Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) Flashcards
(37 cards)
Quelles sont les 2 caractéristiques d’une cellule souche ?
→ différenciation
→ auto-renouvellement
Les cellules stromales mésenchymateuses sont-elles des cellules souches ?
Expérience sur modèle murin:
→ Cellules de moelle osseuse de souris avec aspect fibroblastique transplantées à d’autre souris donnaient naissances à du tissu osseux, fibreux et NON hématopoïétique ⇒ cellules dans la moelle capables de se différencier et donner des cellules tissulaires.
Donc propriété de multipotence des cellules : capacité de se différencier dans différents types cellulaires au sein d’un même lignage, d’un même tissu.
- Ces cellules sont les cellules stromales mésenchymateuses (appelée d’abord “cellules souches mésenchymateuses” terme à ne plus employer actuellement car leur caractère souche n’est pas démontré, et elles ne sont pas capable a priori de s’auto-renouveler)
Critères pour caractériser une CSM ? (4)
- Adhérence au plastique (ce qui n’est pas le cas des cellules hématopoïétique par exemple)
- Formation de CFU-F
- Phénotype particulier
- Multipotence: différenciation À MINIMA en ostéoblastes, en adipocytes et en chondrocytes
Comment déterminer la CFU-F ?
- Ensemencement sur plaque avec concentration très peu dense de cellules, incubation à 37°C dans milieu nutritif + facteurs de croissance => colonies avec aspect fibroblastique, on peut les observer et les compter. Cela permet de mesurer leur caractère prolifératif et clonogénique , grosso modo plus il y a de cellules en quantité importante, et plus il y a de cellules par colonie, plus elles sont capables de proliférer rapidement
Comment caractériser leur phénotype ?
Quels sont les 3 CD ?
Puis caractérisation des CSM par cytométrie de flux:
- CD (cluster de différenciation): ces cellules, à leur surface,
expriment 3 principaux marqueurs CD90, CD73 et CD105
- et on vérifie l’ABSENCE de marqueur d’autres populations cellulaires = CD45 (marqueur leucocytaire), CD34 (progéniteur hématopoïétique, cellule endothéliale), CD14 ou CD11b (monocytes et macrophages), CD19 ou CD79⍺, HLA-DR (en l’absence d’INFγ)
Comment démontrer leur caractère multipotente ?
En culture, selon milieu de culture, jusqu’à confluence, dans un milieu de culture spécifique, en 2 à 3 semaines, différenciation en ostéoblaste, chondrocytes ou adipocytes. Vérification après grâce à différentes coloration histochimique, expression des protéines etc…
Quels rôles des CSM dans la MO ?(2)
Ou retrouve-t-on également les CSM ? quel rôle ?
Rôles dans MO :
→ 1. Rôle de support de l’hématopoïèse: Elles vont être capable de sécréter un certain nbr de facteurs de croissance, facteurs soluble, ligands pour un certain nombre de récepteur et d’envoyer des signaux au CSH pour réguler son auto-renouvellement ou lui envoyer des signaux pour la mener vers une voie de différenciation.
→ 2. Différenciation en ostéoblaste et participer à la régulation de la masse osseuse.
On sait maintenant que les CSM sont présentes dans la matrice extracellulaire (MEC) et en périvasculaire (rôle de soutien du vaisseaux). Ces cellules, grâce à leur capacité de sécréter un certain nombre de molécules ont un rôle dans l’homéostasie tissulaire, maintien, régénération => rôle le plus utilisé en clinique.
Quelle propriété des CSM permet de les utiliser en voie IV ?
→ CSM capable de migrer vers tissus lésé/ischémié pour pouvoir réparer et régénérer le tissus au niveau de la lésion.
→ Migration de CSM: capables d’adhérer aux cellules endothéliales et de traverser la barrière endothéliale, puis de sécreter des molécules qui vont digérer la MEC.
→ Elles expriment aussi un récepteur au SDCF1, molécules sécrétées au niveau des lésions tissulaires.
Cette capacité de migration permet donc de l’administrer en IV, puis que les CSM rejoindront les tissus lésés.
Quels sont les 2 mécanismes d’action de la CSM sur le tissu lésé ?
RÉPARATION et RÉGÉNÉRATION tissulaire
Qu’est ce que la réparation tissulaire ?
