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Biología Molecular > Análisis de ac. nucleicos > Flashcards

Análisis de ac. nucleicos Flashcards

1
Q

Es el primer paso para los estudios de biología molecular y para las técnicas de DNA recombinante, secuenciación, mutagénesis.

A

Extracción del DNA -> medicina forense, nanotecnología de DNA

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2
Q

¿De qué depende la elección del método de extracción del DNA?

A

Del tipo de ác. nucleico que se va a extraer, del organismo de origen de esos ác. nucleicos (prok, plantas, virus), de la fuente del ác. nucleico (sangre, suero, orina, LCR) y de la técnica en que se utilizará el ac. nucleico extraído

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3
Q

Menciona algunas fuentes de ácido nucleico

A

Sangre, suero, plasma, biopsia, orina, LCR, raspado bucal, LA, folículo capilar, etcétera

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4
Q

Pasos para la extracción del DNA

A

-Lisis de las células y liberación del DNA
-Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
-Precipitación de DNA
Sal salina saturada -> desnaturaliza proteínas
-Lavado de DNA con agua

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5
Q

Estudio que mide la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra

A

Espectrofotometría -> Mide la longitud de onda y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra.

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6
Q

Mientras más luz absorba menos concentración. V o F

A

FALSO -> Mientras mas luz absorba mayor concentración
 DNA y RNA absorción: 260nm
 Proteínas: 280nm
 Fenol: 270

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7
Q

Unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico

A

Fluorometría

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8
Q

¿Qué es la fluorometría?

A

 Unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico
 Absorbe la luz a una determinada longitud de onda y emite una longitud de onda superior.
 La concentración es proporciona a la intensidad de emisión fluorescente

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9
Q

Colorante utilizado en fluorometría

A

Hoechst 33258

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10
Q

¿Qué son las pruebas de PCR?

A

Reacción en cadena de la polimerasa son una forma rápida y muy precisa de diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Las pruebas detectan el ADN o el ARN de un patógeno

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11
Q

¿Qué se necesita para realizar una PCR?

A

-Secuencia de DNA
-Enzima DNA polimerasa
-Desoxiribonucleotidos (dNTP)
-Primers -> se colocan ya hechos

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12
Q

Es el fragmento de DNA que contiene el gen a buscar

A

DNA templete

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13
Q

Usamos proteína de esta bacteria para aguantar temperatura del termociclador

A

Thermus aquaticus (Taq)

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14
Q

Principal enzima que se utiliza para amplificar secuencias del genoma humano

A

Taq polimerasa

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15
Q

Función del cloruro de magnesio

A

Es cofactor de la Taq polimerasa

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16
Q

Características que deben tener los primers

A

-Son diseñados por el investigador, buscando que sea complementario a la secuencia buscada
-Son cortos y proporcionan extremo 3´
-Alto contenido en C y G (3 puentes de H+)

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17
Q

Es una solución amortiguadora necesaria para que la Taq polimerasa haga su función

A

Buffer / Cofactor

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18
Q

Fases de la PCR (3)

A

Desnaturalización
Hibridación
Extensión o Elongación

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19
Q

¿Qué ocurre en la desnaturalización?

A

-Se separan las cadenas DNA a 95ºC (20 a 30 seg)
-Se rompen puentes de H+

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20
Q

¿Qué ocurre en la hibridación?

A

Fase donde los primers se alinean al extremo 3´ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria
-> Tm 50°C a 60°C (temp de alineamiento del termociclador)

21
Q

¿De qué depende la temperatura en la fase de hibridación?

A

Depende de los primers

22
Q

Fórmula para estimar la temperatura melting o de hibridación

A

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

23
Q

¿Qué ocurre en la extensión?

A

Fase en la que la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza a agregar dNTP´s complementarios para crear las cadenas completas de DNA

24
Q

Fase en la que Taq polimerasa pone nt

A

Extensión

25
Q

Temperatura óptima para la reacción de extensión

A

72ºC

26
Q

¿Cuántas ciclos tiene una PCR?

