Arbeiten mit Nukleinsäuren Flashcards Preview

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Flashcards in Arbeiten mit Nukleinsäuren Deck (10)
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1
Q

Benennen und beschreiben sie min. 3 Methoden der Nukleinsäure Konzentrationsbestimmung?

A

a) OD-Messung mittels Absorptionsspektrometrie:

OD 260 = Messung der optischen Dichte bei 260 nm mittels Photometer mit UV-Lampe

Probe à in Quarzglasküvette vorgelegt àmit UV bestrahlt à Absorption der Probe

c (µg/ml) = (OD260 * V * F)

c (µmol/ml) = (OD260 * V * F) / (Mw * L)

OD260 …optische Dichte bei 260 nm Wellenlänge

V…Verdünnungsfaktor

F…Multiplikationsfaktor (50 dsDNA, 40 RNA, 37 ssDNA, 20 für Einzelstrang-Oligos)

Mw…Molekulargewicht je Base (330 g/mol) bzw. Basenpaar (660 g/mol)

L…Länge in kb

Limitierung:

  • Messungen nur zwischen OD: 0,1 – 1 ≈ 5 –50 µg Nukleinsäure/ml (à „großeMengen nötig!)
  • Keine Unterscheidung von DNA, RNA und Nukleotide möglich – Mischproben!
  • Messung des Verhältnisses 260: 280 nm àProteinkontaminationen (1,8 – 2,2: hochreine Probe)

b) Agarosegel-Elektrophorese:

Probe wird auf Agarosegel aufgetragen, Nachweisgrenze bei ca. 5 ng DNA / Bande.

Durch Anlegen von elektr. Feld à wandern Nucleinsäuren (neg. geladen) durch Gelmatrix.

Auftragen von Aliquot gemeinsam mit Verdünnungsreihe (Eichreihe) à Konzentration bekannt

à durch Vergleich der Bandenintensität kann DNA-Konz. der Probe abgeschätzt werden

VT: Banden ausscheiden à weiter verarbeiten (präp. Verabeitung)

c) Dot-Quantifizierung:

abgekürzte Version von b) à Verdünnungsreihe wird mit Probe verglichen

Ethidiumbromid (EtBr)à zum Färben

NW-Grenze: 5 ng DNA/Bande

NT: Mischproben, ungenau

d) Konzentrationsbestimmung mittels Fluoreszenzfarbstoffe:

Probe mit DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff in Fluorometer

Anregung: 365nm

Messung: 420nm

Sensitivität 5-500 ng/ml

2
Q

Benennen und beschreiben sie min. 4 Methoden der Nukleinsäure Markierung?

A

Radioaktive Methoden , Nukleotide markiert mit: - Isotopen geringer Halbwertszeit 32P, 35S,

                                                                                     bedenklich:       - Isotopen längerer Halbwertszeit <sup>3</sup>H, <sup>14</sup>C

Nichtradioaktive Methoden, Nukleotide markiert mit: - Biotin

                                                                                                                        - Digoxigenin (DIG...Steroid)
                                                                                                                        - Fluoreszein a) _Endmarkierung_: Austausch der Phosphatgruppe am **5’OH Ende** der Nukleinsäure durch **radioaktives Phosphat (<sup>32</sup>P)** von **ATP** durch **Polynukleotidkinase**; 3. P auf ATP = radioaktiv

Dephosphorylierung: mittels alkalischer Phosphatase

b) Nick-Translation: DNA-Polymerase I kann beginnend an einem Bruch (=NICK) im Phospho-diesterrückrat der DNA den alten Strang abbauen und einen neuen synthetisieren

à serieller Einbau von radioaktiven Nukleotiden

c) Primerverlängerung: Denaturierung der DNA, Anlagerund eines Zufallsprimers (Hexanukleotidmix), Klenow-Fragment kopiert Matrize vom 3´-Ende des Primers weg

à Einbau von nichtradioaktiv oder radiaktiv markierten Molekülen

d) PCR: mit einem markierten Nukleotid, 1 od. 2 Primer – Sonden für einen oder beide DNA – Stränge

3
Q

Benennen und beschreiben sie min. 2 Methoden der Nukleinsäure Sequenzierung?

A

a) MAXAM – GILBERT:

basenspezifische chemische Spaltung von End-markierter DNA (32P) à Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese

DNA-Einzelstrang: am 5´ Ende markiert

in 4 Ansätzen werden die jeweiligen Basen modifiziert und abgespalten (Spaltung des Strangs)

G/A mit DMS methyliert à methylierte As/Gs: Schnitt mit HCl à meGs: Schnitt mit Piperidin

C/T mit Hydrazin modifiziert

in jedem Ansatz entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge

Auftrennung mittels Gelelektrophorese

Nachteil: gefährliche Reagenzien, schwer automatisierbar, dauert lange

a) SANGER – COULSON (Didesoxymethode):

Denaturierung der dsDNA à Hybridisierung mit Primer à in 4 Ansätzen (alle beinhalten alle 4 Basen) wird je eine der 4 Basen als ddNTP (radioaktiv markiert) zugegeben à Klenow-Fragment synthetisiert Tochterstrang bis eingebautes ddNTP, dann stoppt Poly. à Fragmente unterschiedli. Länger werden mittels PAGE aufgetrennt

4
Q

Welche Elektrophorese Methoden für Nukleinsäuren kennen sie (beschreiben sie min. 3) wozu werden sie angewandt, welche Trennleistungen können erzielt werden?

