Biochemie Flashcards
(369 cards)
1
Q
B-DNA
A
>Doppelhelix ist rechtsgängig >Rotation pro Basenpaar: 35,9° >Basenpaare pro Windung: 10,5 >Steighöhe pro Bp entlang der Achse: 3,4 A >Steighöhe pro Windung: 33,2 A >Glykosylwinkel: anti >Durchmesser: 23,7 A
2
Q
A-DNA
A
>Doppelhelix ist rechtsgängig >Rotation pro Basenpaar: 33,6° >Basenpaare pro Windung: 11 bp >Steighöhe pro Bp entlang der Achse: 2,3 A >Steighöhe pro Windung: 24,6 A >Glykosylwinkel: anti >Durchmesser: 25,5 A
3
Q
Z-DNA
A
> Doppelhelix ist linksgängig
Rotation pro Basenpaar: 60°/2
Basenpaare pro Windung: 12 bp
Steighöhe pro Bp entlang der Achse: 3,7 A
Steighöhe pro Windung: 45,6 A
Glykosylwinkel: Pyrimidin: anti; Purin: syn
Durchmesser: 18,4 A
4
Q
wieviel % der Zucker treten in
cyclischer Form auf?
A
90%
5
Q
Ursprung der Basen
A
> Die Biosynthese der Purine und Pyrimidine erfolgt aus
Aminosäuren
Adenin und Guanin aus Aspartat, Glycin und Glutamin
Cytosin und Thymian und Uracil aus Aspartat
6
Q
Ursprung der Basen ohne
Aminosäuren
A
> RNA kann katalytisch aktiv sein
Basen können evolutionär aus vulkanischen Gasen (HCN) unter
Druck und hoher Temperatur (Kondensation) entstehen
kann im Labor reproduziert werden
7
Q
Chargaff’s rules
A
> Erwin Chargaff
die DNA einer Zelle sollte ein 1:1 Verhältnis von Pyrimidin und
Purin haben
die Menge an Cytosin sollte der von Guanin äquivalent sein, so
auch die von Adenin der von Thymin
8
Q
Wieviel WSBB bilden Adenin
und Thymin?
A
2
9
Q
Wieviel WSBB bilden Guanin
und Cytosin?
A
3
10
Q
Eigenschaften der WSBB
zwischen Purin und Pyrimidin
A
> die WSBB sind zwar schwach, aber zielgerichtet
H ist elektropositiv (Donor Heteroatom), O/N ist elektronegativ
(Akzeptor Heteroatom)
WSBB sind am stärksten, wenn sie linear sind (180°)
WSBB-Bildung ist ein kooperativer Prozess
11
Q
wozu werden diese
Absorptionseigenschaften
gebraucht?
A
> um die ‘‘Schmelztemperatur’’ der DNA-Doppelhelix zu bestimmen
Absorptionsmaximum bei 260 nm (AMP und UMP)
12
Q
was absorbiert stärker: ssDNA
oder dsDNA?
A
> ssDNA hat die höhere Absorption, weil die Atome freiliegen und
die π-Elektronen besser mit dem Solvent interagieren können
13
Q
wie bestimmt man die
Schmelztemperatur der DNA?
A
> die Schmelztemperatur ist direkt abhängig von der GCKonzentration,
da diese Bindung durch drei WSBB stärker und
damit relevanter ist
die Schmelztemperatur ist definiert als die Temperatur, bei der
50 % der DNA einzelsträngig vorliegt
14
Q
Röntgenstrukturanalyse der
DNA
A
>Rosalind Franklyn >Röntgenbeugungsdiagramm der DNA (man kann DNA nicht kristallisieren!) >starke Beugung bei 3,4 A -> Abstand zwischen den Basenpaaren
15
Q
Was ist die Keto-Enol-
Tautomerie?
A
> Formalismus, um das Gleichgewicht zu beschreiben und NICHT
die Wanderung von Atomen
Lässt Guanin wie Adenin wirken
16
Q
tautomere Formen Uracil
A
Lactam, Latim, double Lactim
17
Q
was ist stabiler: DNA oder
RNA?
A
> in alkalischer Lösung ist RNA durch die 2’OH-Gruppe
hydrolyseempfindlicher
18
Q
Eigenschaften A-DNA
A
> die relativ starre Form der A-DNA geht durch Wasserverlust aus
der B-Form hervor (wenn der Wassergehalt unter ca. 75 % absinkt)
die Helix der A-Form ist breiter und kürzer als die der B-DNA-Helix
und ihre Basenpaare sind gegenüber der Helixachse stärker
geneigt und zeigen nicht senkrecht darauf
die Basenpaare sind durch die C3’-Endokonformation ggü. der
normalen Anordnung in der Helix um 11° gekippt
die Phosphate und andere Gruppen der A-Helix binden weniger
H2O-Moleküle als die B-DNA
RNA und DNA-RNA-Hybride liegen teilweise in der AKonformation
vor
die Lage der 2’-OH-Gruppe in der Ribose verhindert aus
sterischen Gründen die B-Form -> das 2’-O-Atom würde drei
Atomen der benachbarten Phosphatgruppe und einem Atom der
nächsten Base zu nahe kommen
in der A-Helix zeigt das 2’-O-Atom nach außen und von den
anderen Atomen weg
die C-3’-Endo-Faltung der A-DNA führt zu einer Neigung der
Basenpaare um 19° aus der senkrechten Helixachse
Bei RNA-Helices trägt auch die sterische Behinderung durch die
2’-OH-Gruppe zur Ausbildung der A-Form bei
19
Q
Eigenschaften B-DNA
A
> unter physiologischen Bedingungen liegt der Großteil der DNA in
der B-Form vor
das C-2’-Atom liegt außerhalb der Ebene (C-2’-Endokonformation)
20
Q
Eigenschaften Z-DNA
A
> linksgängige Helix, bei der die Phosphatgruppen des Rückgrats
eine Zickzacklinie bilden
DNA-Oligomere wie CGCGCG nehmen unter bestimmten
Bedingungen die Z-Konformation an
wird durch hohen Salzgehalt begünstigt
tritt in CG-reichen Sequenzen auf, ist aber nicht auf diese
beschränkt
die Phosphatgruppen rücken näher aneinander ->
elektrostatische Abstoßung
wird durch negatives supercoiling stabilisiert
Z-DNA während der Transkription:
um das Nukleosom: positive supercoiled DNA
zwischen den Nukleosomen: negative supercoiled DNA (Z-DNA ->
verhindert, dass sich die DNA weiter um die Nukleosomen wickelt)
während der Transkription: negative supercoiled DNA (Z-DNA)
21
Q
Welche Konformationen
können Purine annehmen?
A
> sowohl syn, als auch anti
>freie Drehbarkeit an der glykosidischen Bindung
22
Q
Welche Konformationen
können Pyrimidine
annehmen?
A
> nur die anti Konformation
-> bei der syn-Konformation wäre die sterische Hinderung
zwischen den O-Atomen zu groß
23
Q
wie entstehen die große und
die kleine Furche?
A
> dadurch, dass sich die glykosidischen Bindungen eines
Basenpaares nicht diametral gegenüberstehen
24
Q
Eigenschaften große und
kleine Furche der DNA
A
> die kleine Furche enthält das O-2 eines Pyrimidins und das N-3
eines Purins des Basenpaares, die große Furche befindet sich auf
der gegenüberliegenden Seite
auch z.B. Methylgruppen des Thymins liegen in der großen Furche
in der B-DNA ist die große Furche breiter (1,2 nm gegenüber 0,6
nm) und tiefer (0,85 nm ggü. 0,75 nm) als die kleine
jede Furche ist mit potenziellen Donator- und Akzeptoratomen
für WSBB ausgekleidet, die spezifische WW mit Proteinen
ermöglichen
in der kleinen Furche können das N-3 von Adenin und Guanin
sowie das O-2 von Thymin und Cytosin als WSBB-Akzeptoren
dienen; die Aminogruppe am C-2 von Guanin kann WSBB-Donator
sein
in der großen Furche ist das N-7 des Guanins und Adenins in
potenzieller Akzeptor, ebenso das O-4 des Thymins und das O-6
des Guanins; die Aminogruppen am C-6 des Adenins und am C-4
des Cytosins können als WSBB-Donatoren dienen
25
Vergleich der Furchen: A-DNA
| - B-DNA
>in der A-DNA ist die große Furche größer, in B-DNA ist sind die
Furchen tiefer
26
An welcher Furche binden
| sequenzspezifische Proteine?
>an der großen Furche, da diese mehr Merkmale zur
Unterscheidung eines Basenpaares von einem anderen aufweist
als die kleine
>auch ist sie aufgrund ihrer Größe leichter zugänglich für
Wechselwirkungen mit Proteinen, die sequenzspezifische DNA
erkennen
27
Erkennungs- und
| Spaltungsstelle von der EcoRVEndonuclease
>um die Spaltungsstelle herum: Symmetrie der Sequenz
>die DNA ist verzerrt (nicht exakte B-Form) ->entweder durch das
Binden an ein Protein, oder es war schon vorher so
>WSBB bieten die Spezifität der Erkennung-> Erkennung der Basen
durch WSBB in der großen Furche
>das Auffälligste an dem Komplex ist die Verformung der DNA, die
in der Mitte deutlich geknickt wird
>die mittleren beiden TA-Basenpaare in der Erkennungssequenz
sind bei der Entstehung des Knicks von entscheidender Bedeutung
-> sie treten nicht mit dem Enzym in Kontakt, sind aber offenbar
für diese Form erforderlich, weil sie sich leicht verformen lassen
>die Sequenz 5'-TA-3' gehört zu den am leichtesten verformbaren
Basenfolgen
>würde sich die DNA nicht verformen lassen, so würde kein
Phosphat nah genug an die Aspartatreste des aktiven Zentrums
gelangen und es könnte sich keine vollständige
Magnesiumbindungsstelle bilden
>Die Verformung des Substrats und die anschließende Bindung des
Magnesiumions sind für die hohe Spezifität verantwortlich
28
Vorteil, wenn DNA an
| manchen Stellen gebogen ist
>bietet Möglichkeit für die spezifische Erkennung von Proteinen
29
Was machen AT-reiche
| Sequenzen?
>tendieren dazu, von der B-Form der DNA abzuweichen -> Biegung
der DNA
30
Was verursacht eine Biegung?
>4 oder mehr konsekutive Adenin-Reste
31
6 konsekutive Adenin-Reste?
>führen zu einer Biegung von 18°
32
Repressor
>als Repressor bezeichnet man ein Protein, welches an den
Operator der DNA bindet und damit die Bindung der RNAPolymerase
an den Promotor blockiert -> Verhinderung der
Transkription
Bsp: >Cro-Repressor Dimer des Phagen λ
33
Bindung der
Erkennungshelices α 3 in der
großen Furche
Glutamin bindet an Adenin
34
Besondere DNA-Strukturen
Palindrom, Mirror repeat, Hairpin, Cruciform (>stabile Schleifenstruktur -> besteht aus einem Strang
>als Doppelstrang: Cruciform (cross-like shaped DNA))
35
Triplex DNA
>zusätzliche WSBB mit funktionellen Gruppen in der großen Furche
(N7, O^6, N^6 der Purine: Hoogsteen Positionen)
>Hoogsteen Basenpaarung
>Bildung eines C-G-C+ Tripletts erfordert ein protoniertes Cytosin
36
Hoogsteen Paare
>Karst Hoogsteen
>Erweiterung der Watson-Crick-Basenpaarung, indem sich noch
eine dritte Base anlagert -> 3-Strang-Struktur
>tritt nur auf, wenn man lange Sequenzen von Adenin hat
37
G-Tetraplex/G-Quadruplex
>Nucleinsäuresequenzen, die besonders viel Guanin enthalten,
sind in der Lage, viersträngige Strukturen auszubilden
>bestehen aus einer quadratischen Anordnung von
Guaninmolekülen, die von WSBB durch Ausbildung von Hoogsteen-
Paaren stabilisiert werden
>zusätzlich werden sie durch ein monovalentes Kation (meist
Kalium) im Zentrum der Tetrade stabilisiert
38
nicht kanonische RNAStrukturen:
| mRNA
>DNA von Eukaryoten ist primär im Nucleus der Zellen
>Proteinsynthese findet am Ribosom im Cytoplasma statt
>für der Transfer von genetischer Information wird ein messenger
Molekül gebraucht
>RNA tritt im Nucleus und im Cytoplasma auf
>mit zunehmender Proteinsynthese steigt der RNA- Level
>RNA transportiert die genetische Information von der DNA zum
Ribosom -> mRNA
>in Bakterien: polycistronisch (mehrere Gene auf 1 RNA)
>in Eukaryoten: monocistronisch (1 Gen auf 1 RNA)
39
selbst-komplementäre
| Sequenzen in einem RNAMolekül
>führen zur Bildung komplexer Strukturen
| >G-C, A-U, aber auch G-U Basenpaare (hairpin, Bulle, internal loop)
40
Stem-loop structures
>treten auf, wenn zwei komplementäre Nukeotidsequenzen in
einer einzelsträngigen Nukleinsäure doppel-helikale Regionen
bilden
>können komplett aus Watson-Crick-Paaren bestehen
>dabei entstehen oft ''mismatches'' und ''Ausbeugungen'' ->
destabilisieren die lokale Struktur, aber können auch wichtig für
Faltungsmotive oder höhere Strukturen/ Funktionen sein
41
ungewöhnliches
| Basenpaarungsmuster in tRNA
```
>gelegentlichtes Beiteiligen eines Phosphates oder einer 2'-OH
Gruppe
Bsp: Cytosin-Guanin-7-Methylguanin,
Adenin-N^2-Dimethylguanin
Adenin-Uracil-Adenin
```
42
Sekundärstruktur der RNA:
| RNase P
>G-U-Basenpaare können nur vor der Faltung des soeben
synthetisierten RNA Stranges gebildet werden
>es gibt keine RNA Polymerasen, die ein U gegen ein G ersetzen
würden
43
katalytische Aktivität der RNA
>Prozessierung der ribosomalen RNA in Tetrahymena
>Self-Splicing eines Vorläufers der 26 S rRNA: ein Intron von 414 nt
wird von der RNA selbst herausgeschnitten
>anschließend weitere Auto-Prozessierung, bis die katalytisch
aktive L19 RNA hergestellt wurde
>katalytische Aktivität erfordert eine gut definierte 3D-Struktur!!!
44
Hammerhead Ribozyme
>tritt in genomischer RNA von Virusoiden auf
| >der selbstspleißende RNA-Abschnitt erfordert Mg 2+!
45
DNA-Methylierung
>der Methylierungsgrad der DNA ist neben der Verpackung mit
Histonen ein weiterer Mechanismus, mit dem die für einen
bestimmten Zelltyp unpassende Genexpression unterdrückt
werden kann
>das C-Atom 5 von Cytosin kann durch spezifische
Methyltransferasen methyliert werden
>im Genom der Säugetiere sind rund 70 % - 90 % der 5'-CpG-3'
Sequenzen methyliert (dies entspricht 3% - 6% aller Cytosine)
>die Methylgruppe des 5'-Methylcytosins ragt in die große Furche
und kann dort ohne weiteres die Bindung von Proteinen
beeinträchtigen, die stimulierend auf die Transkription wirken
>in 40 % - 60 % aller menschlichen Gene sind CpG Inseln mit 5'-
regulatorischen Elementen assoziiert
46
Verteilung der CpG-Sequenzen
| im Genom der Säugetiere
>die CpG-Sequenzen sind im Genom der Säugetiere nicht
gleichmäßig verteilt
>viele CpG-Sequenzen wurden durch eine Mutation, das heißt
durch Desaminierung des 5-Methylcytosins zu Thymin, in TpGSequenzen
umgewandelt
>die Stellen nahe am 5'-Ende der Gene blieben jedoch wegen ihrer Bedeutung für die Genexpression erhalten >deshalb findet man heute die meisten Gene in CpG-Inseln, Bereichen des Genoms, die rund viermal so viele CpG-Sequenzen enthalten wie das restliche Genom
47
Wie schützt eine Wirtszelle, die ein Restriktionsenzym enthält, ihre eigene DNA?
>Die Wirts-DNA wird an spezifischen Adeninbasen innerhalb der Erkennungssequenzen der Wirtszelle durch Methylasen geschützt >sobald ihre Erkennungssequenz in einem DNA-Molekül methyliert ist, spaltet die Restriktionsendonuclease diese DNA nicht mehr >für jede Restriktionsendonuclease erzeugt die Wirtszelle eine entsprechende Methylase, welche die Wirts-DNA an der entsprechenden Methylierungsstelle markiert -> Restriktions-Modifikations-Systeme
48
DNA-Methyltransferase
>übertragen Methylgruppen auf Nukleinbasen >Methylgruppendonor: SAM
49
Wie wird das Methylierungssingal gelesen?
>Transkriptionsfaktoren >Methyl-DNA-binding proteins >histon-modifizierende Enzyme
50
Methylierung von Cytosin an Prosition 5
Cytosin ------------> 5-Methylcytosin
| AdoMet ----> AdoHcy durch DNA-Methyltransferase
51
Was moduliert die DNA-Methylierung?
>Regulation der Genexpression >Organisation der Chomatinstruktur >Inatkivierung des X-Chromosoms >stabile Unterdrückung von Trasposons >zelluläre Differenzierung >Embryo Entwicklung >Cytosin-Methylierung von Gen-Promotoren unterdrückt die Transkription >Cytosin-Methylierung von codierenden Regionen in Genen hat einen geringen Einfluss auf die Gen-Expression >dynamische Prozesse
52
wie hoch ist der Proteinanteil eines Chromosoms?
