clase 15 Flashcards
que es clonacion
Proceso por el que se obtienen copias idénticas de un organismo, célula o molécula ya desarrollado.
que es PCR
Amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA, o indirecta de un RNA (DNAc), presentes en mezclas de muy diversas fuentes, sin necesidad de una purificación previa de la muestra original.
Cual es el objetivo basico de la PCR
Aplicaciones de la PCR
Clonación acelular de fragmentos de ADN.
•Detección de secuencias sin purificación previa.
•Secuenciación de ácidos nucleicos.
•Establecer polimorfismos de secuencia.
•Rastreo de mutaciones.
•Tipado de DNA para transplantes.
•Dx de enfermedades genéticas, prenatales.
•Determinación de secuencias específicas de DNA relacionadas con situaciones patológicas definidas.
•Resolución de problemas forenses y arqueológicos.
•Detección de microorganismo infecciosos.
•Detección de células tumorales.
cual es el principio de la PCR
- Desnaturalización del DNA para dar hebras sencillas.
- Hibridación específica de la hebra sencilla con un oligonucléotido. Denomina como etapa de templado.
- Replicación de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir del oligonucleótido anterior como cebador: también, elongación o extensión del cebador, o polimerización.
cual es el contenido de la mezcla de reaccion
- Cuatro dNTPs en exceso como substratos para la síntesis de las innumerables copias de DNA, para ser reconocidos por la polimerasa, deben ir acompañados de Mg+2
- Dos oligonucleótidos de cadena sencilla (18 a 30 nt). Secuencias complementarias, respectivamente, a los dos extremos 3´ de la región diana uno en cada hebra.
- DNA polimerasa termoestable (temperaturas altas 75 °C a 95°C). Esta características permite su actuación en diversos ciclos sin inactivarse. La replicación a temperaturas impide la formación de híbridos parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso.
- La enzimas mas empleada es la polimerasa Taq, por proceder de la bacteria Thermus aquaticus.
Cada ciclo de una PCR consta de 3 etapas cuales son
- Desnaturalización: calentamiento para la separación de las dos hebras del DNA, mediante una incubación breve (30-120 s) a una temperatura entre 68 y 97°C, que debe ser superior a la de fusión de la región de DNA que se quiere amplificar.
- Templado (o hibridación): Enfriamiento rápido por debajo del punto de fusión de forma que se permite la hibridación de las hebras sencillas del DNA de interés con los oligos cebadores. Gralmente emplea temperatura de 37 a 65°C que se mantienen entre 10 y 120 s.