1) Réparation: capacité de différenciation pour réparation du cartilage et des os notamment. Soit on utilise les cellules tel quel, qui se différencieront in vivo au niveau de la lésion, soit différenciation réalisée in vitro en labo pour les orienter et transplanter avec un matériel au niveau de la lésion.
* ⇒ Premières données sur l’animal en 2000 (équipe bichat) => Fracture brebis avec 3 groupes: A: contrôle, B: biomatériel seul, C: biomatériel + CSM. Réparation osseuse + efficace +++ avec CSM.*
Qu’est ce que la capacité de régénération ?
2) Régénération: plus complexe et plus multifactorielle = capacité paracrine des CSM, sécrétion de facteurs qui modifient le microenvironnement et envoie de signaux aux cellules résidentes => régénération tissus. Les CSM peuvent jouer sur tous les types de cellules avec cette fonction paracrine (les cellules du système immunitaire, les cellules du tissus …). Cette capacité paracrine est la capacité principale des CSM et c’ets ce qu’on utilise le plus à des fins thérapeutiques
⇒ Usine à produire des molécules, facteurs de croissance : facteurs pro-angiogéniques, anti-apoptotiques, anti-fibrotiques, immunomodulateurs, support et différenciation CSH, chémoattraction.
Exemple de régénération tissulaire :
⇒ chez le rat avec ischémie cérébral, CSM capable de s’introduire dans le tissus => facteurs neurotrophiques
⇒ Plug matrigel = boule de matrice extra-cellulaire qu’on insère sur le dos de la souris et au bout de 14 jours se vascularise, puis après on l’excise et on regarde sur des coupe la vascularisation (permet de voir capacité angiogénique des CSM)
Exemple expériences sur le sécrétome : plus ou moins efficace que cellules ?
→ Utilisation du sécrétome (aussi appelé surnageant/milieu conditionné): Mise en culture des CSM, on récupère le bain de culture et on administre ce milieu conditionné = sécrétome. Et on évite ainsi d’injecter ces cellules (même si très bien tolérées par les patients après 20 ans de recul).
=> effets assez disparates. certains modèles avec effets meilleurs ou similaires aux cellules, dans d’autres études, milieu conditionné moins d’effet que cellules seules = Effet paracrine des cellules seulement et non pas l’effet des cellules en elle même qui ont rôle en elle même au delà de leurs sécrétions.
Quelle capacité paracrine peut être intéressante pour remplacer les cellules vivantes ?
→ Leurs capacités paracrines comprend aussi la sécrétion de microvésicules
Microvésicule = bicouche lipidique avec à sa surface un peu la même chose que la cellules (des récepteurs, des protéines; des ligand etc…) et en plus à l’intérieur des facteurs, (microRNA, enzymes, cytokines etc…). Ces vésicules sont vraiment des messagères/signaux pour la cellule receveuse qui vont les capter (proliférer/se différencier/diminuer l’inflammation etc….)
- Exemple:*
- → Pouvoir angiogénique des microvésicules: Matrigel in vivo et in vitro sur laquelle on ensemence des CSM => au bout de qq heures elles forment des pseudotubes qui forment un réseau vasculaire. => Meilleure vascularisation, plus beau réseau lorsqu’on ajoute dans ce plug des microvésicules de CSM.*
- *Avantage exosome: ne pas administrer cellules et d’un point de vue pharmacologique c’est avantageux car pour injecter des cellules à un patient, les cellules doivent être vivantes:**
- cela nécessite une préparation en temps réel, ce qui est très difficile d’un point de vue logistique
- ou un stockage = cellules congelées à décongeler juste avant k’adminsitration avec tous les problèmes liés au stockage.
Alors que l’exosome/milieu conditionné sont faciles à conserver à des T° standard, notamment lyophilisé.
Quelle molécules importante sécrétée par CSM ?
Une des molécules très importantes = IDO = indoleamine-2,3 dioxygénase.
Rôle des CSM dans l’immunomodulation => inhibition de la prolifération des Lymphocytes T (LT) , inhibition de la prolifération et cytotoxicité des cellules NK, inhiber la différenciation des monocytes en cellules dendritiques et augmentation la prolifération des LT régulateurs (Treg).
=> diminution inflammation
Qu’est ce que le priming des CSM ?
Intérêt dans le traitement ?