50%
53
Chromatin
>DNA und alle Proteine, die an sie gebunden sind
54
Histone
>reich an basischen Aminosäuren wie Arginin und Lysin >bei allen Eukaryoten findet man 5 Hauptklassen von Histonen, die sich hinsichtlich Molekülmasse und Aminosäurezusammensetzung unterscheiden >die Histone H3 haben bei allen Eukaryoten fast die gleiche Aminosäuresequenz, das Gleiche gilt für H4 -> strenge Konservierung ihrer Funktion >Die Histone H1, H2A und H2B stimmen bei den verschiedenen Eukrayoten nicht so stark überein >jeder Histontyp kann durch Enzyme verändert werden: Methylierung, Acetylierung, ADP-Ribosylierung, Phosphorylierung, Glykosilierung,Sumoylierung, Ubiquitinierung >solche Abwandlungen beeinträchtigen die elektrische Gesamtladung, die Form und andere Eigenschaften der Histone ebenso wie die funktionellen und strukturellen Eigenschaften des Chromatins und die spielen eine Rolle bei der Regulation der Transkription
55
Nucleosomen
>jede Nucleosomenperle enthält 8 Histonmoleküle: je 2 Moleküle H2A, H2B, H3 und H4
>zusammen mit der Verbindung zwischen der Perlen ergibt sich eine Wiederholungseinheit, die i.d.R.etwa 200 bp lang ist, wobei 146 bp dicht um den 8-teiligen Histonkern gebunden sind, während der Rest als Linker-DNA zwischen den einzelnen Nucleosomen dient
>DNA ist 1,65 mal um Histonkomplex gewunden
>das Histon H1 ist an die Linker-DNA gebunden
>behandelt man Chromatin mit Enzymen, die DNA abbauen, so werden vorwiegend die Linker zerstört und es entstehen Histon-Partikel mit einer gebundenen DNA von jeweils 146 bp, die vor dem Abbau geschützt sind
>diese Nukleosomenkerne kann man kristallisieren und es zeigte sich durch Röntgenstrukturanalyse, dass die DNA in Form einer linksgängigen Solenoidsuperspirale um die 8 Histonmoleküle gewunden ist
>negativ superspiralisierte DNA um den Histonkern >positiv superspiralisierte DNA zwischen den Histonkernen >in den Linkern gibt es CG-reiche Sequenzen, die lokale Z-DNA bilden >die Linker zwischen den Histonkernen können durch Nukleasen gespalten werden, jedoch nicht die DNA, die mit den Histonkernen in Kontakt steht
>ein weiterer Faktor, der die Bindung der DNA an die Histone des
Nukleosomenkerns beeinflusst, ist die Sequenz der gebundenen
DNA
>Histonkerne binden nicht zufällig an DNA, sondern lagern sich an
bestimmte Stellen an (AT-reiche Sequenzen)
>dies erleichtert die Komprimierung der kleinen Furche, die für
die feste Windung der DNA um den Histonkern notwendig ist
(über einen Arg-Rest)
56
Gemeinsamkeit der Histone
>die 3D Strukturen bestehen alle aus einer langen alpha-Helix, die
mit einem Loop verbunden ist und kürzeren Helices an jedem
Ende
57
Histon Octamer
>(H2A)2, (H2B)2, (H3)2, (H4)2
>die Histone des Nukleosomenkerns oligomerisieren durch die
Bildung eines 4-Helix-Bündels
>zwei (H2A-H2B)-Dimere wechselwirken mit (H3-H4) Tetramer
> Bildung des Octamers
>die basischen Reste der Histone wechselwirken mit dem Zucker-
Phosphat Rückgrat der DNA
58
Wie oft windet sich die DNA
| um den Histon-Komplex?
1,65 mal
59
Die Rolle von H1
>H1 ist an der Außenseite gebunden
>hat eine lange, helikale Struktur und ist basisch, aber untersch.
von der Octamerstruktur
>wirkt wie eine Klemme, um die DNA zu fixieren
60
um welchen Faktor verkürzt
sich die DNA durch das
Winden um einen
Nukleosomenkern?
>um den Faktor 7
61
30 nm Faser
>dient der weiteren Verdichtung (100-fach)
>erfordert pro Nukleosomenkern ein Molekül Histon H1
>die Organisation der DNA in 30 nm Fasern erstreckt sich nicht
über das gesamte Chromosom, sondern ist von Abschnitten mit
sequenzspezifischen DNA-bindenden Nicht-Histon-Proteinen
unterbrochen
>die 30 nm Struktur ist von der Transkriptionsaktivität des
jeweiligen DNA-Abschnitts abhängig ->Bereiche, in denen Gene
transkribiert werden, befinden sich anscheinend in einem weniger
geordneten Zustand und enthalten wenig oder gar kein Histon H1
62
Histone remodeling factors
>katalysieren das Hinzufügen oder Entfernen verschiedener
chemischer Elemente an Histone
>beeinflusst die Bindungsaffinität zwischen Histonen und DNA
63
Histonmodifizierung:
| Acetylierung von Lysin
>reduziert die positive Ladung der Histone
>dadurch weniger kompakte Struktur
>erhöhte Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren
>Signal wird z.B. durch ''Chromatin-remodeling factors'' erkannt
64
Histon-Acetyltranferasen
| HATs
>Enzyme, die bestimmte Lysinreste acetylieren
>während der Transkription wird das Histon H3 an Lys4 in
Nucleosome in der Nähe des 5'-Endes (N-terminal) der codierenden Region
methyliert sowie an Lys36 der gesamten codierenden Region
>durch die Acetylierung mehrerer Lys-Reste in den
aminoterminalen Domänen der Histone H3 und H4 kann sich die
Affinität des gesamten Nucleosoms für DNA verringern
65
Histon-Deacetylasen (HDAC)
>ist die Transkription eines Gens nicht mehr erforderlich,
vermindert sich durch die Tätigkeit von HDACs die Acetylierung
der Nucleosomen in seiner Nachbarschaft im Rahmen eines
allgemeinen Genabschaltungsvorgangs, der das Chromatin wieder
in seinen inaktiven Zustand überführt
66
wie hängen Acetylierung und
| Methylierung zusammen?
>reverse Prozesse
67
Methylierung von Lysin oder Arginin
>stabilisiert die kompakte Form der DNA (polare Interaktionen) ABER kann auch zur Inaktivierung durch sterische Hinderung führen. Abhängig von Position der Methylgruppe
>kein Zugang für Transkriptionsfaktoren
>Enzyme: Trothorax Proteine
>Signal wird zB durch ''Chromatin Remodeling Factors'' erkannt
>Signal wird durch Lysin-Demethylasen ausgeschaltet
68
Histon remodelling
RNA Pol II kann Nukleosom in DNA gebundenes Histonhexamer umwandeln. Nachdem RNA pol II weg ist Rückumwandlung zu Oktamer oder weiteres remodelling
Nukleosom Mobilisierung durch DNA-Translocating Enzyme (ATP)
69
DNA-Minor Groove Binder
>Netropsin A
>Distamycin A
>Cisplatin
>selektiver Vorteil gegen Malaria: die DNA von Malaria Parasiten
hat mehr AT-reiche Sequenzen als die von Säugern -> Distamycin
und Netrospin haben im Minor-Groove eine AT-Präferenz und
inhibieren das Wachstum von plasmodium falciparum in Kultur
70
Netropsin A
>bindet an AT-reiche Sequenzen
| >viele sind cytotoxisch -> Anti-Krebs-Therapie
71
Distamycin A
>cytotoxische Aktivität durch das Anheften von alkylierenden
Substanzen (z.B. Senfgas)
>bindet sehr fest am Minor Groove -> kann nicht durch
Transkriptionsfaktoren repariert werden
>Wechselwirkung von Tallimustin
mit dem DNA Duplex Tridecamer;
enthält die T4GA Konsensussequenz
72
Was ist ein Interkalator?
```
>flache, aromatische, planare Moleküle
>lagern sich zwische Basenpaare ein
>kann zur frame shift Mutation führen
>ist der Interkalator flach genug, lagert er sich in die DNA und
wirkt cytotoxisch
```
73
Acridin Orange
```
>Prototyp eines Interkalators
>meistens auch cytotoxisch
>manche werden gebraucht, um DNA im Labor zu färben (z.B.
Ethidium Bromid)
>Komplex zwischen Ethidium
und 5-Iodo UpA
```
74
Daunorubicin
>sogar zwei Moleküle können sich
| zwischen ein Basenpaar einlagern
75
Acridin Orange/cis-platinhybrid
>man kann auch Platin-Komponente einfügen
>anfänglich: Interkalation
>dann: Schneiden der DNA im Zucker-Phosphat-Rückgrat
76
Meselson Stahl Experiment
| 1957
a) >Zellen wurden über viele Generationen in einem Medium
gezüchtet, das ausschließlich schweren Stickstoff (15N) enthielt
>in ihrer DNA befand sich also ausschließlich 15N, sodass sich
nach der Cs-Cl-Dichtezentrifugation eine einzige Bande bildete
b) >nachdem die Zellen in ein Medium überführt wurden, das
ausschließlich leichten Stickstoff (14N) enthielt, wanderte die
nach einer Zellgeneration isolierte DNA in eine höhere Position im
Gradienten (violette Bande)
c) >nachdem die Replikation sich über eine weitere Generation
fortgesetzt hatte, waren zwei Hybrid-DNAs
(violett) und zwei leichte DNAs (rot), die
ausschließlich 14N DNA enthielt,
entstanden
>damit war bestätigt, dass die Replikation
semikonservativ ist
77
John Cairns
>Autoradiographie
>er ließ E coli Zellen in einem Medium mit Thymidin wachsen, das mit Tritium (H3) markiert war, sodass die Zellen radioaktiv wurden
>nachdem er die DNA isoliert, ausgebreitet und mit einer
fotographischen Schicht überzogen hatte, auf die er die
Radioaktivität mehrere Wochen einwirken ließ, erzeugte das Thymidin ''Spuren'' aus Silberkörnern in einer Emulsion, sodass sich ein Bild des DNA-Moleküls ergab
>die Spuren zeigten, dass das unversehrte Chromosom von E. coli ein einziger großer Ring von 1,7 mm Länge ist
>die radioaktive DNA, die während der Replikation aus den Zellen isoliert wurde, war als eine zusätzliche Schleife zu erkennen
>daraus zog Cairns den Schluss, dass die Schleife auf die Bildung zweier radioaktiver Tochterstränge zurückzuführen war, die jeweils zu einem Ausgangsstrang komplementär waren
>ein Ende oder beide Enden der Schleife sind
Replikationsgabeln, bewegliche Stellen, an denen die Ausgangs-DNA entwunden wird und die Stränge schnell repliziert werden
>damit hatte Cairns nachgewiesen, dass beide Stränge der DNA gleichzeitig repliziert werden
>eine Abwandlung seines Experiments wies darauf hin, dass die
Replikation von Bakterienchromosomen in beiden Richtungen
verläuft, also bidirektional ist: an beiden Enden der Schleife
befinden sich aktive Replikationsgabeln
78
Bidirektionale Replikation
| sichtbar gemacht
>wenn man Tritium 3H nur für kurze Zeit zusetzt und die Reaktion
dann abbricht, findet man die Markierung (rot) an einer oder an
beiden Replikationsgabeln
>das hier dargestellte Autodiagramm zeigt die Replikationsblase
bei B. subtilis
>der Bereich der größten Dichte an Silberkörnern
(Pfeile) befindet sich an den beiden Enden, wo
die Replikation stattfindet
>der nichtreplizierende Bereich des Chromosoms
außerhalb der Blase ist nicht markiert und daher
nicht sichtbar
79
Richtung der DNA Synthese
>neue Stränge werden immer in 5'-3'-Richtung synthetisiert
>da die beiden Stränge antiparallel angeordnet sind, wird der als
Matrize dienende Strang vom 3' zum 5' Ende hin abgelesen
>am kontinuierlichen Strang (leading strand) läuft die 5'-3'-
Synthese in gleicher Richtung wie die Replikationsgabel
>auf dem diskontinuierlichen Strang (lagging strand) läuft die 5'-
3'-Synthese entgegen
der Bewegung der
Replikationsgabel ->
OKAZAKI-Fragmente
80
DNA-Syntheseprozess
>grundlegende Reaktion: Phosphorylgruppentransfer
>das Nucleophil ist die 3'-OH Gruppe des Nucleotids am 3'-Ende
des wachsenden Stranges
>dieses greift den α- Phosphor des hinzukommenden
Desoxynucleosid-5'-triphosphats nucleophil an
>bei der Reaktion wird anorganisches Pyrophosphat frei
>die Reaktion verläuft mit einer nur geringen Änderung der freien
Enthalpie, da eine Phosphodiesterbindung auf Kosten einer etwas
weniger stabilen Phosphoanhydridbindung gebildet wird
>die Entstehung des Produktes wird begünstigt, weil das Enzym
Pyrophosphatase anschließend das Pyrophosphat hydrolisiert,
wobei Energie frei wird
81
Was benötigt die DNAPolymerase?
>Primer
| >Matrize
82
Primer
>Das zu verlängernde Anfangssegment eines Polymers, von dem
| die Elongation abhängt
83
Matrize
>Eine DNA- oder RNA-Sequenz, welche die Synthese einer
| komplementären Sequenz steuert
84
Klenow-Fragment
>das Fragment enthält zwei Hauptteile des vollständigen Enzyms
>einer davon ist die Polymeraseeinheit, die ungefähr wie eine
rechte Hand geformt ist und deren Domänen man als Finger,
Handfläche und Daumen bezeichnet
>neben der Polymerase gehört zum Klenow-Fragment noch eine
Domäne mit 3'->5' Exonuclease Aktivität, die eine
Korrekturlesefunktion übernimmt
>Klenow Fragment der DNA-Pol I
von E coli (T-Steitz)
85
Mechanismus der DNAPolymerase
>im aktiven Zentrum sind zwei Metallionen vorhanden
>das eine geht eine koordinative Bindung zur 3'-OH Gruppe des
Primers ein, während das andere nur mit dem dNTP interagiert
>die Phosphatgruppe des NTPs bildet eine Brücke zwischen den
beiden Metallionen
>die OH-Gruppe des Primers wird durch
das Metallion aktiviert und greift die α-
Phosphatgruppe an, sodass eine neue OP-
Bindung entsteht
>die beiden Metallionen bilden einen
Komplex mit den Carboxylgruppen von
zwei Aspartatresten in der
Handflächendomäne der Polymerase
>die Seiteketten halten die Ionen in der
richtigen Lage und Orientierung fest
86
Aufgaben der Aspartatreste
>Deprotonierung (Aktivierung)
| >die Metallionen in Position halten
87
Warum akzeptiert die DNA Pol I nur 2'-Deoxynukleotide?
>ein Phenylalanin und ein Glutamat hinter dem ankommenden
dNTP lassen keinen Platz für eine 2'-OH-Gruppe -
> die sterische Hinderung wäre zu groß
(Pre-check #1)
88
Wechselwirkungen an der
| kleinen Furche
>DNA-Polymerasen wirken ggü. den Basenpaaren in der kleinen
Furche als Donatoren für zwei Wasserstoffbrücken
>an den betreffenden Positionen stellen alle Watson-Crick-
Basenpaare
Wasserstoffbrückenakzeptoren bereit
>im Innern des Enzyms nimmt die DNA
die A-Form an, da hier die kleine Furche
zugänglicher ist
(Pre-check #3)
89
Spezifität der Replikation
>die Bindung eines dNTP an die DNA-Polymerase löst eine
Konformationsänderung aus
>die Fingerdomäne dreht sich und bildet eine enge Tasche, in die nur ein richtig geformtes Basenpaar ohne Weiteres hineinpasst
>die Konformationsänderung ist nur dann möglich, wenn es sich bei den dNTP um den Watson-Crick-Partner der Base in der Matrize handelt
>falsche dNTPs können nicht stark am aktiven Zentrum
der DNA Pol binden ->sie werden ausgeschlossen,
bevor die Phosphodiesterbindung
gebildet werden kann
(Pre-check #2)
90
Korrekturlesefunktion der
| Polymerase
> fungiert als 3'-5'-Exonuclease
>wenn eine falsche Base eingebaut wird, verlangsamt sich die
DNA-Synthese aufgrund der Schwierigkeiten, die auftreten, wenn
ein Nicht-Watson-Crick-Paar durch die Polymerase gefädelt wird
>darüber hinaus ist die fehlgepaarte Base nur schwach gebunden
und daher an ihrer Position beweglich
>durch die Verzögerung besteht genügend Zeit, damit sich der
neu synthetisierte Strang aus dem aktiven Zentrum der
Polymerase hinaus in das aktive Zentrum der Exonuclease hinein
bewegt
>dort wird die DNA abgebaut, ein Nucleotid nach dem anderen,
bis sich der DNA-Strang zurück in das aktive Zentrum der
Polymerase bewegt und die Synthese fortgesetzt wird
91
andere DNA-Polymerasen:
| DNA Pol I
>90 % der Polymeraseaktivität in E coli
>fügt 600 Nukleotide/Minute hinzu -> geringe Prozessivität
>''cleaning up''; 5'->3' Exonukleaseaktivität und 3' -> 5' Exonukleaseaktivität
92
andere DNA-Polymerasen:
| DNA Pol III
>Hauptreplikationsenzym von E coli
93
andere DNA-Polymerasen:
| DNA Pol II, IV, V
>DNA Reparatur
94
Nick-Translation
>bei diesem Vorgang wird ein mit einer DNA-Matrize gepaarter DNA- oder RNA-Strang von der 5'->3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Pol I abgebaut und durch die Polymeraseaktivität desselben Enzyms ersetzt
>beide Aktivitäten sind von Bedeutung für die DNA-Reparatur und die Entfernung der RNA-Primer bei der DNA-Replikation
>grün: Nucleinsäurestrang, der entfernt wird (DNA oder RNA); rot: der ihn ersetzende Strang
>am Beginn der DNA-Synthese steht ein
''Nick', d.h. ein Einzelstrangbruch mit einem freien 3'-OH und einem 5'-Phosphat
>die Pol I verlängert den zur Matrize
komplementären Strang und verschiebt
den Nick dabei an der DNA entlang (daher
Nick-Translation)
>wenn sich die Pol von der DNA löst,
bleibt der Nick zurück und wird von
einem anderen Enzym geschlossen
95
DNA Pol III Holoenzym und
| Helikase von E coli
>die DNA-Doppelhelix vor der Polymerase wird durch eine
hexamere Helikase entwunden, die man als DnaB bezeichnet
>Kopien von SSB Proteinen binden an die entwundenen Stränge und halten sie voneinander getrennt, sodass sie als Matrizen dienen können
>der Leitstrang wird kontinuierlich von der Pol III synthetisiert
>die Topoisomerase II führt gleichzeitig negative Superspiralen ein, um topologische Probleme zu
vermeiden
>die Synthese des Folgestranges erfolgt in Koordination mit der Synthese des Leitstranges -> wie ist das möglich?
