biochimica clinica 1 acidi nucleici Flashcards

Question

elettroforesi del DNA | come incide la conformazione del DNA sulla migrazione

Answer 1

- superavvolta -> più veloce perché più compatta - circolare -> più lenta perché più ingambrante - lineare -> a metà la presenza di bromuro di etidio riduce la velocità di migrazione del 15%

Answer 2

si usa il gel extraction kit -> QIAquick usa lo stesso principio del protocollo di purificazione della PCR si utilizza per DNA da 70bp a 10kb processa fino a 400mg di agarosio

Answer 3

enzima in grado di riconoscere specifiche sequenze di basi lungo il filamento di DNA e tagliare esattamente in corrispondenza di queste con essi è possibile tagliare il genoma umano in frammenti più piccoli e maneggiabili (frammenti di restrizione) o ritagliare un certo gene o modificarlo

Answer 4

deve essere tagliato tra i siti: | HindIII e SalI

Answer 5

la DNA ligasi può riparare o unire due frammenti di DNA ligating blunt ends --> scarsa efficienza ligating sticky ends --> molto più efficiente la più utilizzata è quella del batteriofago T4, ATP dipendente per la sua attività serve ATP un gruppo fosfato al 5' e un OH al 3'

Answer 6

avviene in 3 fasi: 1- ligasi reagisce con atp 2- ligasi-atp reagisce con il P al 5' 3- il gruppo OH reagisce con 5' P e determina formazione di un nuovo legame fosfo diesterico

Answer 7

temperatura e tempo di reazione concentrazione totale del DNA concentrazione dell'inserto e del vettore La fosfatasi alcalina ottimizza la reazione di ligazione perché evita la ricircolazione del vettore

Answer 8

per ottimizzare l'unione si utilizzano linkers adattatori produzione di sticky ends con una coda omopolimerica

Answer 9

ottenere molreplici copie della molecola di DNA di partenza 4 fasi: 1- LIGASI la sequenza di DNA inserita in vettore 2- TRASFORMAZIONE il vettore inserito in una cellula 3- SELEZIONE le cellule così trasformate devono essere riconosciute 4- CRESCITA COLONIE queste cellule vengono amplificate

Answer 10

il vettore deve essere tagliato e le estremità del DNA di interesse devono legarsi a quelle del vettore richiudendolo

Answer 11

il DNA di interesse e il vettore devono essere tagliati da uno stesso enzima di restrizione e vengono poi legati con l'enzima ligasi

Answer 12

nei procarioti sono essenziali per degradare filamenti estranei di DNA ogni enzima di restrizione riconosce una sequenza particolare sul DNA e sono di 4,6 o 8 nucleotidi ...spesso palindromi. ci sono TRE classi di enzimi di restrizione: quelli di classe I e III sono attivi nella stessa molecola quelli di classe II sono attivi su più molecole e più precisi hanno attività di restrizione e metilazione

Answer 13

``` possono tagliare: - estremità piatte (blunt) es SmaI - estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protruding) es EcoRI - estremità coesive sporgenti al 3' es PstI ```

Answer 14

enzima che forma legami fosfodiesterici tra estremità 3'-OH e 5'-P di molecole di DNA adiacenti richiede ATP come substrato Le estremità coesive facilitano il compito, tra 4 e 37 gradi da 1h a 24h Le estremità blunt hanno bisogno di basse temperature e elevata concentrazione dell'enzima

Answer 15

quella codificata dal batteriofago T4 ottenuta da cellule di E. coli

Answer 16

in molti casi il vettore ricircolarizza senza inserimento del DNA di interesse

Answer 17

per ovviare al problema della ricircolarizzazione si usa la fosfatasi alcalina che rimuove il gruppo Fosfato (P) dall'estremità 5' il vettore defosforilato non può essere ligato...quindi si può usare anche una concentrazione più alta di vettore - il vettore può essere ancora ligato usando il P dell'inserto

Answer 18

- se si usano estremità nette si possono ligare qualsiasi parte con estremità nette...problema ritagliare l'inserto perché gli enzimi non riconoscono il punto di inserzione -> meno efficiente - se si usano estremità coesive identiche lo stesso enzima di restrizione che le ha tagliate può liberare l'inserto clonato -> molto efficiente....ma non si può sapere l'orintamento - estremità coesive differenti....si usano due enzimi diversi per il taglio e riusandoli con il plasmide si riottiene l'inserto...si conosce l'orientamento, le estremità coesive sono facili da legare e il vettore così tagliato non circolarizza

Answer 19

``` si usano molteplici vettori in base alla dimensione dell'inserto: plasmidi fagi cosmidi bac yac ```

