CM 5 Purification Et Extraction Flashcards
(20 cards)
De quoi dépend la solubilité des protéines?
De la concentration en sel
Du PH
Comment est séparé le précipité de la fraction soluble ?
Par centrifugation
Qu’est ce que le pHi ou Pi ?
Le pHi d’une protéine est le pH pour lequel la charge globale de cette molécule est nulle ou, le pH pour lequel la molécule est électriquement neutre ( forme zwitterion )
Qu’utilise t-on pour extraire les protéines?
Pour isoler les protéines en fonction de leur propriété biochimique diverse, masse et identité ?
Pour Analyser des protéines
- broyage des cellules / lyse des cellules
- centrifugation / précipitation
- chromatographie , électrophorèse, immunoprecipitation
-cristallographie , spectrométrie de masse , Western Blot
Quelle est la méthode de chromatographie la plus utilisée ?
Chromatographie sur colonne
Selon quoi est séparé les molécules ?
Quelles protéines seront elués en premier ?
Selon leur taille , leur forme -rayon de Stokes
Les protéines les plus petites seront diffuser à l’intérieur des billes en excluant les plus grandes qui seront élués en premier
Quel est l’autre nom de chromatographie d’interactions hydrophobe ?
Chromatographie d’adsorption
Comment fonctionne la chromatographie d’adsorption ?
Séparation des protéines en fonction de leur hydrophobie de surface
L’adsorption étant renforcé par des concentrations salines élevés , l’élution se fait par des gradients décroissants de sel en conditions natives .
Exemple de chromatographie d’interactions hydrophobes (ou d’adsorption ) ?
Cytochrome C
RNAse A
Lysozyme
Alpha-chymotrypsin
Principe de chromatographie d’affinité?
Sépare les protéines en fonction d’une intéraction réversible entre une protéine (ou un groupe de protéines ) et un ligand spécifique fixé sur une matrice
Caracteristiques de Chromatographie en phase inverse ?
Matrice en silice sur laquelle des chaînes alkyles à 8 ou 18 atomes de carbone ont été greffés au niveau des groupes silanol ( Si-OH )
Cette phase est dite inverse car la phase stationnaire est hydrophobe et apolaire
Les protéines dénaturés et les chaînes latérales non polaires seront exposées au solvant (ce qui n’est pas le cas pour les protéines natives )
Les protéines vont alors établir des intéractions hydrophobes avec les groupements non polaire de la phase stationnaire
Les protéines sont élués par une phase mobile contenant une force [c] de solvant organique (acétonitrile) qui va diminuer la phase aqueuse mobile
Cette technique de chromatographie en phase inverse est largement utilisée en HLPC ( Chromatographie liquide à haute performance)
Les électrophorèse les + utilisés :
Électrophorèse en gel de polyacrylamide
-séparation selon la charge , taille verticale ou horizontale
-réticulation modifiable
-utilisation d’agents dénaturant (urée ou SDS,analyse de structure)
Électrophorèse en gel d’Agarose
-Grande porosité : molécule haute masse moléculaire et complexe supramoléculaire
- essentiellement utilisée pour les acides nucléiques
Coloration des protéines lors de l’electrophorèse ?
Bleu de Coomassie ou Nitrate d’Argent
De quoi dépend le réseau de maille d’un gel ?
De la concentration en acrylamide et bisacrylamide
Conditions électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) ,comportement des protéines?
Les protéines sont chargé et peuvent se mouvoir dans un champs électrique
Caracteristiques des colorations de protéines
Bleu de Coomassie
Se lié aux protéines via les acides basiques ( principalement l’arginine) et aux aromatiques
Nitrate d’argent
Méthode extrêmement sensible est la coloration à l’argent (limite de détection 10 nG )
Principe de la dialyse ?
Utilisation d’une membrane perméable aux molécules et aux ions et imperméable aux macromolécules
Permet de modifier la composition ionique de la solution contenant l’extrait protéique .
Pas de réduction de volume
Basé sur le principe osmotique
Utiliser pour changer ou changer de milieu
Principe de l’ultrafiltration ?
Rétention des macromolécules sur membrane de porosité sélective
Réduction du volume de l’échantillon
Processus de séparation est utilisé pour purifier/ concentrer des solutions de macromolécules (10 puissance 3 ou 6 Da )
Ultrafiltration ~= nanofiltration = ~microfiltration
Un peu près si ce n’est qu’elle retient des molécules de tailles différentes de ces 2 dernières
Seuil de coupure (0,001 et 0,1 micromètre)
Def de sélection négatif ?
Sélection contre les individus possédant un certain caractère
Def de sélection positif ?
Méthode par laquelle les cellules portant un insert d’ADN intégrer à une position chromosomique spécifique peuvent être sélectionnés puisque cette intégration confère un phénotype prévisible