>das Holoenzym umfasst zwei Kopien des Core-Enzyms der Polymerase
>das Core-Enzym besteht aus der eigentlichen DNA-Polymerase
(der α-Untereinheit), der ԑ-Untereinheit
(einer 3'->5'-Exonuklease als Korrekturlesefunktion), einer
weiteren Untereinheit mit der Bezeichnung θ sowie zwei Kopien der dimeren β-Untereinheit, die die gleitende Klammer bildet
>die Core Enzyme sind mit einer zentralen Struktur gekoppelt, die die Untereinheitenstruktur γτ2δδ'χφ besitzt
>die γτ2δδ'-Struktur ist der clamp loader Komplex
>die χφ-Untereinheiten treten mit dem SSB in WW
>der gesamte Proteinkomplex interagiert mit der hexameren Helikase DnaB
>die Matrize des Folgestranges wird zu einer Schleife gebogen, sodass die Matrize in einer der Untereinheiten der DNA-Pol III in derselben Richtung läuft (5'->3') wie die Matrize des Leitstranges in der anderen Untereinheit
>nach ca. 1000 Nukleotiden lässt die DNA-Pol III die Matrize des Folgestranges los, indem das Klammerprotein freigesetzt wird
>es bildet sich eine neue Schleife, eine neu gleitende Klammer tritt hinzu, und die Primase synthetisiert wieder einen kurzen RNA-Primer um die Bildung eines weiteren OKAZAKI-Fragments zu beginnen
>diese Art der Replikation bezeichnet man als Posaunenmodell, da sich die Schleife wie der Außenzug bei einer Posaune verlängert und verkürzt
>die Lücken zwischen den Fragmenten des neu gebildeten Folgestranges werden durch die DNA Pol I aufgefüllt; außerdem entfernt es mit seiner 5'->3'Exonukleaseaktivität auch die Ribonukleotidprimer, der von dem Polymerasezentrum liegt
>der Primer kann nicht von der DNA-Pol III beseitigt werden, da diesem Enzym die Fähigkeit zur 5'->3'-Korrektur fehlt
>schließlich verbindet die DNA-Ligase die einzelnen Fragmente
96
Enzyme und Proteinfaktoren in der DNA Replikation
>die Replikation in E coli beinhaltet über 20 verschiedene Enzyme und andere Proteine
>Replikasekomplex oder Replisom
>die Trennung der Elternstränge: Helicase >Strangtrennung: topologische Spannung -> release durch Topoisomerase
>Stabilisierung der getrennten Stränge: SSB
>Synthese der Primer: Primasen
>Entfernung der Primer und Ersetzen durch DNA: 5'->3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Pol I
>3 Stufen: Initiation, Elongation, Termination
>ähnlich der Biosynthese von RNA und Proteinen
97
Regulation der DNAReplikation
>die Initiation ist der einzige Teil der DNA-Replikation, der
reguliert wird
>Die Replikation findet nur einmal pro Zellzyklus statt
>dabei spielt die Methylierung der DNA ihre WW mit dem
Cytoplasma eine wichtige Rolle
>Dam-Methlase methyliert N6 der Adenine in palindromischen 5'-GATC Sequenzen im OriC
>es gibt 11 5'-GATC Sequenzen im OriC (sonst nur 1 in 256 bp)
>sofort nach der Replikation ist der oriC hemimeythliert
>dann WW mit der Plasmamembran
>anschließend komplette Methylierung durch Dam Methylase
98
DUE
>DNA-unwinding element
>der OriC von E.coli: enthält Sequenzelemente, die in allen Oris von Bakterien gefunden wurden
>3 Sequenzen mit 13 bp und 4 Sequenzenmit 9 bp
>mind. 9 verschiedene Proteine sind beteiligt
>GATC wird methyliert durch die Dam Methylase am N6 von Adenin
>AT-reich
>durch Hemimethylierung kann man bei Reparatur zwischen den beiden Strängen unterscheiden
99
AAA+-ATPasen
>ATPases associated with diverse cellular activities
>viele davon (auch DnaA und DnaC) hydrolisieren ATP relativ langsam zu ADP und unterziehen sich einer konformationellen Änderung; sie tendieren auch dazu, Oligomere zu bilden
>8 DnaA Moleküle (alle an ATP gebunden) binden an 4
Wiederholungen
>die DNA windet sich um diesem Komplex, wodurch eine
rechtshändige helikale Struktur entsteht
>die AT-Region wird dadurch in den 13 bp Wdh denaturiert
(erfordert ATP und das Protein HU (histonelike Protein))
>die hexamere Helicase DnaB bindet an die getrennten Stränge
(unterstützt durch DnaC)
100
HU-Dimer
>Bindung der dsDNA durch die beiden Arme
| >kleines, basisches, hitzestabiles Protein
101
PcrA
>Helicase von Bacillus thermophilus (4 Domänen)
>A1 bindet ATP (P loop)
>A1 und B1 binden ssDNA
>PcrA ist ein Monomer,
viele andere Helikasen
(zB DnaB) sind Multimere
>Verbrauch: ein ATP pro entwundenes Nukleotid
102
Mechanismus der PcrA (und
| auch anderer Helikasen)
>die Domänen A1 und B1 binden an ssDNA in der Abwesenheit von ATP
>das Binden von ATP verursacht eine konformationelle
Neuanordnung und das Schließen der Lücke zwischen A1 und B1
> folglich wird die WW zwischen A1 und ssDNA geschwächt
>anschließend wird ATP zu ADP und P hydrolisiert -> die Lücke zwischen A1 und B1 öffnet sich wieder
>nun hat A1 eine höhere Affinität zu ssDNA als B1
-> A1 zieht somit die DNA an sich heran -> Translokation
103
Konservierung der Helikasen
>Sequenzvergleich mit anderen Helikasen zeigt, dass 7 Regionen konserviert werden
>diese sind an ATP-Bindung oder ssDNA Bindung beteiligt
104
replikative Helikase des
| Bakteriophagen T7
>ATP ist zwischen den Untereinheiten lokalisiert
| >die Helikase arbeitet als eine molekulare Maschine (ähnlich der PcrA von B. stearothermophilus)
105
Wozu führt
| Superspiralisierung?
>ein superspiralisiertes Molekül ist viel kompakter als ein
entspanntes der gleichen Länge
>eine superspiralisierte DNA bewegt sich bei der Zentrifugation oder Elektrophorese schneller als entspannte DNA
106
```
Verwindungszahl Lk (linking
number)
```
>definiert als die Anzahl der Rechtswindungen eines DNAStranges um die in einer Ebene gelegene Helixachse
107
Topoisomere
>Moleküle, die sich nur in der Verwindungszahl unterscheiden
>können nur durch Schneiden eines oder beider Stränge
ineinander überführt werden
108
rechtsgängige Helix
>negative Zahl (negative supercoiling)
>wird Lk erniedrigt, so führt dies sowohl zu einer rechtsgängigen
(negativen) Superspiralisierung der DNA-Achse als auch zur Entwindung der Doppelhelix
109
linksgängige Helix
>positive Zahl (positive supercoiling)
110
Typ I Topoisomerasen
>katalysieren in einer thermodynamisch begünstigten Reaktion die Entspannung von superspiralisierter DNA
>schneiden nur einen Strang
111
Typ II Topoisomerasen
>nutzen die durch ATP-Hydrolyse gewonnene Energie, um
negative Superspiralen in DNA-Moleküle einzuführen
>schneiden beide Stränge
112
Mechanismus Topoisomerase I
>die DNA bindet im Hohlraum der Topoisomerase
>die OH-Gruppe des Tyr 723 greift die Phosphatgruppe in einem Strang des DNA-Rückgrats an und bildet eine
Phosphodiesterbindung zwischen Enzym und DNA, wobei die DNA gespalten wird und eine freie 5'-OH Gruppe entsteht
>nachdem nun das Rückgrat des einen Stranges gespalten ist, kann die DNA um den zweiten Strang frei rotieren
>angetrieben wird die Drehung durch die Freisetzung der Energie, die in der Superspiralisierung gespeichert war
>durch die Rotation der DNA werden die Superspiralen
entwunden
>das Enzym kontrolliert die Rotation so, dass die Entwindung nicht zu schnell von statten geht
>die freie OH Gruppe der DNA greift den Phosphotyrosinrest an,
sodass das Rückgrat wieder verbunden und das Tyrosin freigesetzt wird
>nun kann sich die DNA ungehindert vom Enzym lösen
>der Vorgang führt dazu, dass sich ein superspiralisiertes Plasmid ganz oder teilweise entspannt
113
```
Mechanismus
Topoisomerase II (DNA Gyrase)
```
>da ein superspiralisiertes Molekül im Gegensatz zu seinem
entspannten Gegenstück unter Torsionsspannung steht, erfordert seine Entstehung den Aufwand von Energie
>Topo II Enzyme sind Dimere mit zwei inneren Hohlräumen
>der größere Hohlraum hat oben und unten jeweils ein Tor, das für die Wirkung des Enzyms von entscheidender Bedeutung ist
>eine Doppelhelix (G-Segment) bindet an das Enzym
>jeder Strang wird dabei neben einem Tyrosin aus einem der beiden Monomere positioniert und zwar so, dass es eine kovalente Bindung zum Rückgrat der DNA ausbilden kann
>der Komplex bindet dann locker an eine zweite DNA-Doppelhelix
(T-Segment)
>jedes Monomer des Enzyms besitzt eine ATP-bindende Domäne
>die Bindung von ATP (2) führt zu einer Konformationsänderung, welche die Annäherung der beiden Domänen stark begünstigt
>indem die Domänen näher zusammenrücken, halten sie das gebundene T-Segment fest; gleichzeitig sorgt die Konformationsänderung dafür, dass die beiden Stränge des G-Segments getrennt und gespalten werden
>jeder dieser beiden Stränge wird dann über eine Tyrosinphosphodiesterbindung am Enzym festgehalten >nun wandert das T-Segment durch das gespaltene G-Segment hindurch in den großen zentralen Hohlraum
>anschließend führt die Ligation des G-Segments dazu, dass das T-Segment durch das Tor am unteren Ende des Enzyms entlassen wird
>durch die Hydrolyse von ATP (2) sowie die Freisetzung von ADP und Orthophosphat können sich die ATP-bindenden Domänen trennen und das Enzym auf die Bindung eines neuen T-Segments vorbereiten
>der gesamte Vorgang führt dazu, dass die Verwindungszahl um den Wert 2 abnimmt
114
Gyrasehemmer
>die Topoisomerase II der Bakterien (DNA-Gyrase) dient als Angriffspunkt für mehrere Antibiotika, die das prokaryotische Enzym wesentlich stärker hemmen als das eukaryotische
>Novobiocin blockiert die Bindung des ATP an die Gyrase >Ciproflaxin beeinträchtigt die Spaltung und Wiedervereinigung der Ketten ->beide werden zur Behandlung von Harnwegsinfektionen eingesetzt
115
Inhibitoren der eukaryotischen Topoisomerase II
>Doxorubicin, Etoposid
>beeinträchtigen entweder die Spaltung der Doppelhelix oder verhindern die Wiedervereinigung der Stränge -> Protein-verknüpfte DNA-Brüche
116
E coli Primase
>DnaG RNA Polymerase
>verantwortlich für die Synthese der RNA-Primer für die ssDNA
>hat 5 Domänen: Zink-bindende Domäne, katalytische Domänen (bestehen aus 3 Subdomänen), Helikase (DnaB)-bindende Domäne
>das katalytische Zentrum enthält mehrere negativ geladene saure Reste (Asp, Glu) -> Mg2+-Ionen
->teilweise Neutralisation der negativen Ladung
>in vielen Organismen sind die Helikase und die Primase kovalent verbunden (Phage T7)
117
Problem bei der Lagging Strand Synthese
>Für jedes Okazaki Fragment wird neue clamp benötigt
>Anhäufung von benutzten β-clamps
>300-600 Clamps pro Zelle, aber ca 4000 OKAZAKI Fragmente
>Lösung: Entladung benutzter Clamps durch DnaX Komplex oder die δ-Untereinheit des DnaX-Komplexes (clamp loading complex = γ complex)
>Clamp Komplexe mit anderen Proteinen werden vor Entladung geschützt, nur bereits benutzte Clamp werden entladen
Clamp loading: Interaktion zwischen δ und β sorgt dafür dass sich β-β um 15 A öffnet
118
Prozessivität der Polymerase
Anzahl der Nukleotide die angeheftet wurden bevor die Polymerase von Template fällt
119
Ligase
>die DNA-Ligase braucht eine freie OH-Gruppe am 3'-Ende der einen DNA-Kette und eine Phosphatgruppe am 5'-Ende der anderen
>Energiequelle erforderlich: Eukaryoten und Archaeen: ATP; Bakterien: NAD+
>DNA-Ligase kann nicht zwei Moleküle einer einzelsträngigen DNA zum Ring schließen; sie schließt vielmehr Brüche in doppelsträngigen DNA-Molekülen Mechanismus:
>Adenylierung (Hinzufügen eines AMP) der ԑ-Aminogruppe eines Lysin-Rests im aktiven Zentrum des Enzyms -> Bildung eines kovalenten Enzym-Adenylat-Komplexes (über Phosphoamidbindung) ->das ist die Aktivierung des Enzyms!
>das AMP wird auf das 5'-Phosphat des DNA-Moleküls übertragen, um die Phosphatgruppe zu aktivieren -> DNA-Adenylat Komplex
>nucleophiler Angriff des 3'-OH auf das aktivierte Phosphat -> Bildung einer Phosphodiesterbindung (AMP ist gute Abgangsgruppe, evtl Mg2+ als Katalysator für Ligase-Reaktion)
120
Termination der DNA - Replikation in E coli
>am Ende treffen sich die beiden Replikationsgabeln des ringförmigen E.coli Chromosoms in einem Terminationsbereich, der mehrere Exemplare einer 20 bp langen Sequenz namens Ter enthält
>die Ter Sequenzen bilden auf dem Chromosom eine Art Falle, die die Replikationsgabel erreichen, aber nicht mehr verlassen kann
>sie dienen als Bindungsstelle für das tus Protein (terminus utilization substance)
>der Komplex aus tus und ter kann nur die aus einer Richtung ankommende Replikationsgabel festhalten (verhindert weiteres Entwinden durch Helikase-->nicht essentiell)
>in jedem Replikationszyklus ist nur ein solcher Komplex aktiv - nämlich der erste, auf den eine der beiden Replikationsgabeln trifft
>trifft eine der beiden Replikationsgabeln auf den tus-ter-Komplex, so bleibt sie stehen; die andere kommt zum Stillstand, wenn sie auf die erste (bereits entstehende) Gabel trifft
121
Mechaninsmus des Tus/Ter-Komplexes
>das Replisom bewegt sich auf dem DNA Strang entlang und nähert sich Tus an
>die Helicase DnaB unterstützt die Primase (DnaG) in der Synthese eines letzten Folgestrang-Primers
>DnaB wird von Tus blockiert und dissoziiert von dem Strang
>DNA-Pol III Holoenzym vervollständigt die Synthese des Leistranges bis zum tus-ter-Komplex und synthetisiert ebenfalls des letzte OKAZAKI Fragment auf dem Folgestrang
>das Holoenzym dissoziiert und hinterlässt eine Y-geformte Struktur, welche aus ssDNA auf dem Folgestrang besteht
122
Trennung der verketteten Ringe nach Terminierung der Replikation
>Zur Trennung der verketteten Ringe (Catenane) ist eine Typ II Topoisomerase erforderlich: T-Segment fällt durch das Loch der Topoisomerase, Tyrosin-OH-Gruppe bindet kovalent an Phosphat --> Intermediat Tyrosinseitenkette mit DNA (EINZIGER FALL DNA+PROTEIN)
>die getrennten Chromosomen verteilen sich dann bei der Zellteilung auf die Tochterzellen
123
4 Phasen des eukaryotischen
| Zellzyklus
>M-Phase: Mitose und Zellteilung (Zytokinese) -> relativ kurz
>G1-Phase: ''gap'' -> Zellwachstum -> längste Phase
>S Phase: ''Synthese'' -> DNA-Synthese
>G2-Phase: die tetraploide Zelle wird für die Mitose vorbereitet;
Chromosomenkondensation in G1, G2; G0 Phase: Ausruhphase
124
Kontrolle des Zellzyklus
>DNA Synthese erfolgt nur in der S-Phase
>in der G2-Phase wird die DNA zur Replikation vorbereitet
>Regulation? -> für jede Phase eines Zellzyklus gibt es bestimmte Cycline
>Cycline sind an Kinasen geknüpft
>für jeden Zyklus existiert eine best. cyclinabh. Kinase
>durch Cycline und cyclinabhängige Kinasen (CdKs)
>Cycline werden während einer Phase des Zellzyklus hergestellt und während der nächsten Phase komplett verbraucht
>jedes Cyclin bindet an eine spezifische CdK und aktiviert sie
>anschließend phosphoryliert die CdK spezifische Zielproteine, die dann ihre Aufgabe im jeweiligen Zustand des Zellzyklus erledigen können
>die ''Check Points'' müssen passiert worden sein, bevor der Zellzyklus in die nächste Phase eintreten kann
>CdK2 bindet an ORC (''origin-recognition-complex'') und
verknüpft damit den Zellzyklus an die DNA Replikation
-> DNA Synthese wird hier initiiert
125
Welche drei DNA-Polymerasen
werden für die eukaryotische
Replikation benötigt?
>DNA-Polymerase α
>DNA-Polymerase δ
>DNA-Polymerase ԑ
126
DNA-Polymerase α
>tritt ausschließlich im Nucleus auf
>nimmt teil an der Replikation chromosomaler DNA in 5'-3'-
Richtung (an einem ssDNA Template)
>hat keine Exonukleaseaktivität
>Prozessivität: nur 100 Nukleotide ca.
>dicht mit der Primase assoziiert -> Komplex namens Pol
α/Primase
>synthetisiert RNA Primer von 7-10 Nukleotiden
>diese werden durch 15 Desoxynukleotide erweitert
>spezifischer Inhibitor: Aphidicolin
127
DNA-Polymerase δ
>wird auch durch Aphidicolin inhibiert
>keine Assoziation mit der Primase
>hat eine 3'-5' Exonuklease Aktivität -> Proofreading >Prozessivität: extrem hoch, aber nur assoziiert mit PCNA >PCNA=proliferating cell nuclear antigen
>PCA kommt im Nucleus vor und in proliferierenden Zellen >reagiert mit Antikörpern, die in Patienten gebildet werden, die unter der Autoimmunkrankheit systemischer Lupus leiden
128
Struktur PCNA
>Trimer ( β-2 Clamp ist nur ein Dimer)
>Struktur ähnelt der des β 2 Clamp von E coli Pol III
>β 2 ist jedoch ein Homodimer, während PCNA aus 3 identischen Untereinheiten besteht
>die Sequenz von E.coli Pol III β 2 und PCNA ähnelt sich nicht!!!
