Chapitre 5 - Microscopie à fluorescence

Question 1

Qu’est-ce qu’un microscope à fluorescence?

Answer 1

Un microscope photonique équipé de 2 lampes: 1 lampe ordinaire (observation par transmission) et 1 lampe à arc (fluorescence)

Question 2

Qu’est-ce qui permet de choisir la longueur d’onde incidente?

Answer 2

Des filtres d’excitation

Question 3

Qu’est-ce qui permet de sélectionner les radiations émises par l’objet excité?

Answer 3

Des filtres d’émission

Question 4

Qui suis-je: émission de la lumière suite à l’excitation d’une molécule à l’aide de lumière UV ou visible?

Answer 4

Photoluminescence

Question 5

Quelles sont les deux grandes catégories de photoluminescence?

Answer 5

Fluorescence et phosphorescence

Question 6

Qui suis-je: la propriété d’une molécule à réémettre de la lumière dans toutes les directions lorsqu’excitée mais qui cesse dès que l’excitation est arrêté?

Answer 6

Fluorescence

Question 7

Si une molécule réémet de la lumière lorsqu’elle est excitée mais continue toujours d’émettre de la lumière lorsque l’excitation est cessée, de quoi s’agit-il?

Answer 7

La phosphorescence

Question 8

Une molécule qui possède la propriété d’absorber de l’énergie lumineuse et le la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente est appelée _____.

Answer 8

Fluorochrome

Question 9

Qu’est ce que la lumière d’excitation?

Answer 9

Radiations UV ou bleues utilisées pour l’excitation

Question 10

Quelles sont les trois types de lampes excitatrices?

Answer 10

Lampes à haute pression de vapeur de mercure, lampes QTH et lasers

Question 11

La lumière _____ est TOUJOURS de plus grande longueur d’onde que la lumière _____ ce qui permet son observation dans la portion visible du spectre.

Answer 11

D’émission, d’excitation

Question 12

De quoi est constitué un jeu de filtre (cube) et à quoi sert chaque partie?

Answer 12

Filtre d’excitation - permet de sélectionner la longueur d’onde adéquate pour le fluorochrome utilisé
Miroir dichroïque - réfléchir sélectivement certaines longueurs d’ondes
Filtre d’émission - ne laisse passer que les longueurs d’ondes émises par le fluorochrome

Question 13

Quelles sont les trois étapes du processus de fluorescence?

Answer 13

1. Excitation
2. Durée de vie de l’état excité
3. Émission de fluorescence

Question 14

Qui suis-je: un photo possédant une énergie (hvex) est fourni par une source externe, l’énergie de ce photon est absorbée par un fluorochrome créant un état électronique singulet (S1’).

Answer 14

Excitation

Question 15

À cette étape (1 à 10ns), le fluorochrome subit des changements conformationnels ayant 2 conséquences: l’énergie S1’ est partiellement dissipées (état plus relaxe S1) et pas toutes les molécules initialement excitées retournent à l’état initial.

Answer 15

Durée de vie de l’état excité

Question 16

À l’étape _____, un photon d’énergie h vem est émis permettant au fluorochrome de retourner à son état initial (S0).

Answer 16

Émission de fluorescence

Question 17

Vrai ou faux: puisqu’une certaine portion de l’énergie initiale est dissipée pendant la période de durée de vie de l’état excité, le photon émis possède moins d’énergie que le photon d’excitation donc est d’une longueur d’onde plus petite.

Answer 17

Faux, elle est d’une longueur d’onde plus GRANDE (loi de Stokes)

Question 18

Règle générale, on choisira un fluorochrome dont le déplacement de Stokes est d’au moins _____nm.

Answer 18

35

Question 19

Quelles sont les 6 caractéristiques des fluorochromes?

Answer 19

1. Longueur d’onde
2. Coefficient d’extinction molaire
3. Rendement quantique
4. Durée de vie de l’état excité
5. Photoblanchissement
6. Déplacement de Stokes

Question 20

Qu’est-ce que le coefficient d’extinction molaire (ε)?

Answer 20

Il relie la quantité de lumière absorbée, pour une longueur d’onde donnée, à la concentration du fluorophore en solutions (1/M x cm)

Question 21

Qu’est-ce que le rendement quantique (Φ)?

Answer 21

Efficacité relative de la fluorescence comparée aux autres voies de désexcitation (=nombre de photons émis/nombre de photons absorbés)

Question 22

Si je multiplie le coefficient d’extinction molaire par le rendement quantique, qu’est-ce que j’obtiens (ε x Φ = ___) ? À quoi ça me sert?

Answer 22

La brillance (intensité de fluorescence), permet de choisir les fluorochromes les plus intéressants

Question 23

Qui suis-je: lorsque la molécule est à l’état excité, il est possible qu’elle participe à des réactions chimiques (particulièrement avec l’oxygène sous forme de radicaux libres) et perd sa propriété de fluorescence.

Answer 23

Photoblanchiment

Question 24

Qu’est-ce que le déplacement de Stokes?