Answer 20

molecole circolare ed extracromosomiali di DNA in grado di replicarsi senza essere integrati nel genoma batterico. contengono: ORI sequenza di origine della replicazione dell'E. coli MCS (multi cloning site) sequenza con raggruppate sequenze riconosciute da diversi enzimi di restrizione...di solito ingegnerizzata e compresa tra un promotore e un terminatore DNA esogeno (inserto) MARCATORE SELEZIONABILE una sequenza codificante per un gene che conferisce un vantaggio selettivo (es resistenza agli antibiotici)

Answer 21

più sono di dimensioni ridotte più sono maneggevoli: più resistenti, più facile estrali, più efficiente la trasformazione, più è veloce a rinaturizzarsi

Answer 22

si intende l'inserimento del DNA esogeno in cellule batteriche (l'inserimento di DNA eterologo in cellule eucariote si dice TRASFEZIONE) e avviene con un metodo elettrico (elettroporazione) o un metodo chimico (trattamento con cloruro di calcio)

Answer 23

si possono produrre tre tipi di batteri: vuoti contenenti solo il vettore contenti i batteri con vettore con inserto - per selezionare quelli con i vettori si usa come marcatore selezionabile un gene di resistenza a un antibiotico...tutti i batteri resistenti a quell'antibiotico hanno il vettore DIFFICILE capire quali quelli con inserto (si usa ad esempio alfa complementazione)

Answer 24

si usano vettori pUC che permettono con il promotore del lattosio di attivare il gene lacZ e di rendere un batterio in grado di attivare una beta galattosidasi e di reagire con un substrato e produrre un colore blu se il vettore ha l'inserto, questo si inserisce nel gene che attiva la beta galattosidasi e non la rende attivabile e quindi le colonie con inserto rimangono bianche se inserto piccolo possono esserci falsi e al contrario basta una piccola delezione per falsificare anche il risultato di un vettore vuoto

Answer 25

per denaturazione i plasmidi si rinaturano più velocemente e per centrifugazione si separano oppure fatta per ultracentrifugazione in gradiente

Answer 26

tecnica di clonaggio in vitro permette di produrre grandi quantità di specifici frammenti di DNA ... permette di studiare e purificare qualsiasi sequenza di DNA o mRNA può amplificare un tratto di DNA per più di un milione di copie

Answer 27

1- DNA stampo 2- DNA polimerasi termostabile (95gradi) 3- i 4 desossinucleotidi trifosfati (dNTPs) 4- un buffer contenente Mg, è un cofattore della polimerasi e ne potenzia la processività 5- due oligonucleotidi (primer)

Answer 28

ogni ciclo consiste di tre fasi: 1- denaturazione ...il DNA stampo viene denaturato (90-95 gradi) 2- appaiamento ...i primer si appaiano con il DNA stampo 3- sintesi 72 gradi è la temperatura ottimale per funzionamento della Taq polimerasi

Answer 29

- concentrazione di Mg - scelta dell'enzima - progettazione dei primers ...tra 20 e 30 nucleotidi mai meno di 16, con GC tra 45 e 50%, non contenere sequenze complementari, ripetute o invertite per evitare strutture a forcina - quantità e qualità dello stampo - paramtri dei cicli - controllo di crosscontaminazioni con altri acidi nucleici

Answer 30

1- scegliere la strategia (stampo DNA o RNA) 2- dimensioni della regione da amplificare 3- usare programmi per progettare i primers 4- verificare la validità biologica dei primers con BLASTN ( è un software che permette di allineare la sequenza con quelle nei database di sequenze nucleotidiche 5- verificare la sequenza attraverso sequenziamento

Answer 31

- sensibilità e rapidità - analisi simultanea di molti campione - analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione - analisi del DNA degradato o incluso in mezzi strani o fissato

Answer 32

- rischio di contaminazioni...falsi positivi - efficienza variabile di amplificazione a seconda della sequenza - richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare (per i primers) - può sintetizzare frammenti corti - la sintesi è imprecisa e può introdurre errori

Answer 33

``` per rilevare uno specifico mRNA con retrotrascrizione: 1- estrazione RNA 2- purificazione mRNA, o usare primers 3- sintesi di cDNA con trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente) ```

Answer 34

1 estrazione e purificazione RNA 1microgrammo 2 la trascrittasi del virus della leucemia di topo (MMLV) 3 primer 4 incubare per un'ora a una data temperatura

Answer 35

- tipizzazione di marcatori genetici - screening mutazionale - identificazione di mutazioni puntiformi - identificazione di nuovi geni - studi di espressione genica - mutagenesi in vitro

Answer 36

permette di analizzare in tempo reale la reazione e di ottenere dati quantitativi...valutare il numero delle copie di stampo può essere relativa o assoluta

Answer 37

su DNA PCR | su mRNA RT-PCR

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