>PCNA bildet eine ringförmige Klammer, die die Prozessivität der Polymerase erheblich steigert -> Beispiel, dafür, dass die 3D Struktur in der Evolution besser konserviert wird als die Aminosäuresequenz
129
DNA-Polymerase ԑ
>wird auch durch Aphidicolin inhibiert
>keine Assoziation mit der Primase
>hat eine 3'-5' Exonuklease Aktivität -> Proofreading
>diese Exonukleaseaktivität schneidet Hexa- oder Heptanukleotide des wachsenden Leitstranges, keine einzelnen Nukleotide
>Pol ԑ scheint eine Leitstrang Synthetase zu sein
130
RFC
>Replikationsfaktor C
Folgestrang:
>Entfernung des Pol-α/Primase vom Template-Strang -> Polymerasewechsel
>hilft PCNA, die Klammer auszubilden und erleichtert den Zusammenbau aktiver Replikationskomplexe
>die Untereinheiten des RFC-Komplexes haben eine signifikante Sequenzähnlichkeit zu den Untereinheiten des bakteriellen clamp loading γ Komplexes ->RFC lädt PCNA auf den Template Strang an eine Position in der Nähe der Primer
>anschließend bindet Pol δ an PCNA und erweitert den Primer mit hoher Prozessivität
>RFC hat die gleiche Aufgabe wie die beta-Untereinheit (clamp loader) in E coli
131
Pol δ /PCNA
>notwendig für die Lagging-Strand Synthese
| > Polymerase Exchange Mechanismus
132
Pol ԑ
>notwendig für die Leading-Strand-Synthese
133
MCM
>Helikase >besteht aus 6 Untereinheiten (2-7) >Mini Chromosome Maintenance
134
Primerentfernung durch FEN1
>Flap (etwa 10 Nukleotide RNA7DNA am 5'-Ende des stromabwärts liegenden Okazaki Fragments werden durch Pol δ entfernt, wenn diese die Synthese des aktuellen Okazaki-Fragments abschließt)
>FEN1 (Flap-endonuclease 1) schneidet den flau an der y-förmigen Kreuzung mit der Duplex-DNA --> Lücke wird durch DNA Ligase I geschlossen
>3 FEN1-Moleküle binden an PCNA-Trimer
135
RPA
>Replication Protein A
>eukaryotsiches SSB
>Heterotrimer
136
Pol γ
>tritt nur im Mitochondrium auf
137
Pol βηικζ
>DNA Reparatur
138
Pol β
>kleines Enzym (nu 335 Aminosäurereste)
>nimmt die Form einer offenen rechten Hand an (wie viele andere
Polymerasen auch)
139
Replikationsursprung in
| Eukaryoten
>eukaryotische Zellen replizieren die DNA mit einer
Geschwindigkeit von 50 Nukleotiden/sek -> 20 mal langsamer als E.coli
>ein eukaryotisches Chromosom enthält ca. 60 mal mehr DNA als ein prokaryotisches -> bidirektionale Replikation würde über einen Monat dauern
>multiple Ursprünge -> autonom replizierende Sequenzen (Arsch) oder ''Replikatoren'' -> ein pro 3-300 kb -> S Phase dauert ein paar Stunden
140
Ein Replikationsurprung in der
| Hefe
>hexamere DNA Helikase -> die Beladung der DNA mit der replikativen Helikase ist das Schlüsselereignis für die Initiation der Replikation
>bei der Helikase handelt es sich um einen heterohexameren Komplex aus MCM-Proteinen (minichromosome maintenance)
>Cdc6 Protein (Cell division cotrol protein 6)
>die charakteristischen Boxen im Ursprung werden nur schwach konserviert zwischen den verschiedenen Organismen
141
Zusammensetzung des
eukaryotischen
Initiationskomplexes
>die Cycline werden am Ende der M-Phase (Mitose) schnell durch eine ubiquitinvermittelte Proteolyse abgebaut -> die Abwesenheit von Cyclin erlaubt die Bildung von präreplikativen Komplexen (prä-RCs) an
den Stellen, an denen die Replikation initiiert wird
>durch die Bildung von prä-RCs ist die Zelle
bereit für die Replikation, ein Zustand, der auch als
Lizensierung bezeichnet wird
>der prä-RC kann die DNA - Replikation nicht initiieren -> ist nur während der S-Phase aktiv
>die temporäre Trennung stellt sicher, dass jeder
Replikationsursprung nur einmal während eines Zellzyklus die DNA Replikation initiieren kann
>ORC = ''origin recognition complex''
>Hexamer von Orc1 - Orc6 ->bindet an den Urpsrung -> nimmt Cdc6 + Cdc1 auf (in Hefe) -> Bindungs des MCM Komplexes von Mcm2 - Mcm7 an die DNA - > MCM ist die Helikase
>all diese Proteine (außer Cdt1) sind ATPasen der AAA Familie (wie auch DnaA, DnaB und DnaC)
>Phosphorylierung ist wichtig, um sicherzustellen, dass die
Replikation an den Zellzyklus gekoppelt ist
142
Kopplung der DNA-Synthese an
| den Zellzyklus
>die Origins of Replications bilden einen Komplex namens ORC (Origin-of-replication complex)
>zusätzlich gibt es eine hexamere Helikase (MCM Komplex (MCM 2-7))
>Protein Cdc 6 (aus de Hefe) -> Helikase loading factor -> bindet an die Boxen
>in E coli gibt es drei Kopien dieser Boxen (mit
GATC Sequenz)-> methyliert an der exozyklischen Gruppe von Adenin
>die Proteine, die dort binden, sind DnaA und DnaC >bereits in der G Phase sind die Origins markiert als Origins
>der ORC Komplex bindet an die Boxen und die DNA windet sich um diesen Komplex in einer kleinen Schleife -> alles ist vorbereitet, aber es kann noch nicht ''gefeuert'' werden
>erst wenn die S Phase des Zellzyklus erreicht ist, kommen Cdk2 und Cdc6 dazu >Phosphorylierung des Cdc6 durch Cdk2 und Phosph. der Helikase(Cdc 45-MCM-GINS) an einer Untereinheit -> Pre-RC Komplex kann ''feuern''
>dann kann der MCM Komplex binden, wird ebenfalls phosphoryliert -> Initiation kann beginnen
143
Warum funktioniert die MMC nicht in vitro?
>MMC Helikase hat in vitro nicht funktoniert -> erst mit Cdc45 und GINS (''go-ichi-ni-san'')
>Cdc45-MCM-GINS - Helikase
>RPA=replication protein A; ATR = DNA damage kinase(checks for DNA damage--> can switch on cascade so that replication stops until damage is fixed)
>FCP fork protection complex
144
Was macht HIV?
>Human immunodeficiency virus
>tötet viele der infizierten Zellen (v.a. T-Lymphozyten)
>führt dazu, dass das Immunsystem des Wirtsorganismus immer stärker unterdrückt wird
>die Reverse Transkriptase ist sehr fehleranfällig -> hohe Mutationsrate
>die Reverse Transkriptase gelangt zusammen mit dem einzelsträngigen RNA-Genom des Virus in die Wirtszelle >dort katalysiert sie als Erstes die Synthese eines DNA-Stranges, der zur viralen DNA komplementär ist >anschließend baut sie den RNA-Strang des Hybrids aus viraler RNA und DNA ab und ersetzt ihn durch DNA
>der so entstandene DNA-Doppelstrang wird häufig in das Genom der eukaryotischen Wirtszelle eingebaut
145
Chromatin remodeling factors
>Wenn Replikationsgabel das Nukleosom passiert, dissoziiert das Histonoktamer zu einem (H3-H4)2 Tetramer und zwei H2A-H2B Dimere
>H3-H4 bleibt lose an einen Tochterstrang gebunden, H2A-H2B dissoziiert komplett
>neu synthetisiertes H3-H4 wird eingesetzt, neues und altes H2A-H2B bildet mit ihm Komplexe--> Oktamer
>Histonchaperone (= chromatin-assembly factors)
146
Vermehrungszyklus des HIV
Adsorption - reverse Transkription - Ringbildung - Integration - Transkription - Translation - Proteinspaltung - Zusammenbau und Ausschleusung
147
3 Aktivitäten der Reversen
| Transkriptase
>RNA-directed DNA Polymerase
>RNase H
>DNA-directed DNA Polymerase
148
Retrovirus
>RNA Viren, die die Reverse Transkriptase enthalten
149
Struktur der Reversen
| Transkriptase
```
>blau:p66 Finger
>rot: p66 Handfläche
>grün: p66 Daumen
>gelb: p66 Verbindung
>orange: RNase H Untereinheit
>grau: p51 Untereinheit
>magenta: RNA Strang
>blau: DNA Primer Strang
```
150
welche Konformation hat das
| RNA/DNA-Hybrid?
>A-Konformation
151
hat die Reverse Transkriptase
| eine Proofreading Funktion?
>nein, keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität
>bei jeder Replikation unterliegt das Virus einem Fehler
->viele Mutationen
152
Medikamente gegen HIV/AIDS
>AZT (Azido Thymidine)
>hat eine Azidogruppe anstatt einer 3'-OH Gruppe
>AZT wird von den T Lymphozyten aufgenommen und zu AZT Triphosphat umgewadelt (direkt AZT Triphosphat
zu verabreichen wäre ineffektiv, weil dies nicht
die Plasmamembran überqueren kann)
>die HIV Reverse Transkriptase hat eine höhere Affinität zu AZT als zu dTTP
>wenn AZT an das 3'-Ende des wachsenden DNA-Stranges angeheftet wird, führt das Fehlen der 3'OH-Gruppe zu einer vorzeitigen Termination und die virale DNA -Synthese stoppt
153
Problem des AZT
>man inhibiert nicht nur die virale DNA, sondern auch die zelluläre (allerdings hat die zelluläre DNA eine geringere Affinität zu AZT als zu dTTP, daher scheint das nicht das größte Problem zu sein) >das AZT scheint auch Knochemarkzellen zu schädigen, welche die Vorläufer der Erythrozyten sind >viele Patienten, die AZT nehmen, entwickeln Anämie
154
NNRTIs
>Nicht Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren >gemeinsame Strukturmerkmale mit langen Phenyl Substituenten (schwenkenden Tyr-Resten) >binden nicht-kompetitiv zwischen Handfläche und Daumen (nicht am aktiven Zentrum) >verhindert das Bewegen der Domänen >es können nur wenige Nukleoside binden, die Polymerisation wird deutlich verlangsamt
155
Nucleosid Analogons
>Fehlen einer 3'OH-Gruppe -> dadurch die Fähigkeit, die Polymerisation anzuhalten
156
Anwendung der Inhibitoren
>eine Kombination der zwei Inhibitionsformen tötet das Virus effizienter
>man verwendet viele Inhibitoren (5), die alle an verschiedenen Stellen der Reversen Transkriptase ansetzen
>trotzdem werden viele Menschen bloß einer Monotherapie unterzogen, da eine Kombination von 5 Medikamenten sehr teuer (aber möglich!) wäre
>man müsste die Medikamente für den Rest des Lebens nehmen
>durch die Medikamente wird ebenfalls die Ansteckungsgefahr stark reduziert
>man müsste ein Medikament herstellen, das alle Inhibitoren enthält -> macht aber keiner, weil jeder Penner damit noch Geld machen will -> Fazit: Menschen sind scheiße.
157
Mängel der Inhibitoren
>das Virus kann leicht die Blut-Hirn-Schranke überqueren; man kann das Virus allerdings noch nicht im Gehirn kontrollieren
-> Demenz
158
Problem bei der Replikation eukaryotischer DNA
>es ist schwierig, die DNA-Enden vollständig zu replizieren, weil die Polymerasen ausschließlich in 5'-3'-Richtung arbeiten >nach Entfernung des RNA-Primers hätte der Folgestrang also ein unvollständiges 5'-Ende, sodass das Chromosom mit jeder Replikationsrunde kürzer werden würde
159
Telomere
>mehrere Hundert Tandemwiederholungen einer Sequenz aus 6 Nukleotiden
>einer der Stränge ist an seinem 3'-Ende G-reich und ein wenig länger als der andere
>beim Menschen lautet die Sequenz: AGGGTT (bis zu 10000 bp lang)
>Telomere bilden viele große, doppelsträngige Schleifen (T-Loop-Konformation)
>die Schleifen werden durch besondere telomerbindende Proteine (Shelterin Proteins) geschützt
160
ATM
>Serin-Proteinkinase ATM
>fungiert als Sensor von DNA-Schäden, vor allem von
Doppelstrangbrüchen
>bringt Signalkaskaden zur Produktion von DNA-Reparaturproteinen in Gang, zur Not auch Einleitung von Apoptose
>Telomere verkürzen sich bei jeder Zellteilung
>DDR=ATM-dependent DNA damage response
161
Funktionen der Telomere
>schützen die Chromosomenenden vor Rekombination, Fusion mit anderen Chromosomen und Abbau durch Nukleasen
>befähigen die Zelle, zwischen natürlichen Chromosomenenden und beschädigter DNA zu unterscheiden
>essentiell für die Replikation der Enden linearer DNA
162
Welche Struktur nehmen die
| Telomere an?
>Guanosin-Tetraplex (da G-reiche Sequenzen)
163
Telomerase
>fügt Telomere an die Chromosomenenden an
>enthält sowohl RNA-, als auch Proteinbestandteile
(Ribonukleoprotein ->KEIN ribosom da active site aus Protein besteht)
>die RNA Komponente ist ca. 150 Nukelotide lang und enthält eine CA-Wiederholungseinheit
>wirkt als zelleigene Reverse Transkriptase, die das aktive
Zentrum für eine RNA-abhängige DNA-Synthese zur Verfügung stellt
>anders als die Reversen Transkriptasen der Retroviren kopiert die Telomerase aber nur einen kleinen RNA-Abschnitt, den sie selbst in sich trägt
>die Synthese der Telomere erfordert das 3'-Ende eines
Chromosoms als Primer und läuft wie üblich in 5'-3'-Richtung
>nachdem das Enzym ein Exemplar der Wiederholungseinheit synthetisiert hat, nimmt es eine neue Position ein und erweitert das Telomer
>nach der Verlängerung des TG-Stranges durch die Telomerase, wird der komplementäre CA-Strang durch zelleigene DNAPolymerasen von einem RNA-Primer aus synthestisiert
>bei höheren Eukaryoten, deren Telomere viele Tausend Bp lang sind, wird das einzelsträngige Ende in eine T-Schleifen-Struktur eingebunden
>das einzelsträngige Ende entfaltet sich und paart mit dem
komplementären Strang im doppelsträngigen Teil des Telomers
>bei der Bildung der T-Schleife dringt der Einzelstrang des
Telomers mit seinem 3'-Ende in die ds DNA ein
>bei Säugetieren wird die DNA-Schleife von zwei Proteinen
namens TRF1 und TRF2 gebunden
>TRF2 fördert die Bildung des D-Loops -> diese
kommen durch die Insertion eines 3'- telomeren Überhangs in die Telomer-Wiederholungseinheit zustande -> Bildung eines Duplexes mit dem komplementären Strang
>Das Telomer End-binding Protein Pot 1 maskiert den 3'-
Überhang
164
Ist die Telomerase ein
| Ribozyme?
>nein, RNA dient als Template und übernimmt keine katalytische Funktion
165
spezielle Eigenschaften der
| Telomerase
>zwei Bestandteile: Telomerase Reverse Transkripatse (TERT)
Protein und Telomerase RNA
>Innere RNA dient als Template für die reverse Transkription durch TERT
>die Fähigkeit, entlang der DNA zu translozieren
166
die RT Domäne von TERT
>katalysiert die Anheftung von Nukleotiden
>3 Asp Reste in den RT (Reverse transkriptase) Motiven A und C von TERT sind wichtig für die Katalyse -> 2 Metallionen Mechanismus (ähnlich der DNA
Polymerase und HIV RT)
167
Beteiligung der TEN Domäne im
| Telomerase Mechanismus
>die TEN Domäne bindet an den DNA Primer das von dem 3'-Ende entfernt ist -> unterzieht sich
einer Verlängerung in der Reversen Transkriptase Domäne von TERT
>die Ten Domäne interagiert ebenfalls mit der RNA Untereinheit TR -> Diese WW sind entscheidend für die
Katalyse, aber tragen nur wenig zur Bindung bei,
welche hauptsächlich durch die RNA-bindende Domäne von TERT vollendet wird
168
Telomere bei der
| Krebsbehandlung
Inhalieren Telomerase-Aktivität (TERT-Dyskerin)
Quadruplex formende Liganden (Demaskierung des Überhangs)
Bsp: Braco-19: Synthese telomerer DNA-repeats inhibit--> telomere DNA schrumpft --> kann zur zellulären Reaktion auf DNA-Schäden führen
169
Dyskeratotis congenita
>Erbkrankheit, die sich an Haut und Schleimhäuten zeigt
>gestörte Funktion der Telomerase
>die RNA Komponente der Telomerase ist in autosomal
dominanter Dyskeratotis congenita mutiert
>Dyskerin interagiert mit der humanen RNA (TERC) durch ein Box (H/ACA Motiv
170
DNA Viren
>manche DNA-Viren haben telomer-ähnliche Wiederholungen an
| ihren Genomenden und benutzen diese, um ihr Genom in die Wirts-DNA zu integrieren
171
Ames-Test
>Bruce Ames
| >Testverfahren, um Mutagene zu identifizieren
172
Wie können Mutationen
| auftreten?
>Das WSBB Muster kann sich durch Keto-Enol verändern
->aus einem c-G Bp wird ein C-A Bp
>wird nicht bemerkt, wenn es nach der Replikation passiert
173
Oxidative
| Desaminierungsreaktionen
Cytosin --> Uracil
5-Methylcytosin --> Thymin
Adenin --> Hypoxanthin (paart mit Cytosin)
Guanin --> Xanthin
Thymin kann nicht oxidativ deaminiert werden, da es keine exozyklische Aminogruppe besitzt!