Answer 24

La différence entre la longueur d’onde d’excitation et la longueur d’onde d’émission d’un fluorochrome

Question 25

Vrai ou faux: plus le déplacement de Stokes est grand, plus facile ce sera de trouver les filtres permettant de bien séparer la lumière d'émission de la lumière d'excitation

Answer 25

Vrai, un déplacement de 50nm est idéal (>35nm)

Question 26

``` Un bon fluorochrome doit posséder 6 choses: 1. 2. 3. 4. 5. 6. ```

Answer 26

1. Coefficient d'extinction molaire élevé (+ absorbant) 2. Rendement quantique le plus près possible de 1 3. Spectre d'émission dans le visible 4. Déplacement de Stokes >35nm (50nm idéal) 5. Faible vitesse de décomposition 6. Stabilité des propriétés de fluorescence une fois couplé à une molécule non fluorescente (protéine)

Question 27

Si le fluorochrome de réémet pas de la fluorescence, comment est-ce que l'énergie est dissipée?

Answer 27

Chaleur, autres radiations

Question 28

Quelles sont les deux types d'objets en fluorescence?

Answer 28

1. Ceux qui émettent fluorescence par eux mêmes (autofluorescence) 2. Ceux qui doivent être combinés à une substance fluorescente (fluorescence secondaire)

Question 29

Vrai ou faux: certaines molécules (capables de fluorescer) possèdent la propriété de se lier spécifiquement à des molécules d'importance biologique.

Answer 29

Vrai, exemple le colorant DAPI - ADN

Question 30

Quand on ne possède pas de molécules autofluorescentes capables de fixer une molécule cible, on peut produire un _____ capable de reconnaitre spécifiquement cette molécule et le coupler chimiquement au _____.

Answer 30

Anticorps, fluorochrome

Question 31

Vrai ou faux: avec les méthodes de biologie moléculaire disponibles, on peut maintenant fusionner le gène d'une petite protéine autofluorescente in vitro avec n'importe quelle protéine du génome de l'hôte qu'on veut étudier.

Answer 31

Vrai, cela nous permet d'étudier de quelle façon la protéine d'intérêt se comporte

Question 32

Des _____ couplées à un fluorochrome permettent maintenant de marquer spécifiquement certaines régions du génome des microorganismes et de permettre leur reconnaissance par microscopie à fluorescence.

Answer 32

Sondes nucléotidiques

Question 33

Qu'est-ce que les boîtes quantiques?

Answer 33

Nouvelle technologie de fluorochromes sous forme de nanocristaux qui peuvent être couplés à différentes molécules biologiques (protéines et acides nucléiques)

Question 34

Quelle autre technique importante fait utilisation des techniques de fluorescence?

Answer 34

Cytométrie de flux (FACS)

Question 35

Les méthodes classiques de microscopie utilisent quelles sortes de lampes?

Answer 35

Lampes au mercure ou au Xénon

Question 36

Quel est l'inconvénient des méthodes classiques de microscopie?

Answer 36

Seulement un petit % de la lumière est utilisable. Les restes du spectre doivent être bloqués pour ne pas nuire au résultat final et les procédés employés pour faire ainsi ne sont pas efficaces à 100%.

Question 37

Des avancées récentes ont permis d'implanter des _____ à haute performance dans les microscopes à fluorescence.

Answer 37

Diodes électroluminescentes (DEL)

Question 38

Quelle est la caractéristique intéressante des DEL?

Answer 38

Elles sont disponibles dans une variété de couleurs qui correspondent aux longueurs d'onde d'excitation de la majorité des fluorochromes les plus couramment utilisés.

Question 39

Quel est le désavantage majeur de la technologie DEL?

Answer 39

Elle demande la présence dans le microscope d'une DEL par longueur d'onde d'excitation.

Question 40

Nommer 5 avantages de la lumière DEL comparée à la lampe de mercure classique.

Answer 40

1. Pas de chaleur excessive 2. Pas de centrage de lumière 3. Peu couteuse à long terme 4. Intensité contrôlable électroniquement 5. Compact (Voir tableau 5.1 page 92 pour autres avantages)

Question 41

Quelles sont les 2 différences physiques les plus évidentes entre le microscope DEL et le microscope è épifluorescence typique?

Answer 41

1. Pas d'oculaire (caméra) | 2. Aucune pièce mobile

Question 42

Combien de sources de lumière d'excitation y a-t-il dans le microscope DEL? Quelles sont-elles?

Answer 42

3 sources 1. DEL à 405nm 2. DEL à 488nm 3. DEL à 590nm

Question 43

Dans un microscope à fluorescence classique, pourquoi est-ce que la lumière perd sa brillance?

Answer 43

Il contient 26 surfaces de verre donc seulement 36% de la lumière originale se rend à la fin du trajet optique.

Question 44

Le microscope Etaluma ne comprend que _____ surfaces de verre, donc _____% de la lumière se rend à la caméra.

Answer 44

6, 82%