Cours 7 Flashcards
Est-ce qu’il y a une origine de réplication retrouvés dans les cellules de mammifères?
Non
—> ADN introduit dans les cellules mammifères va être dilué au fil du temps avec la division cellulaire
Que fait l’inclusion de séquence d’ADN SV40 dans le vecteur avec la protéine LT
Augmente la durée de vie de l’ADN plasmide que dans les cellules eukaryotes et augmente l’expression des protéines
Promoteur pour les plasmides dans les cellules mammifères
Promoteur CMV
—> constitutivement actif
Pourquoi ajouter une queue poly A ?
Stabiliser l’ARNm pour qu’il puisse faire la traduction en protéines
La transfection (eucaryote) et la transformation (procaryote) incluent les méthodes de transfert d’un vecteur
Réactifs chimiques ou électroporation
Transfection qui ne dure que quelques jours et où l’ADN est progressivement dilué
Transitoire
Transfection qui utilise un antibiotique de sélection où les cellules qui n’intègrent pas le gène meurent (faible efficacité)
Stable
Définition de l’efficacité de la transfection
pourcentage de cellules qui ont absorbé l’ADN
Techniques de transfection
- Phosphate de calcium : formation d’un précipité qui adhère par endocytose
- Utilisation de polycation,
polyethyleneimide(PEI) : ajout d’hydrophobicité pour passer la membrane - Agents cationiques lipidiques : encapsulation de l’ADN, plus l’ADN dans le noyau
- Électroporation : pulsations électriques qui créent des trous dans la membranes
Méthode qui combine des réactifs chimiques et des pulsions électriques qui fonctionne même avec les cellules qui ne se divisent pas
Nucléofection
Méthode pour observer l’efficacité de la transfection
Observation de la localisation intracellulaire
de la pyruvate kinase fusionnée à la GFP (protéine fluorescente verte)
Méthode qui utilise une cellule d’emballage qui fabrique le rétrovirus avec l’ADN d’intérêt et où la machinerie de réplication est répartie en plusieurs plasmide pour sécurité
Lentivirus
Virus qui infecte et se réplique dans les cellule d’insecte et la méthode implique la création d’un stock de virus
Baculovirus
Utilité de Bacman
Comme baculovirus mais s’importe dans les cellules mammifères
Qu’est-ce que Cas9?
Une nucléase d’ADN programmable dont la spécificité est déterminée par la conception d’un ARN
Comment un changement dans l’ADN est obtenu avec CRISPR?
Clivage qui entraine un réparation souvent imparfaite qui inactive la protéine. Un ARN qui fera une recombinaison homologue est utilisé pour apporter un nouveau bout dans la séquence.
Méthode rapide et sensible pour caractériser les protéines purifiées ou des mélanges complexes de protéines qui Implique le transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose ou PVDF afin d’effectuer l’immunodétection des
protéines
Western Blot
Anticorps polyclonaux et monoclonaux
Ac polyclonal: reconnaît plusieurs épitopes de la protéine
Ac monoclonal: reconnaît
un épitope de la protéine
2 types d’épitopes
Linéaire ou conformationnel
Tétramère
– 2 chaînes lourdes (glycosylées)
– 2 chaînes légères
– Liées par des ponts disulfure
- Structure en Y
Anticorps
Sites de liaison spécifique
l’antigène/épitope
FAB (Fragment antigen binding)
Région effectrice dans le contexte de la fonction des anticorps lors de la réponse immunitaire
Région C-terminale (Fc)
Étapes du Western Blot
- Immobilisation des protéines sur une membrane
- Contact avec anticorps
- Détection des antigènes (par colorimétrie, chimioluminescence ou ELISA)