174
Salpetrige Säure als Mutagen
>reagiert mit Basen, die eine freie Aminogruppe haben
>oxidative Desaminierung von Adenin zu Hypoxanthin
>Hypoxanthin bildet mit Cytosin ein Bp anstatt mit Thymin
>Mutation von AT zu GC
175
Mutagene: reaktive
Sauerstoffderivate (zB
Hydroxylradikal)
>reagiert mit Guanin -> 8-Oxoguanin
| >8-Oxoguanin bildet häufig mit Adenin ein Basenpaar und nicht mit Cytosin
176
Mutagene: Desaminierung
>Adenin kann zu Hypoxanthin desaminiert werden
>Hypoxanthin bildet mit Cytosin ein Basenpaar und nicht mit
Thymin
>Guanin und Cytosin können ebenfalls desaminiert werden
177
Mutagene: Alkylierung
>elektrophile Zentren können von nucleophilen Komponenten wie zB dem N7-Atom von Guanin und Adenin angegriffen werden, sodass alkylierte Addukte entstehen
178
Derivatisierung von
| Interkalatoren
>manche Verbindungen werden erst durch Enzyme, die
normalerweise an der Entgiftung des Organismus mitwirken, in sehr wirksame Mutagene umgewandelt
>Aflatoxin B1 (Produkt einzelliger Pilze) wird durch ein
Cytochrom-P Enzym in ein hochreaktives Epoxid
umgewandelt
>das Epoxid reagiert dann mit dem N7-Atom im Guanosin,
wodurch ein mutagenes Addukt entsteht, das häufig zu
einer GC->TA-Transversion führt
179
Transversion / Transition
Transversion: Ersatz Purin durch Pyrimidin oder umgekehrt
Transition: Ersatz Purin durch Purin bzw. Pyrimidin durch Pyrimidin
180
Mutagene: UV-Licht
>verbindet benachbarte Pyrimidinreste in einem DNA-Strang kovalent
>ein solches Pyrimidindimer passt nicht in die Doppelhelix,
sodass Replikation und Genexpression zum Stillstand kommen, bis der Schaden behoben ist (zB Thymindimer)
181
direkte Reparatur: DNA-Photolyase (nur Bakterien und Schlangen)
>Beispiel für die photochemische Spaltung von Pyrimidindimeren
>das Enzym aus E coli ist ein Protein von 35 kD, das N5,N10-Methenyltetrahydrofolat und Flavinadenindinukleotid (FAD) als Cofaktoren gebunden hat
>fast alle Zellen besitzen ein photoreaktivierendes Enzym mit der Bezeichnung DNA-Photolyase
>heftet sich an den verformten Abschnitt der DNA und geht mithilfe eines Photons in einen angeregten Zustand über, der das Dimer in seine ursprüngliche Form spaltet
>der Reaktionsmechanismus umfasst die Bildung freier Radikale
>MTHFpolGlu wirkt als Lichtsammelantenne und absorbiert blaues Licht
>die Anregungsenergie wird auf FADH- übertragen und das angeregte Flavin gibt ein Elektron an das Pyrimidindimer ab, was zu einer Umordnung führt
182
direkte Reparatur: O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase
>durch alkylierende Agenzien bildet sich das modifizierte Nukleotid O6-Methylguanin, das einen mutagenen Schaden darstellt
>paart bei der Replikation nicht mit Cytosin, sondern mit Thymin und verursacht daher Mutationen, bei denen CG in AT umgewandelt wird
>für die direkte Reparatur des O6 Methylguanins sorgt die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (''Ada'') -> Protein, das die Übertragung der Methylgruppe vom O6-Methylguanin auf einen seiner eigenen Cys-Reste katalysiert
>streng genommen ist die Methyltransferase kein Enzym, denn sie wird durch eine einzige derartige Methylierungsreaktion dauerhaft methyliert und damit für diesen Reaktionsweg inaktiviert (Kofaktor: SAM-->Methylalkohol-SAM)
>aber: die methylierte Methyltransferase agiert als ein Transkriptionsaktivator für ihr eigenes Gen und für viele andere Gene von Reparaturenzymen
183
Mechanismus O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase
>an der C-terminalen Domäne: ein Cystein abstrahiert eine Alkylgruppe von einem O6-Alkylguanin
>N-terminale Domäne: ein Cystein in einem Zn(Cys)4 Cluster dealkyliert methylierte Phosphodiesterbindungen
>die methylierte Ada aktiviert die Synthese von Ada und anderen Reparaturenzymen ->bindet an ihren eigenen Promotor ->Ada ist auch ein Transkriptionsfaktor!
184
Nucleotidexzisionsreparatur (NER)
>Ausschneiden eines Pyrimidindimers
1) >ein Enzymkomplex (von den UvrABC-Genen codiert) entdeckt die von Pyrimidindimeren hervorgerufene Verzerrung
2) >ein spezifisches UvrABC-Enzym schneidet dann den beschädigten DNA-Strang an zwei Stellen, die 8 Nukleotide auf der 5'-Seite und 4 Nukleotide auf der 3'-Seite entfernt vom Dimer liegen
> das von dieser hochspezifischen Exinuclease herausgeschnittene Oligonucleotid aus 12 Basen diffundiert dann weg
>die DNA-Polymerase I tritt dann in die Lücke ein und führt dann die Reparatursynthese aus
>das 3'-Ende des gebrochenen Stranges dient als Primer, der unversehrte Komplementärstrang als Matrize 3) >schließlich werden das 3'-Ende des neu synthetisierten DNA-Stückes und der ursprüngliche Teil der DNA-Kette durch die DNA-Ligase verknüpft
185
Xeroderma Pigmentosum
>Fehler im NER Mechanismus
>seltene Erbkrankheit
>Hautzellen sind unfähig, UV-induzierte DNA Schäden zu reparieren
>sehr sensitiv gegen Sonnenlicht >2000x höheres Hautkrebsrisiko
>langlebige Neuronen->anfällig gegen oxidative Schäden
186
Cockayne Syndrom
>änhliche Symptome wie Xeroderma Pigmentosum, aber kein Hautkrebsrisiko
187
Basenexzisionsreparatur
>Ausschneiden modifizierter Basen (wie 3-Methyladenin) durch das Enzym AlkaA aus E coli
>wenn das Enzym an die geschädigte DNA bindet, springt die betroffene Base aus der Doppelhelix in das aktive Zentrum des Enzyms
>anschließend wirkt das Enzym als Glykosylase: es spaltet die glykosidische Bindung und setzt so die geschädigte Base frei
>das DNA-Rückgrat bleibt also intakt, es fehlt nun eine Base
>eine solche Lücke heißt AP-Stelle
>eine A-Endonuclease erkennt den Defekt und spaltet das Rückgrat neben der Fehlstelle
>eine Desoxyribose-Phosphodiesterase schneidet die verbleibende Desoxyribosephosphateinheit aus
>die DNA-Pol I fügt nach Anweisung der im unbeschädigten Komplementärstrang ein korrektes Nukleotid ein
>am Ende wird der reparierte Strang durch die DNA-Ligase geschlossen
188
Warum enthält DNA Thymin statt Uracil?
>Cytosin in der DNA wird häufig spontan zu Uracil desaminiert ->potentiell mutagen
>Uracil-DNA-Glykosylase (homolog zu AlkA) erkennt Uracil als fremdes Element und hydrolisiert die glykosidische Bindung zwischen den Uracil- und Desokyriboseeinheiten, greift aber thyminhaltige Nukelotide nicht an
>die so entstehende AP-Stelle wird durch den Einbau von Cytosin repariert
>Methylgruppe von Thymian hilft bei Unterscheidung von Thymian und deaminierten Cytosin (--> mit Uracil keine Unterscheidung möglich)
189
Mismatch-Reparatursystem
>besteht aus mindestens zwei Proteinen, von denen eine die Fehlpaarung erkennt und das andere die Exonuclease mobilisiert, die den neu synthetisierten DNA-Strang in der Nähe der Fehlerquelle schneidet, um eine Reparatur zu ermöglichen, template sträng ist durch Methylierung markiert
>diese Proteine bezeichnet man bei E coli als MutS ud MutL, die Endonuclease als MutH
>MutL und MutS bildet einen Komplex, wo die Basen fehlgepaart sind (Ausnahme: C-C)
>die DNA wird durch den Komplex gezogen, bis eine hemimethylierte GATC Sequenz mit gebundenem MutH erreicht wird
>MutH schneidet den unmethylierten Strang auf der 5'-Seite des G in GATC
190
Mut S
>die Topologie des MutS Proteins erinnert a die Topoisomerase II
>in Topo II wird ebenfalls eine dsDNA ''durchgezogen'', allerdings durch einen anderen dsDNA Strang oder ein anderes Segment des gleiches Stranges
191
Lynch-Syndrom
>HNPCC (heredetary nonpolyposis colorectal cancer) >Mutationen in hMSH2 und hMLH1 ->diese Gene codieren die menschlichen Gegenstücke zu MutS und MutL aus E coli
>Mutationen in hMSH2 und hMLH1 führen zur Anhäufung von Mutationen im gesamten Genom
>schließlich werden auch Gene in Mitleidenschaft gezogen, welche die Zellproliferaton kontrollieren, was zum Ausbruch von Krebs führt
192
kann Thymin oxidativ desaminiert werden?
>nein, weil Thymin keine exocyclische Aminogruppe hat
193
Reparaturmechanismen:
ԑ-Untereinheit der
DNA-Polymerase III von E coli
> fungiert als 3'-5'-Exonuclease
>wenn eine falsche Base eingebaut wird, verlangsamt sich die DNA-Synthese aufgrund der Schwierigkeiten, die auftreten, wenn ein Nicht-Watson-Crick-Paar durch die Polymerase gefädelt wird
>darüber hinaus ist die fehlgepaarte Base nur schwach gebunden und daher an ihrer Position beweglich
>durch die Verzögerung besteht genügend Zeit, damit sich der neu synthetisierte Strang aus dem aktiven Zentrum der Polymerase hinaus in das aktive Zentrum der Exonuklease hinein bewegt
>dort wird die DNA abgebaut, ein Nucleotid nach dem anderen, bis sich der DNA-Strang zurück in das aktive Zentrum der Polymerase bewegt und die Synthese fortgesetzt wird
194
Holliday Strukturen
>Zwischenstufen, die aus vier Polynukleotidsträngen bestehen und eine kreuzförmige Struktur besitzen
>Rekombinasen binden an diese Strukturen und lösen sie durch Bildung von zwei getrennten DNA-Doppelsträngen auf
>vier Moleküle des Enzyms und zwei DNA-Moleküle lagern sich zu einer Rekombinationssynapse zusammen
>die eigentliche Reaktion wird mit der Spaltung je eines Stranges aus jedem Doppelstrang eingeleitet
>die 5'-OH Gruppe der gespaltenen Stränge bleibt jeweils frei, die 3'-Phosphatgruppe verbindet sich mit einem ganz
bestimmten Tyrosinrest in der Rekombinase
>die freien 5'-Enden wandern in den anderen Doppelstrang an der Synpase ein und greifen die DNA-Tyrosin-Einheiten an, wobei neue Phosphodiesterbindugnen gebildet und die Tyrosinreste freigesetzt werden ->führen zur Bildung der Holliday Struktur
>das Gebilde kann dann durch Isomerisierung eine Struktur
bilden, in der sich die Polynukleotidketten in der Mitte neu
orientieren
>nachdem das Zwischenprodukt diese Form angenommen hat, wiederholen sich die Spaltung der Stränge und die Bildung der Phosphodiesterbindungen
>das Endergebnis ist eine Synapse mit den beiden
rekombinierten Doppelsträngen
>durch Dissoziation dieses Komplexes entstehen die endgültigen rekombinierten Produkte
195
Recombination repair
>fast jede Replikationsgabel trifft auf eine Position, wo die DNASchädigung nicht repariert wurde
>kann nicht durch die DNA Pol III passiert werden
>führt zu einem Single-Strand-Break
>trifft DNA Pol III auf einen Single-Strand-Break ->Double-Strand-Break
196
DNA Rekombination: 3
| Kategorien
1) Homologe genetische Rekombination -> genetischer
Austausch zwischen zwei DNA-Molekülen mit nahezu
identischen Sequenzen
2) Sequenz-spezifische Rekombination -> Austausch nur an einer
spezifischen DNA-Sequenz
3)DNA-Transposition -> ''jumping genes'' (Transposons)
197
Reparatur von
Doppelstrangbrüchen durch
homologe genetische
Rekombination
>beide DNADoppelstränge haben eine sehr ähnliche Sequenz
>das Doppelstrang-Ende wird durch eine Exonuclease hydrolisiert (die Exonuclease entfernt ein Nucleotid nach dem anderen vom Ende des Stranges her: hier ist das Strangende das 3'-Ende und das 5'-Ende)
>die Exonuclease entfernt schneller Nukleotide vom 5'-Ende als vom 3'-Ende ->so entstehen 3'-Überhänge >wegen der ähnlichen Sequenz kann der 3'-Überhang in das doppelsträngige, intakte DNA-Molekül eintreten >kann einen der Stränge ersetzen
>das eingedrungene 3'-Ende wird durch DNA-Pol in Verbindung mit branch migration verlängert
>es entsteht ein DNA-Molekül mit 2 Crossover Stellen (Holliday Strukturen)
>schließlich müssen die Holliday Strukturen gespalten werden (durch besondere Nucleasen) -> Entstehung von zwei Produkten - beide haben wieder intakte DNA
198
branch migration
>paart ein Matrizenstrang mit 2 verschiedenen Komplementärsträngen, entsteht an der Stelle, wo die 3 Stränge aufeinander treffen, eine Verzweigung
>dieser Knotenpunkt wandert, wenn ein Basenpaar in einem der beiden Komplementärstränge getrennt und durch eine Paarung mit dem anderen ersetzt wird
>ohne steuerndes Enzym kann dieser Vorgang die Verzweigungsstelle spontan in beide Richtungen verschieben
>die spontane branch migration kommt aber dann zum Stillstand, sobald in einem der ansonsten komplementären Stränge eine Sequenz auftaucht, die nicht mit der des anderen übereinstimmt
199
RecBCD Komplex
>3 Enzyme recB, recC, recD bilden einen Komplex, der an Doppelstrangbrüche bindet
>Helikasefunktion und Nucleaseaktivität
>entwindet ATP-gekoppelt die dsDNA und baut diese ab
200
Mechanismus RecBCD Komplex
>RecB und RecD- Heilkase Aktivitäten entwinden die DNA,wobei das 3'-Ende stärker abgebaut wird
>die Aktivität des Enzyms ändert sich, wenn es mit der als chi bezeichneten Sequenz (5')GCTGGTGG in WW tritt, die fest an die RecC UE bindet
>nun wird der Abbau des Stranges mit einem 3'-Ende stark eingeschränkt, der Strang mit dem 5'-Ende wird weiterhin abgebaut
>am 3'-Ende entsteht ein einzelsträngiger Bereich
201
Wieviele chi-Sequenzen im E coli Chromosom?
>1009 Chi-Sequenzen
202
Welche beiden Funktionen hat RecBCD?
>Exonukleaseaktivität
| >Helikaseaktivität
203
Welche Funktion hat RecA?
>Katalyse der branch migration mithilfe der durch ATP
gewonnenen Energie
>seine aktive Form ist ein geordnetes, helikales Filament aus bis zu 1000 RecA-Monomeren, die sich an der DNA kooperativ zusammenlagern (6,2 Monomere pro Windung)
>katalysiert das Ersetzen des komplementären Stranges durch den 3'-Überhang
204
Wieviele Monomere pro
| Windung hat RecA?
>6,2 Monomere pro Windung
205
RecA unterstützter
| Strangsaustausch in vitro
```
>RecA kann sowohl 3,
als auch 4 Stränge händeln
>bei 4 Strängen:
Holliday Struktur
>Strangaustausch: 6 bp/s
>RecA -> ATP Hydrolyse
>RecA-> molekulare Maschine
```
206
Konformation der Holliday-
| Junctions
>perfekte B-Konformation
207
Mechanismus für den RecA-vermittelten Strangaustausch
1)Das RecA Protein bildet mit dem DNA-Einzelstrang ein Filament
2)In den Komplexen wird ein homologer Doppelstrang aufgenommen
3)durch Rotation verschiebt sich der dreisträngige Bereich von links nach rechts und einer der Stränge aus dem Doppelstrang wird auf den ursprünglich im Filament gebundenen Einzelstrang übertragen; der andere Strang wird verdrängt, und innerhalb des Filaments bildet sich ein neuer Doppelstrang aus
4)durch weitere Rotation löst sich der verdrängte Strang vollständig
>bei dem Modell bewirkt die Hydrolyse von ATP, dass die beiden DNA-Moleküle umeinander rotieren und der Strangaustausch von links nach rechts abläuft
208
Welche Proteine sind neben RecA noch involviert?
>RecF, RecO, RecR
209
Wer ist für den Doppelstrangbruch jedoch letztendlich verantwortlich?
>RecBCD, RecA
210
Wie werden die Holliday Junctions wieder gelöst?
>durch die Resolvase
>nachdem die Holliday Strukturen gelöst worden sind, muss die Replikation weiterlaufen
>wir haben jedoch keinen Primer-> primer-unabhängige Replikation
211
wie wird die primer-unabhängige Replikation bewerkstelligt?
>Restart Primosome
| >7 Proteine: Primase A, B, C, DnaB, C, G, T, DNA Pol II
212
>DNA Pol II
>restart Polymerase
| >relativ fehlerlastig, daher übernimmt nach ca. 7 Nukleotiden DNA Pol III
213
Welchem Enzym ist die Struktur und Funktion der Resolvase homolog?
>Rekombinase
214
Rekombination Mechanismus
>s. Topoisomerase Mechanismus
>4 Resolvase Moleküle (mit gebundener DNA) treffen aufeinander
>im aktiven Zentrum befindet sich ein Tyrosin-Molekül
>Tyr greift die Phosphodiesterbindung an
>Tyrosin-Ester-Bindung Intermediat -> sehr selten
215
konservierter Mechanismus: kovalente Phosphotyrosinbindung zwischen Protein und DNA
>Resolvase
>Rekombinase
>Topoisomerase
216
LexA
>in der DNA von E coli befindet sich ein Operator (SOS-Box)
>wird von Lex A gebunden
>Lex A ist ein Repressor
> der Komplex aus Lex A und dem Operator der SOS Box regulieren die Expression der Gene
>43 Gene haben mit DNA Reparatur zu tun (zB UvrA, UvrB etc)
>alle Promotoren dieser Proteine werden durch LexA unterdrückt
>somit können die ribosomalen Proteine nicht exprimiert werden -> keine Expression der Reparaturgene, solange LexA an den Operator gebunden ist
>wenn die DNA dann beschädigt wird, wird RecA die ss Region und die benachbarten ds Region abdecken >zusätzliche Aktivität von RecA: verursacht Autoproteolyse von LexA zwischen den resten Arg84 und Gly85 (LexA wird in 2 Hälften gespalten und kann nicht mehr an den Operator binden -> Gene können wieder exprimiert werden)
217
Pol V
> wenn Pol III von der blockierten Replikationsgabel fällt, wird diese durch eine ''bypass-DNA-Polymerase'' ersetzt
>das Protein UmuD wird in einem SOS-regulierten Prozess zu einer kürzeren Form namens UmuD' gespalten und diese bildet mit dem Protein UmuC einen Komplex, der die DNA Pol V darstellt (Heterotrimer UmuD'2C)
>RecA induziert die Autoproteolye von UmuD' (24 N-terminale Reste) -> Pol V
>Pol IV und V haben keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität und sind sehr langsam; nach ein paar (7) Nukleotiden werden sie durch Pol III ersetzt
218
Was benötigt die DNA-Pol V alles?
>clamp (beta 2)
>clamp loader (gamma-Komplex)
>SSB
>RecA Filament + ssDNA (durch DnaB hergestellt)
219
Wie wird Pol V auch genannt?
>Pol V Mutasom (wegen der hohe Fehlerrate)
220
Welche Fehler treten durch Pol V auf?
>fügt G gegenüber Thymin Dimeren ein
| >fügt sehr selten Pyrimidine ein
221
Wann wird Pol IV benötigt?
>frame shift mutations
222
```
Bypass Polymerase
(Y-Typ Polymerase)
```
>haben zusätzlich eine ''kleine Finger Domäne''
>die anderen Domänen sind kleiner als in Pol I
>keine Überprüfung, ob WC Basenpaarung
>checkt nicht die Distanz zwischen den Nukelotiden im minor groove (sonst Arg und Glu SK)
>ist mit jedem Nukleotid zufrieden
>DNA im aktiven Zentrum ist B und nicht A-Konformation!
223
SOS im Menschen?
