Cours 4.1 : Électrophorèse Flashcards
(37 cards)
Qu’est ce que l’électrophorèse
La migration d’un ion dans un champ électrique,
=>est utilisée
dans les séparations analytiques des molécules biologiques
Pour qu’une molécule puisse migrer dans un champ électrique, il faut quoi
F électrique > F friction
selon les lois de l’électrostatique, la force électrique, Félectrique, sur un ion avec une charge q dans un champ électrique d’intensité, E, est:
F électrique = q x E
la migration électrophorétique de l’ion à travers la solution est opposée par
une quoi ( expliquer la formule et les éléments de celle-ci )
Force de friction
Ffriction = vf
où v représente la vitesse de migration et f son coefficient de frictio
Le coefficient de friction nous donne quoi + il dépend de quoi
une mesure de la résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration
=>dépend de la taille
- de la forme de l’ion,
- de la viscosité de la solution
La mobilité électrophorique caractérise quoi ( donne l’équation de celle-ci )
Vitesse de chaque ion
mobilité électrophorétique, µ, définie par : µ = v / E = q / f
L’équation de mobilité électrophorétique indique quoi
cette équation indique que les protéines à leur point isoélectrique (où q=0)
possèdent une mobilité électrophorétique nulle
Quelle est la méthode d’électrophorèse la plus couramment utilisée ( explique cette méthode )
l’électrophorèse
en zones
- technique dans laquelle l’échantillon est contraint à se déplacer dans
une phase solide, comme le papier filtre, la cellulose, ou d’un gel
L’électrophorèse en zone permet quoi AVANTAGE
1) on élimine largement l’agitation provoquée par la convection, un facteur
limitant du point de vue résolution.
2) en plus, cette technique requiert une quantité faible de matériel permettant
ainsi la migration des composantes en bandes discrètes.
Qu’est ce que l’électrophorèse sur gel ( comparaison avec d’autres méthode + la séparation moléculaire est basée sur quoi )
- constitue la technique parmi les plus puissantes et les plus faciles à utiliser dans la
séparation des macromolécules - la séparation moléculaire est basée non seulement
sur la mobilité électrophorètique des molécules, mais aussi sur le principe de filtration sur gel
Quels sont les gels commun d’usage
l’agarose et le polyacrylamide, possèdent des pores de
la taille des protéines à séparer
Expliquer le mode d’action des gels d’électrophorèse , c’est dû à quoi ( ca donne quoi )
- les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille plus grande,
(ce qui est l’inverse de la filtration par gel). - ceci est dû au fait que dans la filtration par gel, il y a des espaces pour le
solvant entre les billes de gel, ce qui n’existe pas dans l’électrophorèse sur gel
=> la migration des molécules larges est retardée par rapport aux molécules plus petites
Comment sont fabriqués les gel pour l’électrophorèse en gel de polyacrylamide
Les gels sont fabriqués à partir d’une polymérisation radicalaire d’acrylamide
et N,N’-méthylènebisacrylamide dans un tampon
Électrophorèse en gel de polyacrylamide est aussi appelé comment
PAGE
Est ce que les gels de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide se forme spontanément
Non => besoin d’un catalysateur ( sulfate )
Expliqué les étapes de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide
1) avant que le mélange réactionnel n’ait
durci, il est coulé dans un récipient formé
par deux plaques de verres et polymérisera
en une couche mince de gel de quelques
millimètres
2) les échantillons sont déposés dans des
puits préformés au sommet du gel
3) le tampon est le même dans les
réservoirs du haut et du bas (pH ~9 pour
que toutes les protéines aient une charge
négative)
4) un courant continu de 100 à 200 volts
parcourt le gel pendant la durée de la
migration
=> les protéines migreront vers l’anode (+)
selon leur ratio charge/masse
=> diapo 6
Expliquer dans le gel polyacrylamide l’impact de la longueur du gel
plus le gel est long,
meilleure est la finesse des bandes et la
résolution
=> permet de séparer les protéines plus finement
Pourquoi utiliser l’électrophorèse en pH discontinu
afin d’augmenter la résolution et donc restreindre les protéines dans des bandes
plus minces,
Le gel peut être modifié en utilisant deux gels dans des tampons différent, Quels sont les gels
A- un gel de séparation (running gel), préparé comme le gel précédent
B- un gel de concentration (stacking gel), qui surmonte le gel de séparation et qui est
de plus haute porosité
Expliquer les différent tampon présent dans les réservoir ( Électrophorèse en pH discontinu)
- le tampon dans le réservoir du bas et celui du gel de séparation sont identiques
- le tampon du gel de concentration possède un pH ~ 2 unités de moins.
- le pH du tampon dans le réservoir supérieur doit contenir un acide faible (typiquement de la glycine,
pKa = 9.78) et son pH est ajusté près de celui du réservoir inférieur
Expliquer l’activité dans le gel ( concentration )supérieur du réservoir (Électrophorèse en pH discontinu)
- pH 6.8: la Glycine est de charge neutre
- augmente la résistance au courant électrique
- selon la loi de Ohm (E = IR), une résistance R plus élevée, à
avec un courant I constant résulte en une augmentation du champ
électrique E - ↑ de la vitesse de migration des protéines
Expliquer l’activité lors du passage entre les deux gels (Électrophorèse en pH discontinu)
- le passage d’un gel de 5% à un gel de 10% acrylamide ralenti la
migration électrophorétique à la jonction des deux gels - compaction des protéines en fines bandes
Expliquer expliquer l’activité dans le gel de séparation ( inférieur ) (Électrophorèse en pH discontinu)
- pH 8.8: la Glycine devient chargée négativement
- la résistance électrique R diminue
- diminution du champ électrique E
- ↓ de la vitesse de migration des protéines
- séparation des protéines en fonction du ratio
charge/masse
Quand les protéines entrent dans le gel de séparation, elles sont retardées selon quoi
leurs tailles par l’effet de filtration du gel:
- petites protéines migrent plus rapidement
- grosses protéines migrent plus lentement
