force ionique
- Km est une mesure de la force du complexe ES
- un Km eleve indq une fixation faible, tandis qu un Km bas indq une fixation forte
- La Vmax traduit le nombre de turnover d une enzyme = le nombre dde molecules de substrat converties en produit par une molecule d enzyme en une unite de temps (s) lorsq l enzyme est totalement sature par le substrat
- Vmax = K2 [Et]
  - K2 = Kcat
- Kcat = Vmax/ [ET] –> Turnover number (s-1)
Donc Kcat l inverse de la Km reflete la rapidite de l enzyme
- plus la Kcat est elevee plus l enzyme est rapide car gere plus de substrat a la fois
Les valeurs de Vmax et Km permettent aussi de determiner fES, la fraction des sites actif occupes
- fES = V/Vmax = [S] / ([S] +Km)
L efficacite de la catalyse peut etre calc par Kcat/Km
- elel tient compte ala fois de la vitesse de la catalyse avec un substrat particulier (Kcat) et de la force de l interaction E-S
- en utls les valeurs de Kcat/Km on peut comparer la pref d une enzyme pour diff substrats
On peut prendre l ex de la chymotrypsin avec ses diff substrat
- en effet grace a lefficacite de la catalyse, l affinite du substrat pour l enzyme
- si l efficacite est haute alors la ffinite le sera aussi
- l efficacite est donc un bon moyen d estimer les affinites denotre enzyme avec certains substrat et donc de comprendre un peu mieux sa maniree de fonctionner

Answer 122

A

Pour determiner les valeurs Km et Vmax on mesure plusieurs valeurs :
- La concentration de l eznm
- la qnt de produit par rapport au temps t
En changeant la qntt de subst on est capable de faire un graphe et mesurer l act enzymatq et a partir d elle de mesure les vitesses initiales
- a partir de la on peut mettre chq vitesse trouver dans un graphe et poser un graphe qui aura la forme d une hyperbole
- notons que l on arrv jamais a un plateau a cause de la marge d erreur que ces points nous dennerons
  - de ce fait Vm ne peut pas etre trouve et Km non plus
- Il est donc impossible de determiner une valeur definitive de Vmax et Km a partir d une courbe de MM
La determination graphique a partir de l hyperbole quadrilatere de Vm et Km est delicate surtout si on integre les variation sexp
Il est donc neccsrr de representer l eq en double inverse :
- qu on retroune l eq ce qui nous permet de passer d un systeme hyperbolq a un systm en droite : double inverse de Lineweaver Burlk

Answer 123

A

Les inhb reversibles competitives
inhb reversibles non competitives
inhb reversibles incompetitives
Ce sont des inhb reversibles donc des liaisons non covalentes quelles realisent
Commencons par la regulation enzymatq des inhb reversibles competitive :
- l ihnb (analogue du substrat) rentre en competition avec le substrat pour la liaison au site act et la vitesse diminue.
- la vitesse max ne change pas
- la Km apparent de l enzyme voir sa valeur aug car l enzyme devient moins capable de lier son substrat
- en effet on a besoin de plus de substrat pour arrv a la moitie de la vitesse de la catalyse
- c ets comme si chq molecules d enzymes etaient plus lente
- notons tout de meme qu avec un ajout de substrat suffisament grand, il est possible d atteindre la Vmax
Comme ex : malonate et la succinate dehydrogenase
- inhb competitif de la succinate deshydrogenase
- a une struct similaire au succinate
- inhb peut etre contree en ajoutant du succinate
Krebs a utls du malonate pour comprendre le cycle TCA (CK cycle)
Comme autre ex : sulphonamides (antibio sulfamides qui est utls comme agent antimicrabiens)
- mode d action : la cellule va les reco comme PABA (substr nat utls par la bact) et les intg dans son metabo. ceci provq une inb de la synth des bases nucleiq et la cellule meurt

Answer 124

A

l inh ne se fixe pas au site actf mais se lie a l enzyme libre ou liee au substrat
- la concentration en E et ES diminue K2 est affectee et donc la vitesse diminue
- la Vmax est donc plus faible
- la Km est inchange car inhb n interagit pas avec le site actif
- ceci concerne souvent les enzymes a deux subst
L ihnb ihnb la concentration d enzyme fonctionnel et donc reduit les turnover
- c est comme sil y a moins de molecules d nezymes mais celles qui restent sont tout assi actv
- notons que la Vmax diminue dans tous les cas : avec ou sans ajout de subst

Answer 125

A

Inhb ne se fixe que sur le complexe ES
- la concentration en ES diminue
- la vitesse diminue (Vmax egalement)
- La Km diminue car la liaison du substrat sur l enzyme est fav
- c est comme s il y a moins de molecules d enzymes et celle qui restent sont moins activ
- Vmax et Km diminuent