>RecA wird durch RAD52 ersetzt (homolog)
>wichtig: BRCA1 und BRCA 2 (Breast Cancer)
>viele Mutationen werden in den BRCA Genen vererbt
224
Aufgaben der RNA-Polymerasen
>suchen die DNA nach Initiationsstellen (Promotoren) ab >entwinden ein kurzes Stück doppelhelikaler DNA, um eine Matrize aus ssDNA herzustellen
>suchen das richtige Ribonukleosidtriphosphat aus und katalysieren die Bildung einer Phosphodiesterbindung >RNA Pol ist vollständig prozessiv
>reagieren auf Terminationssignale
>treten mit Aktivator- und Repressorproteinen in WW -> Regulation
225
durch RNA Polymerase katalysierte Reaktion
(RNA)n residues + NTP ➞ (RNA)n+1 residues + Ppi
226
wieviele RNA Polymerasen in Prokaryoten?
>eine universelle RNA Polymerase
227
wieviele RNA Polymerasen in Eukaryoten?
>3 spezialisierte RNA Polymerasen (Pol I, II, III)
228
RNA Pol I
>transkribiert Gene für die 18S, 5.8S, 28S rRNA
229
RNA Pol III
>transkribiert Gene für die 5S rRNA und tRNAs
230
RNA Pol II
>synthetisiert prä-mRNAs und kleine nukleare RNAs
231
RNA Pol erfordert
>dsDNA Template (ssDNA ist auch mgl., aber keine RNA) >Ribonukleosidtriphosphate: ATP, GTP, UTP, CTP
>Mg2+ oder Mn2+
232
Gemeinsamkeiten RNA Synthese und DNA Synthese
>Richtung der Synthese in 5'->3'
>das 3'OH der wachsenden Kette greift ein α- Phosphat einer NTP an
>die Synthese wird durch die Hydrolyse von PPi vorangetrieben
233
RNA Synthese: Unterschiede zur DNA Synthese
>die RNA Polymerase erfordert keinen Primer >Korrekturlesen durch ''Backtracking'': Bei der Insertion eines falschen Nukleotids wird kein WC Bp gebildet
>RNA Pol bewegt sich rückwärts -> Hydrolyse des falschen Nukleotids und des vorherigen Nukleotids
234
RNA Poylmerase von E coli
>Holoenzym: α2ββ‘ωσ
| >Core Enzym: α2ββ‘ω - σ-Untereinheit nur bei der Initiation
235
Rolle der Mg2+ Ionen in der RNA-Pol
> ein Ion bleibt fest an das Enzym gebunden, das andere tritt mit dem Nukleosidtriphosphat hinzu und verlässt das Enzym mit dem Pyrophosphat
>an der Bindung der Metallionen sind drei konservierte Aspartat-Reste des Enzyms beteiligt
236
RNA Transkript
>die Sequenz des DNA-Matrizenstranges is zum RNA-Transkript komplementär
>im Gegensatz dazu besitzt der codierende DNA-Strang dieselbe Sequenz wie das RNA-Transkript (außer T statt U) >RNA Synthese kann de novo ohne Primer beginnen
>neu synthetisierte RNA Ketten haben eine pppG oder eine pppA Kappe am 5'-Ende
237
Wie kann verhindert werden, dass die beiden Stränge ineinander stoßen?
>zwei RNA Polymerasen können nie zusammenstoßen, weil zu viel Spannung zwischen ihnen liegt
238
Initiation
>das Enzym muss Promotoren finden
| >bei E coli: ca. 2000 Promotoren
239
warum nur 2000 Promotoren bei mehr Genen?
>mehrere Gene können von nur einem Promotor reguliert werden
240
wo sind die Promotoren lokalisiert?
>die Promotorsequenzen sind auf dem nichtcodierenden Strang
241
Promotoren in E coli
>Pribnow-Box (-10 Nu): TATAAT
>-35 region: TTGGACA
>Heat shock, nitrogen starvation
242
Promotoren in Eukaryoten
>TATA-Box (-25 Nu): TATAAA
| >CAAT box (-75): GGNCAATCT
243
Sigma Faktor
>hohe Affinität zur Pribnow Box und der -35 Sequenz des Promotors
>auch ohne Sigma Faktor kann die RNA-Polymerase an die DNA binden, es kommt jedoch nicht zu Transkription
>der codierende Strang nimmt nicht einmal an dieser Reaktion teil
>erstes Nukleotid: GTP oder ATP
>bei Abweichungen in der Consensus Sequenz kann der Sigma-Faktor nicht binden -> wesentlich weniger Replikation
244
Wie konnte man die Promotoren identifizieren?
>footprinting
245
Wie arbeitet der Sigma Faktor?
>Sigma Faktor hat charakteristische Helix, die aus dem Protein herausschaut -> diese Helix interagiert mit der -10 Region
>der Sigma Faktor bewegt sich auf der DNA entlang und sucht nach Promotoren
>erst, wenn die Helix in eine Box der 5'-TATAAT -Sequenz passt, kommt die RNA Polymerase dazu und startet die Reaktion
>Kinetik: 10^10 M/s -> sehr schnell!
246
Welche Sigma-Faktoren gibt es
| in E coli?
>Sigma 70: erkennt Standard-Promotoren
>Sigma 32: von Hitzeschockgenen
>Sigma 54: erkennt die Promotoren von Stickstoffmangel-Genen
247
Enhancer Elemente
>können sehr weit weg vom Transkriptionsstartpunkt sein
>wie ist das möglich?
-> die DNA windet sich um einen großen Komplex (Pre-Initiation-Komplex)
>Enhancer Box wird von spezifischen Transkriptionsfaktoren erkannt
248
Haben Eukaryoten einen Sigma-
| Faktor?
>nein! -> über TATA Box
249
Mechanismus RNA Polymerase
>RNA Pol sucht nach Promotoren in der dsDNA
>ein DNA -Segment muss entwunden werden, bevor die Synthese beginnen kann
>das Entwinden erhöht das negative supercoiling der DNA: Überwindung vor der Transkriptionsstelle und Unterwindung dahinter
>RNA Pol entwindet genau 17 bp
>das DNA-RNA Hybrid wird ein Hybrid im aktiven Zentrum der RNA Pol bilden (->A-Konformation)
>wenn die DNA zwei oder mehr Gene enthält, die in
verschiedene Richtungen gelesen werden, kommt es zur
Torsionsspannung -> verhindert, dass zwei DNA Polymerasen kollidieren
>wenn man Topoisomerase II hinzufügt, wird die Transkription verstärkt -> Topo II hat Einfluss auf RNA Pol
250
Mechanismus RNA Polymerase
| Struktur der RNA Pol
>3 Asp Reste und 2 Mg 2+ Ionen im aktiven Zentrum der RNA Pol (ähnlich der DNA-Pol und der DNA Primase -> konvergente Evolution)
>das 3'-OH der wachsenden RNA Kette greift das alpha Phosphat des NTP an
251
Elongation
>in 5'-3'-Richtung
>RNA-Pol: 100 % Prozessivität; fällt niemals ab
>Elongation beginnt, nachdem die erste Phosphodiesterbindung geknüpft wurde
>kein Sigma Faktor bei Eukaryoten!
252
Wieviel mal langsamer erfolgt die RNA-Synthese (im Vergleich zur DNA Synthese)?
>30-40 mal
253
Ruder
>hat die Funktion einer DNA-RNA-Helikase -> sorgt dafür, dass das RNA-DNA-Hybrid wieder entwunden wird
254
Wie lang ist die Doppelhelix, die RNA und DNA kurzzeitig ausbilden?
>ca. 8 Nukleotide
255
Termination der Transkription: Möglichkeit 1
| Rho-unabhängige Termination
> die Bildung von Phosphodiesterbindungen wird gestoppt -> eine Struktur in der DNA, welche CG- reich und palindromisch ist -> Bildung einer Hairpin Struktur, die von einer AT-reichen Region gefolgt ist ->auf dem RNA-Strang: Bildung einer Hairpin Struktur, die von Poly-U gefolgt ist >wenn die RNA-Polymerase hier weiterlaufen sollte, bräuchte man Deoxyadenin auf dem DNA-Template Strang >das DNA/RNA-Hybrid ist instabil nach einer Hairpin Struktur -> dissoziiert spontan ab -> das Signal der Termination ist also in der RNA Struktur selbst (das Produkt definiert die Termination)
256
Termination der Transkription: Möglichkeit 2 (Rho-abhängige Termination)
>das Rho Protein besteht aus einem hexameren Komplex mit einem Tunnel in der Mitte >die RNA wird durch den Tunnel gezogen >das Rho Protein folgt der RNA-Polymerase und zieht den RNA Strang aus der RNA-Polymerase (RNA-DNA-Helikasefunktion)
>Rho Protein ist ein molekularer Motor
>folgt den Transkriptionsblasen, die keine Hairpin Struktur haben
>72 nt ssRNA werden in solch einer Weise gebunden, dass sie durch das Protein gezogen wird
257
Vergleich: Rho Protein - ATPase
>die Rolle der gamma-UE in der ATPase wird im Rho-Protein von dem neu synthetisierten RNA Strang übernommen
>die gamma UE sitzt in dem Tunnel und rotiert
>Rho hydrolisiert ATP in Anwesenheit von ssRNA,
aber nicht DNA oder dsRNA
258
Wo bindet Rho hauptsächlich?
>in C-reichen, G-armen Sequenzen
259
Was haben alle
Terminationsfaktoren
gemeinsam?
>liegen alle auf dem neu synthetisierten RNA-Strang
260
Rifamycin B
>inhibiert die Transkription, in dem es ausschließlich an die
prokaryotische RNA-Polymerase bindet
>nicht an die eukaryotische !!! (sonst könnte man es nicht als Antibiotikum verwenden)
>gegen Tuberkulose
>verhindert nicht die Bindung der RNA Pol an die DNA (der Sigma Faktor kann durchaus binden und die RNA Pol an die DNA bringen!)
>eine Phosphodiesterbrücke kann gebildet werden, aber der Strang kann nicht verlängert werden
>blockiert den Kanal für das DNA/RNA-Hybrid
>die inaktivierte RNA Pol bleibt am Promotor gebunden und blockiert diesen
>nicht-inhibierte RNA Pol Moleküle können nicht binden
261
alpha-Amanitin
>grüner Knollenblätterpilz (gehört zu den Amatoxinen)
>bicyclisches Octapeptid, das sehr fest (10 nM) an die RNA Pol II bindet
>bindet weniger stark an RNA Pol III, aber nicht an RNA Pol I -> Möglichkeit, zwischen den Pols experimentell zu unterscheiden
>alpha-Amanitin bindet nicht direkt im aktiven Zentrum, sondern im Tunnel für die rNTP's -> Nukleotide kommen nicht mehr rein ->inhibiert also Elongation
262
Bacteriophage lambda
>wenn ein Phage in eine Bakterienzelle von E coli eintritt:
- > lytischer Weg: der Phage wird mehrmals repliziert in der E coli Zelle (Zelle stirbt--> neue Phagen werden freigesetzt)
- >lysogener Weg: das Phagengenom kann in das E coli DNA Chromosom integriert werden und so bleiben, bis die Zelle aktiviert wird und der lytische Zyklus erfolgt
263
Integration und Ausschneiden
der DNA des Bakteriophagen
lambda
>wenn die Phagen-DNA in das E coli Chromosom eintritt, gibt es bestimmte Sequenzen am Cross-Over-Punkt: att-Sequenzen
>attP Sequenzen auf der Phagen-DNA und attB Sequenzen auf der bakteriellen DNA -> sind einander ähnlich
>Rekombinationsmechanismus
>Integration des Phagen: Integrase (codiert vom Phagen lambda) und IHF: Integration Host Factor (vom Bakterium codiert)
>Ausschneiden des Phagen: lambda Integrase, IHF, FIS + XIS
>lambda Cloning: man bringt ein gen auf ein Plasmid und bringt es über den Integrationsmachanismus in das E coli und exprimiert es; Nachteil: man braucht attachement sites
264
Nach welchem Mechanismus
| funktioniert die Integration?
>über Holliday Junctions
-> auflösen durch Resolvase (über kovalente Bindung eines Tyrosinrestes und einer Phosphogruppe der DNA: Tyrosin-Sauerstoff-Phosphor-Bindung)
>Rekombination ist sehr sequenzspezifisch
265
Welche beiden Repressoren
| gibt es für den lambda Phagen?
>Cro Repressor
>lambda Repressor
>verlaufen in gegensätzliche Richtungen (Antagonisten)
>welcher der beiden angeschaltet ist, wird durch
Operatorsequenzen entschieden
266
Was ist ein Operator?
>Eine DNA-Sequenz, die von einem Repressor gebunden wird
267
OR Operator
>in drei Boxen: OR1, OR2, OR3
>OR1 und teilweise OR2 überlappt mit der Promotorsequenz für den Cro Repressor
>OR3 und teilweise OR2 überlappt mit der Promotorsequenz des Repressor Promotors
>wenn der repressor aktiv ist -> lysogener Weg
>wenn Cro aktiv ist -> lytischer Weg
>der lambda repressor bindet mit hoher Affinität zu OR1 (und mit etwas weniger an OR2) -> Cro kann nicht transkribiert werden, weil die RNA Pol nicht an OR1 binden kann
>die RNA Pol kann an OR3 binden
>der Repressor ist ebenso ein Aktivator seiner eigenen
Transkription !
268
Was passiert, wenn man das
| Bakterium UV-Licht aussetzt?
>der Repressor kann nicht mehr mit hoher Affinität an OR1 oder OR2 binden
>die RNA Pol kann binden und das Cro Gen kann traskribiert werden
>Cro blockert OR3 und die RNA Pol kann nicht an den Promotor des Repressors binden -> der Repressor kann nicht mehr gebildet werden
>das Bakterium tritt den lytischen Weg an
-> Zwischenspiel der 3 OR Boxen und den beiden Repressoren, die zwischen dem lytischen und dem lysogenen Weg entscheiden
269
Basensequenz in den OR's?
>teilweise palindromisch
270
RecA (bzgl. Lamba Repressor)
>die autoproteolytische Spaltung des lambda Repressors wird durch RecA katalysiert (genauso wie bei LexA)
>wenn der lambda Repressor zwischen der N- und der C-Domäne gespalten ist, kann dieser nicht länger stark an OR1 und OR2 binden -> Transkription des Cro-Gens
271
Struktur des Cro Repressors
>Helix - Turn - Helix
>bindet an den major groove
>der Cro Repressor dimerisiert über WW zwischen zwei antiparallelen beta-Sheets
>die zwei Erkennungshelices sind 34 Angstroem auseinander
272
Struktur des lambda repressors
>ähnliche Struktur zu dem Cro Repressor: auch Helix - Turn - Helix Motiv; dimerisiert durch alpha-Helices
>ebenfalls zwei Erkennungshelices, 34 Angstroem auseinander
->major groove ist aber ca. 35 - 36 Angstroem auseinander ->
Lösung? -> die DNA muss sich ein bisschen biegen
273
spezifische Erkennung
>Guanin wird spezifisch von Arginin erkannt über 2 WSBB
>Adenin wird spezifisch von Glutamin erkannt
>auch: WW des zucker-Phosphat-Rückgrats der DNA und dem Polypeptid-Rückgrat der Repressor-Proteine durch WSB
274
Tryptophan Repressor
>ebenfalls ein Helix - Turn - Helix Motiv
>Abstand zwischen den Erkennungshelices jedoch geringer als 34 Angstroem
>ebenfalls Bildung eines Dimers
>man braucht einen Co-Repressor, damit der Repressor an den major groove binden kann
275
lac repressor
>Glucose ist die Hauptenergiequelle für E coli
>wenn zu wenig Glucose da ist, verwendet E coli Lactose
>die beta-Galactosidase hydrolisiert Lactose zu Galactose und Glucose
276
Xgal
>Derivat der Galactose
>führt zur Bildung von dem blauen Indigo 5,5'-dibromo-
4,4'dichloro indigo
277
(lac) Operon Modell
>Jacob und Monod
>3 Enzyme (beta-Galactosidase (lacZ-Gen), Galactosid Permease (lacY-Gen), Thiogalactosid Transacetylase (lacA-Gen)), die von einer Operator-Box kontrolliet werden
278
Prokaryotische Operons
>versch. Gene werden in eine einzelne, polycystronische mRNA transkribiert
>in der Abwesenheit von Lactose werden die Gene des Operons unterdrückt
>umgekehrte Reaktion des Trp-Repressors (bindet nur, wenn Co-Repressor gebunden ist)
279
lac repressor
>auch Helix - Turn - Helix Motiv
>drei Operator-Boxen: O1, O2, O3
>der lac repressor bindet am stärksten an den Operator O1
(direkt an den Startpunkt der Transkription für die Gene des Operons)
>das Lac I Gen (Regulator gen) hat seinen eigenen Promotor (PI) -> wird unabhängig von den anderen Genen des lac-Operons transkribiert
>die Pseudooperatoren O2 (upstream) und O3 (downstream)
280
Effektormolekül
>wenn ein Effektormolekül an den lac repressor bindet,
dissoziiert dieser von dem Operator ab -> Enzyme können
transkribiert werden -> polycystronische mRNA kann
synthetisiert werden
281
WW des Repressors und des
| Operators
> 3 Operatoren: 02-> ca. 9 Nukleotide downstream von O1 in dem Gen für die Galactosidase; O3 ist ca 400 Nukleotide upstream im lacI Gen (Repressor-Gen)
>die Affinität des Repressors ist am höchsten für O1 -> wenn eine Mutation im O1 vorliegt, dann ist die Repression um einen Faktor von ca 1300 verringert
>wenn eine Mutation nur in O2 oder O3 vorliegt tritt eine
Verringerung der Repression um den Faktor 2 auf (daher auch nur sekundäre Operatoren -> nicht so wichtig)
>bei Mutation in O2 und O3 gleichzeitig -> Verringerung der Repression um ca. den Faktor 70
-> die Operatoren arbeiten also zusammen
282
Struktur des lac Repressors
>Tetramer
>bindet an 2 Operatorstellen
>Bindungsmotiv: Helix - Turn - Helix
283
Bindung an die DNA
>an den major groove mit dem lac Repressor Kopfstück
>das Helix - Turn - Helix Motiv interagiert mit dem major groove der Operator DNA
>die Bindedomäne (am C-Terminus des Kopfstücks) bindet an den Minor groove (relativ unspezifisch -> so wird noch mehr Bindungsenergie generiert, was zu mehr Stabilität des Komplexes führt)
>das isolierte Kopfstück bildet ein (realtiv instabildes) Dimer; der komplette lac Repressor ist ein Tetramer
>Tetramer entsteht durch die helikalen WW am CTerminus
aus den beiden Dimeren
284
Was passiert, wenn Lactose
| vorhanden ist?