A

de 30 a 40 ciclos
1er ciclo con un cadena de DNA tengo 2
4 ciclos = 8 DNA

Multiplicar por 2

27
Q

¿Qué hacemos al final de la PCR?

A

Se realiza un gel de electroforesis

28
Q

¿Qué es la electroforesis?

A

Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico

29
Q

¿Qué se necesita para la electroforesis?

qué genera

A

Cámara de electroforesis
Genera campo eléctrico alrededor de un gel
La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía

30
Q

¿Para qué sirve la corriente eléctrica en la electroforesis?

A

Para mover las moléculas y que se separen a través de un gel

31
Q

¿Qué función tienen los poros del gel?

A

Actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes

32
Q

Función del gel de agarosa

A

Se usa para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas

33
Q

Es un polisacárido extraído de algas marinas

A

Gel de agarosa -> separar fragmentos de DNA, que van de 100 pb a 25 kb
-Genera poros

34
Q

Caract. de los poros

A

-El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada
-La concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido

35
Q

Caract. de RPC estándar

A

Amplificación de un segmento de DNA utilizando dos partidores -> se detecta la amplificación es mediante geles de agarosa

36
Q

Aplicación del RPC estándar

A

Detección cualitativa de un segmento de DNA, si lo tiene o no

37
Q

Caract. de RCP múltiple

A

Amplificación de 2 o más segmentos de DNA utilizando varios partidores en una sola reacción de amplificación

38
Q

Aplicaciones de RCP múltiple o multiplex

A

Detección cualitativa de varios segmentos de DNA en una sola reacción de RPC -> dif virus o segmentos en una sola muestra

39
Q

Caract. de RPC-RFLP (Restriction fragment length polymorphisms)

A

RPC estándar con paso posterior de digestión con enzimas de restricción

40
Q

Se usa en la detección de polimorfismos genéticos (SNPs)

A

RPC-RFLP

41
Q

Caract. de la RT (Reverse transcriptase) -RPC

A

Síntesis de cDNA a partir de RNA mediante transcripción reversa, seguido de una RPC

42
Q

Se utiliza esta PCR para detección de virus RNA

A

La RT - RPC -> al hacer transcriptasa reversa podemos detectar RNA

43
Q

Caract. de RPC - TR (Real time) qPCR

A

-Es CUANTITATIVA
-PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluróforos para la detección de los fragmentos amplificados
-Cambian los primers y polimerasa, no podemos esperar productos tan grandes (40-60 pares de bases)

44
Q

Aplicaciones del RPC-TR (Real time)

A

-Detección cualitativa de uno o varios segmentos de DNA
-Cuantificación de DNA en la muestra (cargas) o expresión de genes (asociada a una reacción de transcripción reversa)
-Para ver cuánto virus, RNAm tenemos

45
Q

Qué prueba usar de PCR si mi paciente tiene UN solo virus y ¿por qué?

A

-PCR en tiempo real pues es más sensible para pequeñas cantidades
-Ideal para hacer diagnóstico -> método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos

46
Q

¿Qué es una sonda fluorescente?

A

Secuencia de nucleótidos del gen de interés

47
Q

dar vuelta a flash y aprender

A

La sonda es secuencia de nt adentro del gen
Hago secuencia de nt que la pueda complementar
A la hora de hacer la PCR, tengo primers y la sonda que diseñé que se complementa a esa gen
Le pongo fluoroforo e inhibidor del mismo -> no quiero que se encienda, al estar unidos está inhibido
Cuando sea la temp de alineamiento se va a pegar los primers y la sonda
En la temp de extensión se van agregando nt; hasta que llega a donde está la sonda y lo que hace es quitar la sonda y sigue poniendo nt, el fluroforo se activa y manda señal que detecta la computadora

48
Q

En una reacción de qPCR, a medida que los cebadores y la ADN polimerasa duplican la cadena molde, ¿Qué ocurre?

A

SYBR Green se une al ADN de doble cadena a medida que se forma.

Biología Molecular (24 decks)

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