→ Les CSM ont un phénotype 1 et 2 (à l’image des macrophages M1 et M2) en fonction de leur statut pro vs anti-inflammatoire/immunomodulateur.
Les CSM à l’état basal n’ont pas de propriétés immunomodulatrices, il faut qu’elles soient stimulées par un milieu inflammatoire pour pouvoir déclencher leur pouvoir immunomodulateur = PRIMING.
⇒ In vitro possible de primer les CSM (INF gamma et TNFalpha et IL1). On peut imaginer les primer in vitro avant de les administrer chez le patient pour augmenter l’effet immunomodulateur, pour traiter par exemple des maladie auto-immune. Un patient répondra mieux sûrement si déjà dans un état inflammatoire au moment de l’injection => à prendre en compte pour le timing du traitement
Données précliniques : quels éléments peuvent expliquer la variabilités des résultats ? (3)
- Dépend tissus origine des CSM (moelle, cordon, tissus adipeux),
- du donneur ( âge par exemple)
- et lignées primaires “fraîches” vs décongélation
Exemple fonction conditions de culture :
Capacité de ces cellules à se différencier en ostéoblaste=
→ Rouge ARS qui marque calcium pour ostéoblaste
→ Rouge (huile rouge) qui marque gouttelette lipidique pour adipocytes.
Culture en Hypoxie VS normoxie => hypoxie augmente capacité de différenciation ostéoblastes;
Exemple fonction du tissu d’origine :
Moelle osseuse(BM), sang de cordon (CB), placenta (P), tissus adipeux (A). Les CSM provenant de tissus adipeux se différencie mieux en adipocytes que les CSM de placenta ou de moelle osseuse etc… En fonction de l’indication thérpaeutique, bien choisir le tissus d’origine
Exemple en fonction des donneurs de CSM :
Variabilité en fonction des donneurs: on stimule à l’interféron γ les CSM qui produisent alors IDO ce qui provoque l’inhibition de la prolifération des LT.
La production d’ IDO est variable selon les donneurs (abscisse expression IDO, ordonné LT prolifération) : plus on produit d’IDO, plus la prolifération des LT est inhibée. Donc choisir donneur qui exprime en grande quantité IDO
Enjeu actuel: sélectionner au préalable les meilleurs donneurs pour avoir CSM le plus efficace (IDO seul outil pour l’instant).
Quelle différence entre cellues fraîches et décongelées ?
CSM décongelées moins immunomodulatrices et moins métaboliquement actives.
Cellules après décongélation expriment moins d’IDO que les cellules fraîches donc moins capable d’inhiber la prolifération de LT
Quelles sont les étapes de production des CSM ?
Prélèvement du tissu de départ :
- choix donneur
- Chois source cellules
- Modalité de prélèvement et recueil des cellules
Manipulatino des CSM
- Isolement
- Expansion
- Transformation
- Conservation
- Contrôle qualité
- Libération
Adiministration des CSM :
- Préparation du produit
- Administration du produit
- Mesure de l’efficacité
- Registre
Avantages et inconvénients donneurs autologues vs allogénique ?
→ autologue:
- avantages: bonne tolérance,
- inconvénients: approvisionnement limité et fonctionnalités biologiques potentiellement impactées, vérifier que CSM non atteinte dans la pathologie du patient par exemple dans LED ou sclérodermie où CSM moins immunomodulatrices et entrent rapidement en sénescence.
→ allogénique: (solution préférée actuellement)
- avantages: disponibilité en grande quantité, possibilité de standardisation
- inconvénients: risque de réactions immunitaire, mais risque très théorique car absence d’expression du CMH à la surface + effet immunomodulateur intrinsèque des CSM → actuellement lors du monitoring des patients on recherche des anticorps formés lors de la première administration (la plupart des patients ne produisent pas d’anticorps). Les CSM sont administrées depuis 20 ans sans immunosuppression ni recherche de compatibilité HLA (ne l’exprime pas ou très faiblement)
Autres paramètres à prendre en compte pour le donneur ?
Autres paramètres à prendre en compte pour le donneur:
- âge du donneur => perte fréquente des capacités CFU-F, prolifération et multipotentialité avec l’âge
- IMC=> tissus adipeux du donneur obèse ou ex-obèse de moindre qualité en terme de viabilité cellulaire et fonctionnalité
- Qualification: absence d’ATCD personnel, absence d’infection en cours