>in dem Monomer des lac Repressors gibt es eine Bindungsstelle in der Core Domäne für Allolactose
>Allolactose ist ein Induktor
>es gibt immer ein basales Level an Transkription, sodass
Galactosid Permease exprimiert wird
>wenn Lactose hinzukommt, kann es durch diese paar Galactosid Permease Moleküle in die Bakterienzelle eintreten
>in der Zelle wird Lactose durch die beta-Galactosidase zu
Allolactose isomerisiert (Nebenprodukt von Umwandlung zu Glucose und Galactose --> Gleichgewicht und Enzym unterscheidet nicht so genau wie es verknüpft)
>Allolactose ist beta-1,6 verknüpft, statt beta-1,4 (wie in Lactose)
>Allolactose bindet an die Core Domäne des lac-Repressors
-> das basale Level an Transkription ist also essentiell für die Reaktion
>das Binden der Allolactose führt zur Dissoziation des lac
Repressors von der Operator DNA durch konformationelle
Änderung (durch die konformationelle Änderung wird die
Struktur sehr flexibel -> Affinität zur DNA verringert sich)
>dann können die lac Operon Enzyme transkribiert werden
285
IPTG
>Isopropylthiogalactosid
>bindet auch an die Allolactose Bindestelle und induziert die Dissoziation des lac Repressors von dem Operator -> künstlicher Induktor
>wird nicht von Galactosidase abgebaut
286
Wieviel IPTG Bindestellen
| gibt es?
>eine pro Dimer -> zwei für das ganze Tetramer
287
Was passiert, wenn Repressor
und Induktor gleichzeitig
vorhanden sind?
>der Repressor kann nicht am Operator binden und
die lac mRNA wird synthetisiert und die
Gene werden exprimiert
288
wie wird reguliert, dass nur
keine Lactose als Energiequelle
verwendet wird, wenn Glucose
vorhanden ist?
> dies wäre Energieverschwendung
>positive Regulation des lac Operons (katabolische Repression)
>CAP (katabolisches Aktivator Protein); auch: cAMP Rezeptor Protein (CRP)
>wenn Glucose vorhanden ist -> geringes cAMP Level
->keine Bindung an CAP bzw nicht ausreichend
>CAP ist ein Dimer und bindet an bestimmten Stellen an die DNA und führt zu einer Verformung der B-Helix -> führt zu einer Krümmung von 90° ->bessere Interaktion mit Transkriptionsfaktoren
>CAP hat ebenfalls eine Bindestelle für die RNA Pol und cAMP
> Binden an die DNA führt zu einem Helix - Turn - Helix Motiv
289
cAMP
>second messenger
>cAMP und Glucose sind Gegenspieler
>Sensor für das Glucoselevel in der Bakterienzelle (!)
>wenn die cAMP Konz. hoch ist, bindet es an CAP an einer Stelle, die 61 Nukleotide upstream vom Transkriptionsstart ist (Beispiel für Protein - Protein WW)
-> Aktivator der Transkription
290
Regulation durch CAP
> wenn keine Glucose vorhanden ist, bindet CAP an eine Stelle nahe des lac Promotors -> die Transkription wird um einen Faktor von 50 erhöht (CAP ist ein positiver Regulator)
>der lac Repressor ist ein negativer Regulator -> antwortet auf Lactose Level
>solange der lac Repressor die Transkription blockiert, hat das cAMP Level wenig Einfluss
>wenn Lactose vorhanden ist, dissoziiert der Repressor vom Lac Operon ab -> solange jedoch kein CAP vorhanden ist, kann die Transkription nicht starten
291
Wie stark ist der lac Repressor?
>relativ schwach
>je ähnlicher die Sequenz der Promotor Consensus Sequenz ist, desto besser ist der Promotor -> lac Repressor hat einige Abweichungen
292
Beispiel der negativen
Regulation durch
Ligandenbindung (Trp)
>Tryptophan Repressor kann nur an die Operator DNA binden, wenn der Ligand (Trp) vorhanden ist
>wenn die Zelle nicht genug Trp hat, wird der Co-Repressor vom Repressor dissoziieren und die Biosynthese von Trp ist
angeschaltet
293
Was passiert, wenn viel/wenig
| Glucose vorhanden ist?
Viel Glucose: Wenig cAMP
Wenig Glucose: Viel cAMP -> Bindung an CAP -> Expression
Starke Induktion des lacOperons benötigt Laktose und niedrige Glukosekonzentration
294
Wann hat man also vollständige
| Expression des Lac-Operons?
>nur, wenn cAMP und
| Lactose vorhanden sind
295
RNA Polymerasen in Eukaryoten
>Pol I: nur rRNA Gene; erkennt alle möglichen Arten von
Promotoren
>Pol III: erkennt nur Promotoren upstream des Gens oder im Gen; welche Gene? -> tRNA (5S RNA)
>Pol II: mRNA; upstream Promotoren (einfache oder komplexe)
>wenn Promotoren auf dem gleichen DNA Molekül wie die Gene sind -> cis-acting-elements
296
TATA Box
>Keimstelle für das TATA Box-binding protein
(Transkriptionsfaktor)
>AT-reich, zwischen -20 und -100
>ähnlich der Pribnow Box (nur, dass die Pribnow Box bei ca -10 lokalisiert ist (TATAAT))
>die Mutation kann zu einer starken Abnahme der
Promotoraktivität führen -> die Anzahl von A und T ist nicht
entscheidend, sondern die Sequenz von A und T
>die TATA Box ist essentiell, aber nicht ausreichend für eine hohe Promotoraktivität -> zusätzliche Elemente zwischen -40 und -150
297
wodurch werden die upstream
| enhancer elements erkannt?
>von den specific transcription factors
298
specific transcription factors
>haben eine Bindedomäne und eine Aktivierungsdomäne
>die Aktivierungsdomäne ist sauer und reich an Prolin und
Glutamin (->sehr flexibel; schwer zu kristallisieren) und
wechselwirkt entweder mit dem ''mediator'' Komplex oder direkt mit der RNA Pol II
299
CAAT Box
>GGNCAATCT Consensus bei -75 (analog zu der -35 Box in
| Prokaryoten)
300
GC-Box
>bei manchen konstitutiven ''housekeeping-Enzymen'' kann die TATA Box durch eine GC Box ersetzt werden
>G-reiche Box mit GC im Zentrum
301
Wo befinden sich CAAT und GC Box normalerweise?
>auf dem gleichen Strang wie das Gen -> cis-acting-elements
302
Wo befindet sich die TATA Box normalerweise?
>auf dem Template
303
Vergleich der Transkriptionsfaktoren: Pro- und Eukaryoten
>CAAT und GC Box können auch auf dem Template Strang sein während die -35 Region (TTGACA) in Prokarytoen auf dem codierenden Strang sein muss!
>In Prokaryoten sind die -10 und-35 Sequenzen Bindestellen für die RNA Polymerase durch den sigma-Faktor; in Eukaryoten erfolgt die Erkennung durch Transkriptionsfaktoren, nicht durch die RNA Pol II selbst
304
Was übernimmt die Aufgabe des sigma Faktors in Eukaryoten?
>Eukaryoten haben keine Komponente, die auf dem DNA Template rumläuft und nach Promotorsequenzen sucht >TATA box binding protein und TFIID-Komplex (Transkriptionsfaktor IID) -> sorgen für die korrekte Positionerung bei der Ablesung
305
Wofür steht TFIID?
>Transkriptionsfaktor, der mit der RNA Polymerase II wechselwirkt
>700 kD Komplex
306
Woraus setzt sich TFIID zusammen?
>TAF's: TATA Box binding protein associating factors >haben eine ähnliche Strukur wie Histone (lange Helices, zwei Windungen am Ende und zwei kurze Helices) -> einfache Struktur, die oligomerisiert
307
Strukturbestimmung durch Hydrid-Technologie
>Cryo-Eletronenmikroskope + Röntgen-Kristallographie
308
1. Schritt der Transkription
>Erkennung der TATA Box durch das TATA Box Bindung Protein (30 kD) > bindet mit 1 nM (10^5 mal stärker an die TATA Box als an eine andere DNA Sequenz)
309
Struktur des TATA TBP
| Komplexes
>interne Symmetrie
>Sattelstruktur; mit Steigbügeln
>großes, 10-strängiges, antiparalleles beta-
Faltblatt
>zwei alpha-Helices auf der Oberseite des Sattels
310
wo bindet die DNADoppelhelix?
>unter dem Sattel -> Interaktion mit dem beta-Faltblatt; DNA wird stark um 110° gekrümmt -> 2 Knicks
(die alpha Helices sind hier nicht
involviert!)
311
wie wird diese hohe Spezifizität
| erreicht?
>große Abweichung der B-DNA
>der minor groove wird stark modifiziert
>zwei Paare Phenylalanin-Reste interkalieren zwischen den Basenpaaren 1 und 2 und den Basenpaaren 7 und 8 -> Knicks
>im Zentrum der Symmetrie -> Asparagin Reste
>Protein und DNA wechselwirken nur durch hydrophobe WW (sehr, sehr wenige direkte WSBB)
312
Wie kann man diese starke
| Biegung ermöglichen?
>hydrophobe WW zwischen Valinresten -> kollidieren mit der exocyclischen Aminogruppe in der 2-Position von Guanin (kein GC -Basenpaar kann an die TATA Box binden (aus sterischen Gründen) -> Ablehnung von GC)
-> nicht nur Bevorzugung von ATBasenpaarung,
sondern auch sogar Ablehnung von GC-Basenpaaren
>AT reiche Sequenzen kann man leicht verformen
-> Veformbarkeit ist wichtig!
>zusätzlich diese wenigen WSBB im
Zentrum, was eine Biegung erleichtert
313
nachdem TFIID an die TATA Box
| gebunden hat?
>binden TFIIA und TFIIB an TBP
| > dann TFIIF, E und H (-> entwindet DNA in Eukaryoten)
314
wo binden TFIIA und TFIIB am
| TBP?
```
>binden in der Peripherie (an den ''Steigbügeln'')
(>TFIIB bindet auf der andere Seite)
>man hat also letztendliche eine
Struktur, die aussieht wie eine
Kurbel durch TPB-Bindung
```
315
Der Einfluss von 5-
Methylcytosin auf die
Transkription
>reguliert durch Histonmodifikation
>Cytosin-Methylierung im Promotor unterdrückt die
Transkription -> unterdrückt den Zugang von
Transkriptionsfaktoren (manche methylierungsunabhängigen Transkriptionsfaktoren können trotzdem binden)
>Cytosin-Methylierung innerhalb der Sequenz hat kaum einen Effekt
>Cytosin-Methylierung und Histonmodifikation als zusätzliche Transkriptionsfaktoren
316
spezifische
| Transkriptionsfaktoren
>Zinc-Finger-Transkriptionsfaktoren -> binden an die upstream Enhancer Elemente
>haben Aktivierungsdomäne und DNA-Bindungsdomäne
317
Aminosäure-Sequenzen des
Proteins Zif268 eines Maus-
Embryos
>konservierte Reste könnten Liganden für Zink-Ionen sein
| -> Histidin hat eine hohe Affinität zu Zink-Ionen
318
CCHH Zink-Finger
>ca. 30 Aminosäurereste
>Linker zwischen Cys und dem ersten His: 12 Reste
>beta-Hairpin (Reste 1-10)
>alpha Helix (Reste 12-24) -> bindet am major groove
>fast perfekte B-DNA
>3 Zink-Finger in einer helikalen Anordnung
>spezifische Erkennung von 3 bp pro Finger
>beta-Faltblatt-Strang 2 wechselwirkt unspezifisch mit dem DNARückgrat
>die Aktivierungsdomäne wechselwirkt mit der RNA Pol II und aktiviert diese
319
Wechselwirkung des zweiten Fingers des Zif268 mit der DNA
>Arg46 bildet 2 WSBB mit G an dem GC bp 7
>His 49 bildet 2 WSBB mit G an dem GC bp 6
>His53, Arg42, Ser45: unspezifische Wechselwirkungen mit bp 4,5,6 -> spezifische Erkennung von Guanin durch Arginin und von Adenin durch Glutamin
320
CCCC Zink Fingers (4 Cysteine)
>kommen in Nuclear Receptors vor (auch kleine Rolle im Cytosol)
>viele der Liganden sind Steroide (Testosteron und Östrogen)
321
Testosteron und Östrogen Vergleich
>in Testo: Methylgruppe zwischen den beiden Ringen A und B; Ring A hat eine Doppelbindung und eine Ketofunktion
>in Östrogen: A Ring ist ein Aromat mit OH-Gruppe; Methylgruppe fehlt
322
mögliche Liganden für Nuclear Receptors
>Androstendion (2 Ketogruppen)
>Dianabol (Anti-Baby-Pille) -> wechselwirkt mit dem Östrogen-Rezeptor
>Retinsäure (auch in der Retina)
>Thyroxine (Schilddrüse)
323
Liganden der Nuclear Receptors
>hydrophob -> können spontan durch die Membran diffundieren
| >Medikamenten-Synthese; Drug Design!
324
Eigenschaften der Nuclear Receptors
>haben alle eine DNA-Bindedomäne -> streng konserviert >Ligandenbindedomäne -> relativ variabel
>N-terminale Aktivatordomäne variiert erheblich
>Bindung erfolgt sequenzspezifisch an hormone responsive elements (RE's) auf der DNA
>DNA-Bindedomänen enthalten 2 Zink-Ionen
325
Glucocorticoid Rezeptor
>Zn1 am Start des N-Terminus; stabilisiert die Erkennungshelix und bindet an den major groove
>Zn2 stabilisiert den Loop -> sorgt für Dimerisierung
-> man hat dann also zwei konsekutive major grooves, die von einem Dimer aus zwei alpha Helices bestehen (-> 4 Zn-Ionen)
> das GRE (glucocorticoidresponsive element) ist
ein Palindrom; die Hälfte dieser wird durch drei
Nucleotide getrennt
326
3D Struktur des Glucocorticoid
| Rezeptors
>die beiden Fingerdomänen bilden eine globuläre Domäne
>die Helices winden sich gegeneinander
>WW im major groove: Lysine
und Arginine WW mit Wassermolekülen
327
Ligandenbindungsstelle des
| Östrogen Rezeptors
>in der Ligandenbindungsdomäne gibt es eine C-terminale Helix
>wenn Östrogen an die Helix bindet, verändert diese ihre
Orientierung und verschließt die Bindungsstelle
>wichtig: obwohl Östrogen gebunden ist, verändert sich dadurch
nicht die Affinität gegenüber des Östrogen responsive elements auf der DNA
>man braucht einen Coaktivator, der dazu führt, dass die DNABindedomäne stark an das hormone responsive element bindet
328
Coaktivatoren von Nuclear
| Hormon Rezeptoren
>haben alle den gleichen Mechanismus
>sind selbst Transkriptionsfaktoren
>binden selbst an die DNA an das responsive element
durch eine Helix - Loop - Helix - Domäne
>Protein-Protein-Interaction-Domain (PAS)
>NcoA1: Nuklearer Hormonrezeptor: drei Wiederholungen vom Typ LXXLL -> zentrale Domäne
-> diese Wiederholungen binden an die Helix 12
>Helix 12 enthält auch viele Leucine -> relativ hydrophob
>eine der repeat Helices bindet dort und der Komplex wird so ''eng'' dass die DNA-Bindedomäne stark an das responsive element auf der DNA binden kann
>SRC: Steroid-Rezeprot-Coactivator 1
>GRIP1: Glukokortikoidrezeptor-interagierendes Protein 1
329
Tamoxifin + Raloxifen
>ahmt die steroide Struktur nach
>konkurrieren um den Östrogen Rezeptor (Antagonisten)
>sind größer als Östrogen -> Helix 12 kann nicht die Bindestelle
schließen -> Co-Aktivator kann nicht binden (sterische Hinderung)
330
Drosophila Metarmorphose
>nach Befruchtung entwickelt sich der Embryo
>nach ein paar Tagen sieht man Segmente
>die Entwicklung des Embryos wird von Proteinen geregelt, die
unter der Kontrolle von Transkriptionsfaktoren stehen
331
3D Struktur der Antennapedia
| Homodomände
>Helices 2 und 3 bilden ein Helix - Turn - Helix Motiv (ähnlich der
von prokarytotischen Repressoren -> lamba Repressor)
>Erkennungshelix ist hier jedoch viel länger
>die Orientierung von Helix 1
der Homodomäne ist anders als
die im lambda-Repressor
332
wie erreichen die
| Homodomänen Spezifizität?
>Zusammenarbeit mit einem anderen Transkriptionsfaktor
>Mat-alpha 2 bildet ein Heterodimer mit Mat-alpha 2 durch ein C-terminales Segment
>die Erkennungshelices beider Monomore binden an eine 21-bp Ziel-Sequenz in der DNA
-> 60° Biegung der DNA -> Spezifizität steigt über Protein-Protein-WW !
333
Zippers
>ebenfalls spezifische eukaryotische Transkriptionsfaktoren
>jeden 7. Rest ein Leucin
>Leucin-Zippers - führen zur Dimerisierung von alpha Helices
>Spiral-Struktur positioniert die Leucine an Positionen, wo die alpha-helices wechselwirken können (Pos. D, A; in Pos. E oder F findet man geladene SK aus Salzbrücken, die die Helices zusammenhalten)
334
Wieviele AS-Reste pro Windung
| in alpha-Helices?
>3,6
335
AS-Reste pro Windung im
| Leucin Zipper?
>Leucin Zipper (coiled coiled) 3,5 AS-Reste pro Windung
>man erreicht, dass jeder 7. Leucin Rest übereinander steht
>mind. 4 Leucine durch 6 AS getrennt
336
Helix - Loop - Helix
| Transkriptionsfaktoren (HLH)
>basische, spezifische Transkriptionsfaktoren
>kein Turn, sondern Loop !
>HLH Motiv dimerisiert
337
Hybrid-Transkriptionsfaktoren
>aus Leucin Zipper und basischem HLH-Motiv
338
4-Helix-Bündel
>ebenfalls Motiv zur Dimerisierung
339
b/HLH/Zip
basisch - H1 - loop - H2 - Zipper
340
genetischer Code
>Francis Crick, Syndey Brenner, G. Khorana, Marshall Nirenberg,
Heinrich Matthäi, et al (1961/62)
>3 Nukleotide codieren für eine Amiosäure: Triplett Code
>nicht überlappend
>man braucht ein Start-Codon
>degeneriert
>nur Met und Trp werden durch ein einziges Codon codiert
>für Leu, Ar und Ser gibt es jeweils 6 Codons -> korreliert mit der
Frequenz in Poteinen (kommen am häufigsten vor)
>die meisten Synonyme unterscheiden sich nur in der letzten
Base des Triplets
>XYC und XYU codieren immer für die gleiche Aminosäure
>XYA und XYG codieren meistens für die gleiche Aminosäure
>es gibt es 3 STOP-Codone: UAA, UAG, UGA
>AUG codiert für internes Methionin und ist das Startsignal
>universell? hauptsächlich ja, aber es gibt Ausnahmen:
Mitochondrien, Protozoen, Archea
>man kann annehmen, dass Trp und Met erst spät in der
Evolution entstanden sind
341
Nirenberg-Matthäi Experiment
>Inkubation von synthetischem Poly-Uridin in 20 verschiedenen
Reaktionsgläsern mit Extrakten aus E. coli Zellen, GTP, ATP und
einer Mischung von den 20 Aminosäuren
>in jedem Reagenzglas wurde eine andere Aminosäure radioaktiv
markiert
>das einzige Polypeptid, das gebildet wurde, ist das, wo Phe
radioaktiv markiert wurde -> daraus konnte man schließen, dass
UUU das Triplet für Phenylalanin sein musste
>poly-C führte zu Poly-Prolin und Poly-A führte zu Poly-Lysin
342
Warum hat das Experiment
| nicht mit Poly-G funktioniert?