Answer 126

A

Ces inhb sont des molecules spe
- ils sont fixes sur l enzyme tres fortement par liaison covalente ou pas
- ils modf spe le site actf de lenzyme
Ces inhb sont des reactf spe de groupes : inhb de la chymotripsine le DIPF (diisppropylphosphofluridate)
- ils modf spe le site actf de lesyme
- ils inhb par modification covalente d un residu serine essentiel
- la serien est essentiel a cette prot
D autres inhb irrv sont des analogues reactf du substrat
- ils sont capables grace a leurs struct similaire au substr d inactv le site actif en changenant sa confor
- TPCK comme expl qui est un inhb irrv de la chymotripsine en seliant au residu Hist de celui ci

Answer 127

A

L inhbition suicide est un meca ou l inhb forme un complexe stable avec l enzyme qui l inactf de facon permanente
- l enzyme reco l inhb comme son substrat et entame le processus de modif de ce dernier
- intervinet une etape au cours de laq l inhb modf devient tres react et se lie de facon tres stable a l enzyme
- l enzyme contribue ainsi a sa propre inactiv irrv d ou le nom d inbh suicide
- l inhb peut se placer sur le site cataly de l enzyme ou ailleurs
Comme exemple on peut citer l asp qui inhb la cyclooxygenase actv
Penicilline qui est inhb suicide de la transpeptidase intervanant dans la synths du peptidoglycane composant de la paroi des bact

Answer 128

A

Depuis pasteur, pour comprendre un meca, il faut le casser et observer ce quil se passe
Apres de noubreuses observation il est possible de poser des hyp et d etablir un plan que l on croit juste
- Mais une fois le meca compris que fait on ?
La synthetic biology est une des voies avec lesq on peut se tourner.
- La biologie synthetq est une brnache interdisciplinaire de la bio et de l ingenierie
- en associasnt des disciplines telles que la biotechnl le genie gneetique, la biologie moleculaire, le genie moleculaire, la biologie des systemes, la sciences des memb, la biophysq, le geneie elect, le genie informatq, le controle et la biologue evolutive… la biologie systmq permet de construire des system bio artificiels destines ala recherche, l ingenierie et aux applications medicales
La synthetic biology par du principq que une fois le meca compris, testons le en creant des nouvelles prot jamais cree par la nat.
- en effet on construit la prot de A a Z et si elle est fonctionnelel on peut partir du princip que le meca a ete comprus. On va donc passer par une etape de synthetc design
Prenons par ex les chaperonne.
- le but va donc etre de cree un compacteur ou un deplieur de prot
- on commande aux chinois le mat necessaire
Voici ce que nous dit un lab ayant fait des essais sur une enzyme tres polyvalente :
- le enzymes nat peuvent ne pas convenir ala synthese asymetrq en raison de la limitation de la selectivite, de l actv et de la stabilit
- L evolution dirigee peut etre aaaplq pour ameliorrer les prop indesirables des enzymes
- les methodes de criblage a haut debut constt une condition prealibles a levolution dirigee
- ainsi nous avons devlpp une metgode a haut debit basee sur des enzymes et sur MS pour determin l exces enantiomerique d alcools
- ensuite nous avons applq ces methd pour mettre au poins la P450pyr monoxygenase, une enzyme polyvalente destinee a de nombreux types de reactions utls telles que l hydroxylation
- dans les premiers effors, nous avons inverse et ameliore l enantioselectivite de la monooxygenase P450pyr pour la biohydroxylation asymetrique des pyrrolidines et piperidines N substt par evolution dirigee
- dans un cas plus recent nous avons concu le P450pyr pour l hydroxylation sous terminale hautement regio et enantioselectv d alcanes ce qui represente un excellent ex de l ingenierie P450 pour l actv de la liaison C-H
En effet toutes les enzymes ont des act accessoires : elles pevuent se tromper (1 fois sur 10 milions)
- ces erreurs peuvent etre exploitees : on peut par ex recrute une enzyme qui phosphorolyse alors qu elle ne devrait pas et en accelerant son evlution on est capable de selectionner uniquement cette forme pour cela on introduit des mutations dans le gene codant pour cette enzyme.
- mais commet faire ? par pcr … mais en utls une polymerase error qui va mettre un peu n importe quoi dans l ADN en faisant attention tout de meme a ne pas mettre de codons stop que le nombre d aa hydrophobes soient suffisant,
- Pour aug les mutations aleatoires on peut aussi trvl dans des conditions ionq anormales.
  - on selectionne ensuite les prot qui expriment la prot desirer ou qui realise la fonction desire
Pour realiser cette selection, il est necss de choisir des bact poouvant exp la prot
- celle qui pousse ou exprime les prot sont les bonnes
- on peut realiser cette selection mille fois pour reccp la meilleure actv
Cependant, en changeant le code genetq de lenzyme on va aussi la destabilisee :
- elle va par ex devenir thermosensible a cause des mutations
- Il est donc important d alterner les cycles d evolution en commencant par selctionner pour la mutations Y puis pour une plus grande resistante a la temperature et au stress en general

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