A

a) native Agarosegelelektrophorese: zur Analyse und präparativen Isolierung von ds- und ss-DNA-Fragmenten, und Plasmid-DNA mit einer Länge von > 0.3 – ca. 50 kb (300 – 50.000 bp)

à Probe wir auf Agarosegel aufgetragen à Anlegen eines elektrischen Feldes à Nukleinsäuren (neg. geladen) wandern durch Gelmatrix à Auftrennung durch Siebwirkung; EtBr zum Färben

Referenzprobe mit bekannter Konzentration (Eichreihe) läuft mit

Trenneigenschaften: je höher Agarose-Konz., desto kleinere Fragmente trennbar

b) denaturierende Agarosegelelektrophorese:

DNA: zur Analyse von ssDNA à alkalische Laufbedingungen über 50 mM NaOH

RNA: Denaturieren der RNA mit Formaldehyd (50°C), Gel mit Formaldehyd

    Denaturieren der RNA mit DMSO (50°C) + kovalenter Modifikation mit Glyoxal, natives Gel

c) native PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese): zur Trennung von dsDNA-Molekülen

à Acrylamidkonzentration von Kettenlänge und Farbmarker (zB Bromphenolblau) abhängig Trennleistung: 6-2000bp

d) denaturierende PAGE: zur Trennung von ssDNA-Molekülen, mit Harnstoff als Denaturant

à Acrylamidkonzentration von Kettenlänge und Farbmarker (zB Bromphenolblau) abhängig

Trennleistung: 2-500bp

5
Q

Benennen und beschreiben sie min.3 Methoden zum Färben von Nukleinsäuren in Elektrophoresegelen.

A

a) Ethidiumbromid: UV-Anregung

Färben der Gele für ca. 30 min in einer 0,5 µg/ml EtBr-Lösung;

Alternative: Zugabe von 0,1 µg/ml EtBr zum Gel
Sensitivität: ca. 20 ng/Bande

b) Methylenblau: UV unabhängig, irreversible Färbung

Färben der Gele ca. 15 min mit 0,02% Methylenblau Lösung in H2O

Sensitivität: 40 ng/Bande

c) Sensitivere Alternativen: UV-Anregung

SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen, PicoGreen

Sensitivität: 5 ng/Bande

6
Q

Benennen und beschreiben sie 5 Methoden der Nukleinsäure Hybridisierung, wofür werden sie verwendet.

A

Hybridisierung: an DNA Einzelstrang wird ein komplementärer DNA/RNA Einzelstrang über Wasserstoffbrückenbindung angelagert

a) Southernblot: NW von DNA

DNA wird elektophoretisch nach Größe aufgetrennt à auf Membran transferiert = BLOTTEN

à Hybridisierung mit markierter Sonde nachgewiesen

b) Northernblot: Nachweis von mRNA

à Prinzip wie Southern Blot

c) Dot-Blot: NW von RNA und DNA OHNE Größenauftrennung

à Probe: auf Nitrocellulosemembran fixiert à mit komplementärer, markierter DNA überschichtet

d) In-situ Hybridisierung: NW von Expression von mRNA in Geweben, Position von Genen in Chromosomen
e) Kolonie/Plaque Hybridisierung: NW von DNA in Bakterienkolonien oder Bakteriophagen

7
Q

Beschreiben sie eine Methode zur spezifischen Reinigung eukaryontischer mRNA?

A

→ über Poly-A-Schwanz am 3’OH Ende der mRNA à Binden von Oligo(dT)s an Zellulose in Affinitätschromatografie-Säule → nur mRNAs bleiben an Säule hängen → Auswaschen der mRNA mit hoch- und niederkonzentrierter Salzlösung → gereinigte mRNA fliesst aus der Säule ab und wird durch EtOH gefällt (EtOH im Überstand, mRNA unten)

8
Q

Wie kann mit Hilfe der OD-Messung die Konzentration von Nucleinsäuren bestimmt werden. Geben sie entsprechende Formeln für (dsDNA, ssDNA, Oligonucleotide) an.

A

→ dsDNA:

c [µmol/ml] = (OD260 * V ) / (13,2 * L)

→ Oligonukleotide und ssDNA:

c [µmol/ml] = (OD260 * V ) / (10 * L)

9
Q

Wie wird für DNA/DNA Hybridisierungen die geeignete Hybridisierungs Temperatur berechnet? Nennen sie empirisch errechnete Richtwerte?

A

Tm = 81,5°C - 16,6 (log10 [Na+] ) + 0,41 (%G + C) - 0,63 (%Formamid) – 600 / L

Tm…Temperatur, bei der die Hälfte der Nukleotide in der Doppelhelix dissoziiert sind

Hybridisierungs-Topt: Tm- 25°C

[Na+]…Natriumionenkonzentration in mol/L

G + C … Anteil von Guanosin und Cytosin

L…Länge der Sonde in b

empirisch Werte:

Spezifisch (homologe) Hybridisierung: 64-65°C (DNA/DNA)

42°C bei 50% Formamid (RNA)

10
Q

Welche nichtradioaktiven DNA Makierungs/Nachweistechniken kennen sie? Worauf beruhen die jeweiligen Techniken?

A

a) Farbnachweis: durch dunkle Farbniederschläge

→AK, an dem Enzym bindet, bindet an Probe (eigentlich an markierter Sonde komplementär zur membrangebundenen DNA) àSubstrat reagiert mit Enzym unter Bildung eines Farbstoffes (Licht);

Enzym: alkalische Phosphatase (AP) mit Nitroblautetrazolium (NBT)

                         Meerrettichperoxidase (**HRP**) mit **Chloronaphtol**

b) Chemiluminiszenz: NW von AP bzw. HRP mit chemiluminiszenten Substraten.
c) Fluoreszenz: NW von AP und HRP mit fluorogenen Substraten (Fluoreszein)

→ Anregung durch Laser notwendig

→ Vermessen mittels Scanner (Quantifizierung)