>Bildung von Guanosin-Tetraplexen
343
fMet-tRNA
>erkennt das Start-Codon AUG
| >in Bakterien beginnt die Polypeptidkette mit fMet
344
t-RNA
>dient als Adaptermolekül, das an ein spezifisches Codon bindet
und die entsprechende Aminosäure zum Einbau in die
Polypeptidkette mitbringt
345
Alanyl-tRNA aus Hefe
>erste Nucleinsäure, die sequenziert wurde
>einzelne Kette aus 76 Nucleotiden
>das 5'-Ende ist phosphoryliert (pG)
>am 3'-Ende befindet sich eine freie OH-Gruppe -> dient als
Aminosäureanheftungsstelle
>die Sequenz 5'-IGC in der Mitte des Moleküls ist das Anticodon
(komplementär zu GCC -> Codon für Alanin)
346
Eigenschaften aller tRNAs
>einzelne Kette, die zwischen 73 und 93 Ribonucleotiden enthält
>ca. 7-15 ungewöhnliche Basen je Molekül -> verleihen teilweise hydrophoben Charakter für WW mit Synthetasen und ribosomalen Poteinen
>hat die Form eines L
>ca. die Hälfte der Nucleotide
ist über Basenpaarung zu Doppelhelices verbunden (AForm der RNA ähnlich)
>Region am 3'CCA-Ende (Akzeptorstamm)
>TψC-Schleife (Ribothymin -
Pseudouracil - Cytosin)
>Extraarm -> enthält variable
Zahl von Resten
>DHU-Schleife -> mehrere
Dihydroxyuracilbausteine
>Anticodonschleife
>5'.Ende ist phosphoryliert (endständiges Nucleotid i.d.R. pG)
>aktivierte AS wird an eine OH Gruppe des Adenosinrestes
angeheftet, der sich am Ende der 3'-CCA Sequenz befindet
347
Modifikationen von Basen
>am wichtigsten: Pseudouridin (sieht aus wie Uridin, aber die Verbindung zur Ribose wird nicht über N1, sondern über C5 gemacht -> verschiedene chemische Bindung)
348
Wobble-Hypothese
>Paarung der dritten Base des Codons hat bestimmte Freiheit
>die erste Base des Anticodons entscheidet, ob ein bestimmtes tRNA Molekül ein, zwei oder drei Codons erkennt: C oder A (ein Codon), U oder G (zwei Codons), oder I (drei Codons) -> I paart mit C, U und A
>dass der genetische Code degeneriert ist, ergibt sich also zum Teil aus der Ungenauigkeit in der Paarung mit der dritten Base des Codons mit der ersten Base des Anticodons
>Inosin schafft die Möglichkeit, dass ein bestimmtes tRNA Molekül die maximale Zahl von Codons erkennen kann >die Inosinbasen entstehen nach der Synthese des Primärtranskripts durch Desaminierung von Adenosin
349
Warum wird die Wobble-Basenpaarung nicht in der ersten und zweiten Base des Codons zugelassen?
>WW der tRNA mit den Ribosomen
>Ribosomen sind große RNA-Protein-Komplexe, die aus einer 30 S und einer 50 S Untereinheit bestehen
> die 30 S UE enthält die 16 S RNA, in der sich drei generell konservierte Basen (Adenin 1492 - Adenin 1493 - Guanin 530) befinden, die auf der Seite der kleinen Furche WSBB mit dem Komplex aus Codon und Anticodon ausbilden
>mittels dieser WW wird überprüft, ob an den ersten beiden Positionen des Codon-Anticodon-Doppelstranges WC-Bp vorhanden sind
>nicht vorhanden für die dritte Position des Codons >Mechanismus ähnelt den WW an der kleinen Furche, die bei der DNA-Pol zu einem ähnlichen Zweck genutzt werden
>das Ribosom ist also an der Decodierung der WW zwischen Codon und Anticodon aktiv beteiligt
350
Aminoacyl-tRNA-Synthetase
>bevor das Anticodon auf das Codon trifft, muss die Aminosäure mit einem spezifischen tRNA Molekül verknüpft werden
>die Ausbildung einer Peptidbindung zwischen freien AS ist thermodynamsich ungünstig -> AS muss aktiviert werden
>die aktivierten Zwischenprodukte sind Aminosäureester, bei denen die Carboxylgruppe einer AS mit der 2'- oder 3'- OH Gruppe der Ribose am 3'-Ende der tRNA verknüpft ist >eine solche AS der tRNA bezeichnet man als Aminoacyl-tRNA oder beladene tRNA
>für jede Aminosäure gibt es eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase und mind. eine tRNA
351
Aktivierung von Aminosäuren
>die Aktivierungsreaktion wird durch spezifische Aminoacyl-tRNA-Synthetasen katalysiert (daher auch: Aktivierungsenzyme
>der erste Schritt ist die Bildung eines Aminoacyladenylats aus einer AS und ATP: AS + ATP -> Aminoacyl-AMP + PPi >dieses aktivierte Molekül ist ein gemischtes Anhydrid in dem die Carboxylgruppe der AS mit der Phoshorylgruppe des AMP gekoppelt ist (daher auch Aminoacyl-AMP)
>der nächste Schritt besteht aus der Übertragung der Aminoacylgruppe von Aminoacyl-AMP auf ein bestimmtes tRNA Molekül, sodass Aminoacyl-tRNA entsteht: Aminoacyl-AMP + tRNA -> Aminoacyl-tRNA + AMP Gesamtreaktion: AS + ATP + tRNA - > Aminoacyl-tRNA + AMP + PPi
>die freie Aktivierungsenthalpie liegt nahe 0, da die Hydrolyse der Esterbindung in der Aminoacyl-tRNA einen ähnlichen Wert hat wie die Hydrolyse des ATP zu AMP und PPi
>Reaktion wird durch Hydrolyse von PPi angetrieben in der Summe sind die drei Reaktionen sehr exergonisch: AS + ATP + tRNA + H2O -> AminoacyltRNA + AMP + 2 Pi
>bei der Synthese jedes Moleküls Aminoacyl-tRNA wird also das Äquivalent von zwei ATP-Molekülen verbraucht: eines davon dient der Bildung der Esterbindung in der Aminoacyl-tRNA, das andere treibt die Reaktion voran
>die Aktivierung und die Übertragung einer bestimmten AS werden also von derselben Aminoacyl-tRNA-Synthetase katalysiert
>tatsächlich löst sich dabei das Zwischenprodukt nicht von der Synthetase, sondern bleibt über nichtkovalente WW an das aktive Zentrum des Enzyms gebunden
>entweder Angriff des 2'OH des Adenins oder des 3'OH -> Transesterfikation (mehr 3'-Produkte)
> nur 3'-Produkte werden für Proteinbiosynthese verwendet
352
Spezifität der Threonyl-tRNA-Synthetase
>Threonin ähnelt insb. den AS Valin und Serin (-> Valin hat Methyl- statt OH-Gruppe; Serin fehlt Methylgruppe)
>an das Enzym ist über zwei Histidine und ein Cystein ein Zinkion gebunden
>das Threonin geht über seine Aminogruppe und die OH Gruppe in seine SK koordinative Bindungen mit dem Zinkion ein
>die OH Gruppe in der SK wird außerdem von einem Aspartatrest erkannt, der sich über WSBB mit ihr verbindet >die Methylgruppe, die im Valin anstelle der OH Gruppe steht, ist nicht zu diesen WW fähig und wird daher vom akitven Zentrum ferngehalten
353
Korrekturlesen der Aminoacyl-tRNA-Synthetase
>man kann die Threonyl-tRNA-Synthetase mit einer tRNA inkubieren, die kovalent mit Serin veknüpft wurde (Ser-tRNAThr) -> tRNA wurde also falsch beladen
>die Reaktion setzt sofort ein: durch schnelle Hydrolyse der Aminoacyl-tRNA entstehen Serin und die freie tRNA findet die Inkubation hingegen mit der richtigen tRNA statt (Thr-tRNAThr), bleibt die Reaktion aus -> hat also Korrekturlesestelle
>diese befindet sich 2 nm von der Aktivierungsschleife entfernt
>die meisten Aminoacyl-tRNA-Synthetasen enthalten neben der Aktivierungs- auch eine Korrekturlesestelle >diese paarweise angeordneten aktiven Zentren ergänzen einander und wirken als doppelter Filter, der eine sehr hohe Translationsgenauigkeit bewirkt
>idR nimmt die Acylierungsstelle keine AS auf, die größer als die richtige sind, weil für sie nicht genügend Platz ist >die Hydrolysestelle hingegen spaltet aktivierte AS ab, die kleiner als der korrekte Baustein sind
>das aminoacylierte CCA kann sich aus der Aktivierungsschleife heraus und in die Korrekturstelle hinein klappen -> die Aminoacyl-tRNA kann also verändert werden, ohne dass sie sich von der Synthetase lösen muss >diese Korrekturlesefunktion ist analog zu der entprechenden Aktivität der DNA-Polymerase
(editing without dissociating)
354
Wie erkennt die Threonyl-tRNA-Synthetase ihre tRNA?
>manche Synthetasen erkennen ihre tRNA Partner vorwiegend anhand des Anticodons, häufig aber auch an anderen Strukturmerkmalen
>der CCA Arm der tRNA ragt in das zinkhaltige Aktivierungszentrum, wo er sich an der richtigen Position befindet, um das Threonin vom Threonyladenylat zu übernehmen
>dabei tritt das Enzym nicht nur in großem Umfang mit dem Akzeptorstamm der tRNA in Verbindung sondern auch mit der Anticodonschleife
355
Zwei Klassen der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen
>Klasse I und Klasse II -> jede davon umfasst Enzyme, die für 10 der 20 AS spezifisch sind
>die beiden Synthetasen binden an untersch. Seiten des tRNA-Moleküls
>der CCA-Arm der tRNA nimmt im Rahmen dieser WW untersch. Konformationen an: bei den Enzymen der Klasse II befindet er sich in der Helixkonformation, die man auch in freier tRNA beobachtet; bei denen der Klasse I liegt er in einer Haarnadelkonformation vor
356
4 Unterschiede der beiden tRNA-Synthetasen Typen
1) Enzyme der Klasse I acylieren in der tRNA die 2'-OH Gruppe des endständigen Adenosins, die der Klasse II dagegen (Ausnahme: Phe-tRNA) acylieren die 3'-OH Gruppe
2) die Enzyme der beiden Klassen binden ATP in untersch. Konformationen
3) Die meisten Enzyme der Klasse I sind Monomere, bei den Enzymen der Klasse II handelt es sich in den meisten Fällen um Dimere
4) Klasse I bindet an tRNA in der kleinen Furche der Akzeptorstammhelix. Klasse II bindet tRNA in großer Furche der Akzeptorstammhelix
357
Warum sind in der Evolution zwei untersch. Klassen von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen entstanden?
>möglicherweise sind zwei Erkennungsstellen auf beiden Seiten der tRNA notwendig, damit die 20 untersch. tRNAs zuverlässig erkannt werden können
358
Ribosom
>man kann ein prokaryotisches Ribosom in eine 50 S UE und eine 30 S UE zerlegen
>die 30 S UE enthält 21 versch. Proteine (S1-S21) und ein RNA-Molekül von 16 S
>in der großen UE befinden sich 34 versch. Proteine (L1-L34) und zwei RNA-Moleküle, eines von 23 S und eines von 5 S
>ein Ribosom enthält ein Exemplar jedes RNA-Moleküls, jeweils zwei Moleküle der Proteine L7 und L12 sowie jeweils ein Molekül der anderen Proteine
>das Protein L7 ist mit L12 identisch, nur mit dem Unterschied, dass sein Aminoende acetyliert ist
>nur ein einziges Protein kommt in beiden Untereinheiten vor: S20 ist identisch mit L26
359
ribosomale RNAs
| 5 S-, 16 S-, 23 S rRNA
>für Aufbau und Funktion des Ribosoms von entscheidender Bedeutung
>die RNAs entstehen durch Spaltung und weitere Prozessierung eines Primärtranskripts mit 30 S
>diese Moleküle falten sich und bilden bestimmte Strukturen, die die Ausbildung von internen Basenpaaren ermöglichen
>rRNAs sind bei allen Spezies zu einer definierten Struktur mit vielen kurzen Doppelstrangabschnitten gefaltet
360
tRNA Bindungsstellen
>bilden Brücken zwischen 30 S und 50 S Untereinheiten >in jedem Ribosom sind die drei tRNA Bindungsstellen so angeordnet, dass die AS, die von den Codons auf der mRNA codiert werden durch Peptidbindung verknüpft werden können
>der mRNA-Abschnitt, der gerade translatiert wird, ist an die 30 S Untereinheit gebunden
>jedes Molekül ist sowohl an die 30 S UE, als auch an die 50 S UE gebunden
>an dem Ende, das mit der 30 S UE verbunden ist, sind zwei der drei tRNA Moleküle über Basenpaare zwischen Codon und Anticodon an die mRNA gebunden -> A-Stelle (Aminoacyl) und P-Stelle (Peptidyl)
>das dritte t-RNA Molekül befindet sich an einer benachbarten, als E-Stelle bezeichneten Bindungsstelle >an ihrem anderen Ende (dort, wo sich das Anticodon nicht befindet) treten die tRNA Moleküle mit der 50 S UE in WW
>die Akzeptorstämme der tRNA Moleküle, welche die A- und P-Stelle besetzen, nähern sich an der Stelle, wo die Peptidbindung gebildet wird, einander an
>ein Tunnel verbindet diese Stelle mit der Rückseite des Ribosoms -> durch diesen Tunnel läuft die wachsende Polypeptidkette während der Synthese hindurch
361
Findet die Proteinsynthese vom N- zum C-Terminus statt oder umgekehrt?
>hat Reticulozyten (reife rote Blutzellen) mit Leucin versetzt und zu versch. Zeitpunkten mit Trypsin geschnitten
>das Ausmaß des radioaktiven Labelings steigt in Richtung des C-Terminus ->Synthese erfolgt am N-Terminus
362
Initiation der Translation
>viele mRNA Moleküle sind polycystronisch/polygen >meistens handelt es sich bei dem Startcodon um Methionin -> AUG, weniger häufig GUG (Valin) und selten UUG (Leucin)
363
Shine-Dalgarno-Sequenz
>purinreiche Sequenz, deren Mittelpunkt sich rund 10 Nucleotide entfernt auf der 5'-Seite des Initiationscodons befindet
>bilder bp mit der 16S-rRNA -> dadurch erkennt fMet das Startsignal
>16S rRNA enthält die Sequenz CCUCC am 3'-Ende -> komplementär zur Shine Dalgarno Sequenz
>Mutation von CCUCC zu ACACA wechselwirkt mit der Erkennung der Initiationsstelle auf der mRNA
364
Initiator tRNA
>transportiert N-Formylmethionin (fMet) zum Ribosom und initiiert damit die Proteinsynthese
>bei ca. der Hälfte der E coli Zellen wird das N-Formylmethionin entfernt, wenn die entstehende Molekülkette etwa 10 Aminosäuren lang ist
>für die Verknüpfung des Methionins mit den zwei versch. tRNAs ist dieselbe Aminoacyl-tRNA-Synthetase verantwortlich
>anschließend formyliert ein besonderes Enzym die Aminogruppe des Methionins, das an die tRNAf angeheftet ist
>als aktivierter Donor der Formylgruppe dient dabei N-Formyltetrahydrofolat, ein Folatderivat, das aktivierte C1-Einheiten trägt
>freies Methionin und Methionyl-tRNA sind für diese Tranformylase keine Substrate!
365
Transformylase
>nimmt die Formylgruppe von Formyltetrahydrofolat und bringt sie an die freie Aminogruppe des Methionins, nachdem das Methionin an der Initiator-tRNA angeheftet wurde
366
Warum nur an der Initiator-tRNA?
>minimaler Unterschied der beiden RNA-Strukturen
>in normaler tRNA: bp zwischen Base 1 (A) und Base 72 (C) >in Initiator fMet-tRNA (f) : keine Basenpaarung zwischen C1 und A72 -> das Enzym Transformylase bekommt Zugang -> nur sterische Faktoren
367
Initiationsfaktoren
>zunächst bildet die ribosomale 30S-UE einen Komplex mit IF1 und IF3 -> Bindung dieser Faktoren an die 30S UE verhindert, dass diese sich vorzeitig mit der 50S UE zu einem 70S Komplex ohne mRNA und fMET-tRNAf verbindet, der eine Sackgasse darstellen würde
>IF1 bindet in der Nähe der A-Stelle und lenkt die fMet-tRNAf an die P-Stelle
>IF2, der zur Familie der G-Proteine gehört, bindet GTP, und aufgrund der damit einhergehenden Konformationsänderung kann sich IF2 mit der fMet-tRNAf verbinden
>der Komplex aus IF2, GTP und Initiator tRNA lagert sich mit der mRNA (die durch WW zwischen ihrer Shine-Dalgarno-Sequenz und der 16S-rRNA in die richtige Position gebracht wurde) und der 30S UE zum 70S-Initiatinskomplex zusammen
>Veränderungen der Struktur führen dazu, dass IF1 und IF3 den Komplex verlassen
>IF2 stimuliert die Assoziation der 50S UE mit dem Komplex
>das an IF2 gebundene GTP wird hydrolisiert, was zur Freisetzung von IF2 führt -> das Ergebnis ist ein 70S Initiationskomplex (Bildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Proteinsynthese)
>sobald sich der 70S-Initiatonskomplex gebildet hat, ist das Ribosom bereit für die Elongationsphase der Proteinsynthese
>die P-Stelle des Ribosoms ist jetzt mit der fMet-tRNAf besetzt; die beiden anderen für tRNA-Moleküle vorgesehene Stellen A und E sind noch frei
>die Wechselwirkunglegt das Lesenraster für die Translation der gesamten mRNA fest
368
Struktur von IF-1 und IF-3
>ellenbogenähnliche Struktur, die an tRNA erinnert >molecular mimicry
369
Initiation in Eukaryoten
>EIF (eukaryotic initiation factor)
>5'-CAP bindet an den Initiationskomplex und bilden einen großen Komplex
>das Poly-A Binding Protein (3'-Poly-A tail) bindet am 3'-Ende
>bringen die mRNA in eine zirkuläre Anordnung
